供试水稻材料为纹枯病抗性品种YSBR1^[7]、感病品种Lemont^[7]和泰粳394^[8]。供试纹枯病菌系为YN-7和MH12, 由扬州大学潘学彪教授惠赠。

1.2.1 水稻种植

将YSBR1、Lemont和泰粳394的种子封装于羊皮纸袋中进行浸种发芽, 发芽第6天挑选长势基本一致的稻芽点播于育秧田中, 25 d后将生长良好的秧苗移栽大田。在水稻分蘖时期(大约移栽后30 d), 选取叶色浓绿、无病虫害、生长健壮的分蘖, 剪取完全展开的倒1叶或倒2叶, 进行纹枯菌接种。

1.2.2 纹枯菌培养

用无菌手术刀将带有纹枯菌菌丝的琼脂块切成0.4~0.5 cm小块, 接种到含0.005%四环素(wt· voL)和20 mL马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar, PDA)培养基的平板上, 封口膜封口, 倒置放在28 ℃培养箱中, 活化培养2~3 d, 培养基表面长满白色菌丝后拿出。将来自活化培养的菌块接种到新的PDA培养基, 相同条件下进行扩大培养。

1.2.3 纹枯病菌接种

剪取叶片中间4~5 cm长的部分, 平铺于含有苯并咪唑(0.000 1 g· mL^-1)的水琼脂培养基(0.005 g· mL^-1 agar)上。叶片正面紧贴培养基表面。在含纹枯菌的培养皿相同半径处, 用表面灭菌的打孔器取直径7 mm带菌丝的PDA琼脂块(图1-A), 将菌块置于离体叶片中间部位, 带菌丝的一面紧贴叶片背轴面(图1-B)。封口膜封口, 置28 ℃培养。每个含有水琼脂的培养皿作为1个接种重复, 其中, 每个水稻品种取1个离体叶片组织, 接种1个带菌琼脂块。用无菌琼脂块接种相同水稻材料, 作为对照。

1.2.4 水稻离体叶片接种后病情调查及统计

接种纹枯病菌后72 h, 利用数字扫描仪, 将同一培养皿中不同水稻品种的离体叶片同时进行扫描。利用Photoshop软件, 对扫描照片上的病斑面积进行像素换算, 计算相对病斑面积(relative lesion area, RLA), 即单位叶面积的病斑面积, 作为衡量病害严重程度的评价指标^[9]。RLA的计算公式为:RLA=病斑面积/叶片面积=病斑区域像素/叶片区域像素^[9]。通过Tukey法进行品种间病级的多重比较, 确定不同品种的纹枯病抗性。

图1

Fig.1

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	图1 利用水稻离体叶片进行抗纹枯病接种鉴定 A, 纹枯菌生长3 d的PDA培养基(左), 掏空圆形部分的菌块已切出, 供纹枯病接种(右); B, 接种纹枯病菌的水稻离体叶片Fig.1 Inoculation of the sheath blight pathogen (R. solani) to rice using detached-leaf method A, Potato dextrose agar (PDA) medium with R. solani growing for 3 d (left), PDA discs carrying R. solani were excised for inoculation (right); B, Detached rice leaves inoculated with R. solani

1.2.5 接种纹枯病菌水稻材料的取样

在接种24和48 h, 于无菌操作台中打开培养皿, 分别从YN-7菌株和无菌对照的水稻材料取样。剪取以琼脂块为中心的菌丝扩展区域(叶片径向约2 cm长), 5~6块叶组织混合, 迅速置于液氮冷冻, 然后于-80 ℃保存备用。

1.2.6 水稻RNA提取及RT-PCR鉴定

用TRIzol试剂(Invitrogen, USA)提取水稻RNA^[10]。1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量, 用NanoDrop紫外— 可见光分光光度计(NanoDrop 8000 UV-Vis Spectrophotometer)检测RNA浓度和纯度。RNA反转录采用PrimeScriptTM RT reagent Kit试剂盒(TaKaRa公司)并按说明书进行操作。以反转录的cDNA为模板, 利用水稻病程相关基因的特异引物(表1)进行实时定量RT-PCR分析。设置3次重复, 采用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ (2x)实时定量试剂盒(TaKaRa公司)的反应体系, 以EF-1α 为内参基因, 采用2^-⊿⊿Ct法进行RT-PCR数据分析。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 水稻病程相关基因的RT-PCR引物 Table 1 Primers for RT-PCR analysis of rice pathogenesis-related genes 基因名称 Gene symbol 基因号 Gene ID 引物 Primer (5’ -3’ ) 参考文献 References OsPR1b Os01g28450 F:GCGTCTTCATCACATGCAACTA R:ACCTGAAACAGAAAGAAACAGAGG [8] [11] OsPR3 Os06g51060 F:GGCGTTCTGGTTCTGGATGAC R:CGCCGTTGATGATGTTGGTC [11] PBZ1 Os12g36880 F:CAAATTCTCGTGGCGTTTGAGTC R:CGGCAGCATTCACAATGATTTTC [8] [11] E2F-related protein Os03g13050 F:ACGTCACGCACGTTCATTAGCA R:GACCGAATAAATGGCTGCTGGT [8] Pleiotropic drug resistance protein ( PDR) Os01g42370 F:TGGTGGAGATGGTACTGCTGGA R:ATGATGGCAAAGCCAAAGAGGA [8] EF-1α Os03g08020 F:CCACGGGCCATCTGATCTAC R:AGTCAATGATGAGCACGGCA [12]

表1 水稻病程相关基因的RT-PCR引物 Table 1 Primers for RT-PCR analysis of rice pathogenesis-related genes

2014年4— 10月在扬州大学进行水稻品种YSBR1、Lemont和泰粳394的大田成株期纹枯病接种试验。水稻种子于5月3~7日发芽, 5月9日播种。秧苗于6月9日移栽大田, 每个小区栽插3行, 每行12个单株。每个品种种植3次重复, 随机区组设计。在水稻分蘖末期(7月27~29日), 取小区第2行(即中间行)的10个植株, 每株取3个分蘖, 采用嵌入法^{[13, 14]}接种纹枯病菌系YN-7。在抽穗后30 d(10月9~12日), 采用Rush等^[15]提出的0~9级病情评价体系, 评定个体病级, 具体方法参照相关文献^{[8, 14]}。

采用本实验室优化的纹枯病“ 微室” 接种法^[8], 进行水稻苗期抗纹枯病接种鉴定。接种后7~9 d, 测量水稻植株病斑高度和叶枕高度, 计算单株病级, 利用DPS生物统计软件进行病级数据的方差分析。通过Tukey法进行品种间病级的多重比较。

为了检测水稻品种YSBR1、Lemont、泰粳394对纹枯病菌的抗感程度, 剪取分蘖期的水稻植株生理状态一致的叶片组织, 背面朝上紧贴在水琼脂上, 分别接种含有纹枯病菌株YN-7和MH12的PDA琼脂块, 于28 ℃恒温箱中培养。在接种第3天时观察, 不同品种的叶片出现面积大小不等的纹枯病病斑(图2-A, B)。YSBR1叶片大部分保持青绿色, 病斑面积较小; Lemont和泰粳394的叶色发黄, 病斑蔓延叶片2/3以上。

利用数字扫描仪, 对接种3 d的离体叶片进行扫描。用Photoshop软件将扫描照片上的病斑面积进行像素换算, 计算相对病斑面积(RLA), 然后对YSBR1、Lemont和泰粳394的RLA数据进行方差分析(表2)。在YN-7菌株和MH12菌株的接种试验中, YSBR1和泰粳394的RLA均呈显著差异(P < 0.05), YSBR1表现抗病, 泰粳394感病。Lemont的离体叶片材料, 用以上2个菌株进行了6次接种试验, 除了用MH12菌株接种的第3次试验, 在其他5次试验中, Lemont和YSBR1的RLA数据均表现显著差异(P< 0.05)。

图2

Fig.2

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	图2 水稻离体叶片接种纹枯病菌的病斑扫描 纹枯病菌株YN-7(A)和MH12(B)侵染水稻品种YSBR1、Lemont、泰粳394离体叶片第3天Fig.2 Digital scanning of the sheath blight lesions on detached rice leaves infected with R. solani Leaf tissues of rice cultivars YSBR1, Lemont, and Taijing 394 infected with R. solani strains YN-7 (A) and MH12 (B) for 3 days

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 纹枯菌侵染水稻离体叶片相对病斑面积的统计分析 Table 2 Statistical analysis of the relative lesion area of detached rice leaves infected with R. solani 试验/菌株 Exp./Strain 水稻品种 Cultivar 接种重复 Inoculation repeat 平均 Average 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 第1次/YN-7 YSBR1 0.10 0.12 0.17 0.07 0.07 0.06 0.07 0.01 0.01 0.01 0.069 b Lemont 0.95 0.27 0.61 0.02 0.53 0.13 0.19 0.40 0.46 0.28 0.384 a 泰粳394 0.27 0.29 0.31 0.37 0.28 0.12 0.30 0.35 0.17 0.19 0.265 a 第1次/MH12 YSBR1 0.04 0.00 0.04 0.01 0.08 0.00 0.07 0.04 0.10 0.00 0.038 b Lemont 0.29 0.35 0.56 0.52 0.10 0.24 0.14 0.54 0.17 0.28 0.319 a 泰粳394 0.17 0.17 0.11 0.21 0.57 0.36 0.44 0.70 0.23 0.17 0.313 a 第2次/YN-7 YSBR1 0.02 0.14 0.01 0.16 0.67 0.04 0.03 0.29 0.19 0.02 0.157 b Lemont 0.82 0.27 0.56 0.32 0.56 0.40 0.44 0.29 0.60 0.89 0.515 a 泰粳394 0.36 0.40 0.25 0.67 0.67 0.52 0.22 0.60 0.49 0.19 0.437 a 第2次/MH12 YSBR1 0.24 0.03 0.00 0.06 0.01 0.17 0.00 0.13 0.15 0.00 0.079 b Lemont 0.21 0.66 0.89 0.71 0.90 0.38 0.41 0.08 0.38 0.03 0.465 a 泰粳394 0.32 0.26 0.25 0.33 0.17 0.39 0.56 0.61 0.42 0.49 0.380 a 第3次/YN-7 YSBR1 0.07 0.06 0.50 0.53 0.02 0.36 0.12 0.08 0.06 0.15 0.195 b Lemont 0.35 0.68 0.38 0.02 0.01 0.73 0.76 0.52 0.79 0.50 0.474 a 泰粳394 0.75 0.49 0.21 0.72 0.49 0.47 0.64 0.68 0.45 0.84 0.574 a 第3次/MH12 YSBR1 0.15 0.02 0.35 0.11 0.03 0.02 0.05 0.59 0.08 0.01 0.141 b Lemont 0.51 0.80 0.39 0.12 0.09 0.12 0.23 0.54 0.42 0.16 0.338 ab 泰粳394 0.11 0.43 0.15 0.73 0.74 0.71 0.62 0.33 0.59 0.77 0.518 a R. solani strains YN-7 and MH12 were inoculated to each rice cultivar for three times (10 repeats each time). The sheath blight lesions were scanned electronically. The relative lesion area was calculated using the integration method. The average lesion areas of the cultivars were analyzed by ANOVA and multiple comparisons. The average lesion areas labeled with different letters showed significant difference (P < 0.05). 分别用纹枯病菌株YN-7和MH12对每个水稻品种接种3次, 每次10个重复(10皿); 扫描纹枯病病斑, 通过积分换算方法, 计算相对病斑面积。对3个水稻品种的平均相对病斑面积进行方差分析和多重比较, 同列数据后无相同小写字母表明品种平均相对病斑面积具有显著差异(P< 0.05)。

表2 纹枯菌侵染水稻离体叶片相对病斑面积的统计分析 Table 2 Statistical analysis of the relative lesion area of detached rice leaves infected with R. solani

在以上离体叶片的接种试验中, 感病品种Lemont和泰粳394的相对病斑面积均无显著差异(P> 0.05)。

受到病原菌侵染的植物会启动一系列复杂高效的保护机制, 包括病程相关基因的激活, 以抵抗病原菌的侵袭^[16]。在接种24和48 h, 取纹枯病菌株YN-7侵染和无菌对照的离体叶片材料, 对其中水稻病程相关基因OsPR1b^{[8, 11]}、OsPR3^[11]、PBZ1^{[8, 11]}、转录因子E2F^[8]以及PDR^[8]进行实时定量RT-PCR分析。比较接种处理和无菌对照的基因相对表达量, 结果表明, 以上5个基因在YSBR1和Lemont的24或48 h接种材料中均表现表达上调(接种处理的基因相对表达量显著或极显著高于对照的相应表达量, 图3)。OsPR1b、PBZ1和PDR在YSBR1中相对表达量的峰值高于Lemont中的相应峰值。YSBR1中E2F相对表达量的峰值则低于Lemont的相应峰值。OsPR3在YSBR1和Lemont中的表达水平相差不大。根据上述结果, 离体叶片材料中水稻病程相关基因呈典型诱导表达, 说明纹枯病菌已侵染水稻叶片组织。

图3

Fig.3

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图3 离体水稻叶片接种纹枯病菌后病程相关基因的表达量变化 Y和L分别表示水稻品种YSBR1和Lemont; 24 hpi和48 hpi分别表示接种纹枯病菌之后24和48 h的取样材料; 24h和48h表示未接种水稻材料, 作为对照。* 和* * 分别表示处理组与对照组基因相对表达量存在显著差异(P< 0.05)和极显著差异(P< 0.01)Fig.3 Changes of the relative expression levels of rice pathogenesis-related genes in the R.solani-infected detached rice leaves Y, the rice cultivar YSBR1; L, the cultivar Lemont; 24 hpi and 48 hpi represent the rice samples at the time points of 24 and 48 hours post inoculation (hpi) of R. solani, respectively; 24h and 48h, the uninoculated rice samples at the 24 hpi and 48 hpi, as negative controls. * and * * indicate significant difference (P< 0.05) and extremely significant difference (P< 0.01), respectively

对YSBR1、Lemont和泰粳394进行了大田成株期纹枯病接种试验。根据Rush等^[15]的0~9级病情评价体系, YSBR1、Lemont和泰粳394的平均病级分别为2.85(抗病)、7.60(感病)、4.31(中等感病), 相互之间呈显著差异(表3)。此外, 根据水稻苗期“ 微室” 接种试验结果, YSBR1、Lemont和泰粳394的苗期平均病级分别为2.98(抗病)、7.65(感病)和6.19(感病), 相互呈显著差异(表4)。因此, 上述结果验证了抗病和感病品种YSBR1和Lemont之间, 以及YSBR1和泰粳394之间的纹枯病病级差异。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 水稻大田成株期纹枯病接种的病级 Table 3 The sheath blight scores of rice adult plants inoculated with R.solani on field 品种 Cultivar 大田水稻植株的纹枯病病级 Sheath blight score of rice plants on field 植株数 Plant number 平均病级 Average YSBR1 2.00 3.00 3.00 3.00 2.00 4.00 3.00 1.00 3.00 3.00 20 2.85 c 4.00 3.00 3.00 3.00 2.00 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00 泰粳394 4.00 4.50 4.00 4.00 3.50 4.50 4.00 4.00 4.00 4.00 47 4.31 b 5.00 4.00 4.00 5.00 4.00 3.50 4.00 4.00 4.00 3.50 4.50 4.00 4.00 4.00 4.00 4.50 4.00 4.00 4.00 4.00 4.50 4.00 4.50 6.00 6.00 5.00 5.00 5.00 4.00 4.00 3.00 5.00 5.00 4.00 5.00 5.00 5.00 Lemont 9.00 7.00 9.00 9.00 9.00 7.00 9.00 9.00 9.00 9.00 20 7.60 a 9.00 9.00 9.00 6.00 8.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 Three tillers of each rice plant were inoculated with R.solani. The disease score of a single plant were rated by calculating the average of the scores of tillers.The disease scores of three rice cultivars were analyzed by ANOVA. The average scores labeled without the same lower letters showed significant difference (P < 0.05). The same as the table below. 每个水稻植株接种3个分蘖, 计算分蘖的纹枯病平均病级, 作为水稻单株病级。对3个水稻品种的单株病级进行方差分析, 平均病级后无相同小写字母的品种的纹枯病病级具有显著差异(P < 0.05)。下同。

表3 水稻大田成株期纹枯病接种的病级 Table 3 The sheath blight scores of rice adult plants inoculated with R.solani on field

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 水稻苗期纹枯病菌“ 微室” 接种的病级 Table 4 The sheath blight scores of rice seedlings inoculated with R.solani using micro-chamber method 品种 Cultivar 苗期水稻植株“ 微室” 接种的纹枯病病级 Sheath blight score of rice plants inoculation with the micro-chamber methods 植株数 Plant number 平均病级 Average YSBR1 2.06 2.89 3.00 2.27 4.49 2.18 3.32 3.60 2.21 2.34 2.38 5.03 12 2.98 c 泰粳394 7.14 6.02 4.48 6.42 5.17 9.00 6.49 5.60 6.31 9.00 8.25 7.08 24 6.19 b 4.76 3.26 9.00 4.99 6.54 4.53 3.30 8.07 2.94 6.93 4.39 9.00 Lemont 7.88 9.00 7.54 8.25 9.00 8.24 9.00 5.42 3.84 8.26 8.60 6.72 12 7.65 a For a single experimental repeat, 4-5 rice seedlings were inoculated with R.solani in a micro-chamber, and the average disease score of the plants was calculated. 每个微室接种4~5个水稻幼苗, 作为1次接种重复, 然后计算全部植株的平均病级。

表4 水稻苗期纹枯病菌“ 微室” 接种的病级 Table 4 The sheath blight scores of rice seedlings inoculated with R.solani using micro-chamber method