试材红颜草莓取自四川省双流县黄龙溪镇百安农业草莓种植基地。试验于2014年1月14日开始进行, 将花后7 d的草莓果实分别用30、50、70 μ mol· L^-1的NDGA(DMSO溶解)以及100 μ mol· L^-1ABA(正对照)、清水(CK)进行喷洒, 每隔5~7 d喷洒一次, 每次每果喷至处理液完全覆盖于果实表面, 以表面有第一滴水滴为限。花后7和14 d每次采果20个, 花后21、28、32 d每次采果10个, 草莓果实发育时期依次为小绿、大绿、纯白、片红、全红。同一处理, 取生长健壮, 整齐一致的一级果实, 液氮速冻后存储于-80 ℃超低温冰箱备用。

用美国R& D Systems 公司的植物激素脱落酸(ABA) ELISA KIT试剂盒测定草莓果实ABA含量, 将ABA标准品梯度稀释成300、150、75、37.5、18.75 μ L· L^-1, 以标准品的浓度为横坐标, 波长为450 nm处的吸光度值为纵坐标, 绘制标准曲线。取1 g果实样品, 用液氮研磨, 加9 mL 0.01 mol· L^-1磷酸缓冲液, pH控制在7.2~7.4, 按试剂盒的方法测定吸光度值, 并计算出相应的浓度。

可溶性糖含量采用蒽酮比色法^[15]测定, 有机酸含量参照于鲁浩^[16]的酸碱滴定法进行测定。花色苷含量测定参照张娟娟^[17]、王博^[18]的实验方法, 略有改动, 具体如下:称取0.5 g草莓果实, 加入液氮研磨, 加5 mL提取液(丙酮:水:甲酸=80:20:0.2), 在室温避光条件下振荡20 min, 于4 ℃, 8 000 r· min^-1下离心20 min, 重复提取直至样品变为无色。合并上清液, 20 mL容量瓶定容, 用0.45 μ m水相滤膜过滤, 滤液即为可用于HPLC测定的待测液。采用Agilent 1260 LC高效液相色谱仪, G1214 VWD检测器, 检测波长525 nm, 柱温:25 ℃。色谱柱:Symmetry C18(4.6 mm× 150 mm, 5 μ m)。流动相A:1.6%甲酸水溶液, B:1.6%甲酸乙腈溶液; 洗脱条件:梯度洗脱, 0~4 min, 5% B; 4~12 min, 10% B; 12~20 min, 25% B; 20~25 min, 40% B, 流速1 mL· min^-1, 以10 μ L滤液为进样体积。标准物质天竺葵素葡萄糖苷(3-O-β -glucopyranosides of pelargonidi, Pg3G)购于Sigma-Aldrich公司, 绘制标准曲线根据峰面积计算样品含量。

参照Chen等^[19]改良CTAB法对各组处理的样品分别提取总RNA, 并检测RNA的完整性及纯度。以1 μ g检测合格的总RNA为模板, 根据宝生物工程(大连)有限公司, RT-PCR试剂盒(RR047A)使用手册进行cDNA第一链合成。

采用CFX 96(Bio-Rad, USA)进行qRT-PCR检测, 利用Beacon Designer 7.9软件进行特异引物设计, 引物序列如下表1所示。反应体系为SYBR Premix EX TaqTM(宝生物工程有限公司, 大连)5 μ L, 浓度为10 μ mol· L^-1的上下游引物各0.4 μ L, cDNA 1 μ L及ddH₂O 3.2 μ L。反应程序为:95 ℃预变性3 min, 95 ℃变性10 s, 55.7 ℃(或59 ℃) 退火30 s, 40个循环。每个样品重复3次, 并以Actin 作为内参。采用2^{-Δ Δ Ct}的方法处理定量数据^[20]。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 用于本实验的引物序列 Table 1 Primers used for gene expression in this study 目标基因 Genes NCBI编号 Accession No. 描述 Description 引物序列(5’ -3’ ) Sequences 扩增子长度 Amplicon/bp NCED1 JX013944.1 Forward CTACTTCAACGACCGCCTCT 122 Reverse GAGTGTGGAGGTGACTGGATAC CYP707A1 HQ681284.1 Forward CGCTACAAAGAAGAACTGAG 136 Reverse TGTCACCGATAATGTTCCTC BG1 JX244261.1 Forward TGGAGGAGGCAGATCAGAT 81 Reverse CTGGAAGCCCAAACAACCT CHLH GQ201451.1 Forward GATGCGAATGAGAAGTTGAAG 139 Reverse GAATCACCTTAGCACCTCTT FaActin XM_004306544.2 Forward GCTTGGTCCTTCTTCATC 93 Reverse GAATGTCCTCGGTATCAG

表1 用于本实验的引物序列 Table 1 Primers used for gene expression in this study

数据使用SPSS13.0及DPS 7.05数据包进行方差分析及相关性分析。

在果实的整个发育周期中, ABA含量随时间逐渐上升, 并伴有两个明显的峰值(图1), 第一个峰值在花后21 d(始红期), 第二个峰值在花后32 d(全红期)。经NDGA处理后, 草莓果实中ABA含量整体变化趋势不变, 但都低于对照, 各时期NDGA处理浓度越高, ABA含量越低。ABA处理(正对照)的草莓果实中ABA含量相对较高, 且随果实发育差异逐渐变大, 在花后28和32 d与对照组相比差异显著(P< 0.05)。

图1

Fig.1

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	图1 NDGA及ABA外源处理后草莓果实成熟过程中ABA含量变化 * * 表示差异极显著(P< 0.01), * 表示差异显著(P< 0.05)。下同Fig.1 Effect of exogenous NDGA and ABA treatment on ABA content of strawberry during fruit ripening process * * indicates the significance at the level of 0.01, * indicates the significance at the level of 0.05. The same as below

草莓果实中可溶性糖含量随着果实成熟逐步升高(图2)。在果实发育前期, 果实中糖含量的差距不大, 但从着色期(花后21 d)开始有明显差异。全红期时, 各处理与对照差异显著(P< 0.05), ABA处理的果实可溶性糖含量高于CK, 而NDGA处理的果实可溶性糖含量均低于CK, 且浓度越大, 含量越低。草莓果实整个成熟着色过程中, 有机酸含量整体呈现下降的趋势, 但在28 d有一个高峰, 各处理变化趋势一致, 且差异不显著。天竺葵素葡萄糖苷是草莓中最主要的花色苷, 在果实发育前期, 对照与不同处理之间天竺葵素葡萄糖苷含量差异不大, 随着果实逐渐成熟, 差异变大, NDGA处理浓度越高, 天竺葵素葡萄糖苷含量越低。70 μ mol· L^-1 NDGA处理后的草莓果实各时期天竺葵素葡萄糖苷含量最低, 全红期时, 比正对照处理低15.5 mg· g^-1, 与CK相比差异显著(P< 0.05)。

图2

Fig.2

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	图2 NDGA和ABA外源处理后草莓果实成熟过程中可溶性糖、有机酸和天竺葵素葡萄糖苷含量的变化Fig.2 Effect of exogenous NDGA and ABA treatment on soluble sugar, organic acid and pelargonidin 3-glucoside content of strawberry during fruit ripening process

根据试验数据对果实中的可溶性糖、有机酸、天竺葵素葡萄糖苷与ABA进行相关性分析, 其与ABA的相关系数分别为r²=0.873, P=0.011 2; r²=-0.275, P=0.013 1; r²=0.932, P=0.0143, 表明果实中可溶性糖和天竺葵素葡萄糖苷与ABA呈显著性正相关关系, 有机酸与ABA关系不密切。

通过荧光定量PCR测定FaNCED、FaBG1、FaCYP707A1、FaCHLH的相对表达量, 以第一次采样时对照的表达量为参照(图3), 可以看出各处理FaNCED表达量整体呈上升趋势, 在花后21与32 d有峰值, 经ABA处理后FaNCED表达量与CK相比显著上升(P< 0.01), 而经NDGA处理后的表达量均低于CK组, 且各时期浓度越高, 表达量越低。随着果实的成熟, FaBG1呈逐渐下降趋势, 果实着色前期基因表达量呈现较高的水平, 果实着色开始后表达量处于较低水平, NDGA溶液处理后FaBG1基因相对于对照组在果实褪绿期表达量有所升高, 花后14 d与对照之间差异最大。各时期正对照(ABA处理)与CK之间差异不大。FaCYP707A1的表达整体呈下降趋势, 且在21 d时出现第一个谷值。经NDGA处理后, 在花后14 d 50 μ mol· L^-1 NDGA, 70 μ mol· L^-1 NDGA和ABA处理与对照相比差异显著(P< 0.05), 其他时期差异不显著。在果实发育前期和后期, FaCHLH的表达量相对较高, 着色开始(花后21 d)表达量为整个阶段的最低值, 经NDGA处理后在褪绿期(7~14 d), 其表达量高于CK, 其他时间低于CK组。正对照(ABA)处理后果实中的FaCHLH表达量从花后14 d开始高于CK。

图3

Fig.3

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	图3 NDGA和ABA外源处理后草莓ABA相关基因的表达量 A、B、C、D分别为FaNCED、FaBG1、FaCYP707A1、FaCHLH基因相对表达量Fig.3 Effect of exogenous NDGA and ABA treatment on ABA relative gene expression in strawberry A, B, C, D represents the relative gene expression of FaNCED, FaBG1, FaCYP707A1, FaCHLH;