引用本文
吴允, 毕榆林, 张扬, 郭晓敏, 李志腾, 万方, 朱鹏飞, 徐璐, 常国斌, 徐琪, 陈国宏. 中国部分鸡种 B-G基因SNP和Indel [J]. 浙江农业学报, 2016,28(8): 1338-1342
WU Yun, BI Yu-lin, ZHANG Yang, GUO Xiao-min, LI Zhi-teng, WAN Fang, ZHU Peng-fei, XU Lu, CHANG Guo-bin, XU Qi, CHEN Guo-hong. SNP and Indel analysis of B-G gene of some Chinese chicken breeds [J]. ACTA AGRICULTURAE ZHEJIANGENSIS,2016,28(8): 1338-1342  
Permissions
Copyright©2016, 《浙江农业学报》编辑部
中国部分鸡种 B-G基因SNP和Indel
吴允, 毕榆林, 张扬, 郭晓敏, 李志腾, 万方, 朱鹏飞, 徐璐, 常国斌*, 徐琪, 陈国宏
扬州大学 动物科学与技术学院,江苏 扬州225009
*通信作者,常国斌,E-mail:passioncgb@163.com

作者简介:吴允(1989—),男,山东潍坊人,硕士, 从事鸡的遗传育种研究。E-mail:1633988960@qq.com

收稿日期: 2015-12-30
基金: 国家自然科学基金项目(31301966); 江苏省六大人才高峰计划资助项目
摘要

鸡的 MHC基因家族中 B-G基因与鸡抗病性有关,通过研究与抗病有关的 B-G基因的多态性可以从根本上提高鸡抵抗疾病的能力,进而为抗病育种奠定基础。试验对25个鸡种基因组DNA进行目标捕获测序,以NCBI中 Gallus gallus的 B-G基因序列为参考,利用MEGA6软件进行不同鸡种基因序列比对,分析 B-G基因外显子和内含子中的SNPs和Indels以及氨基酸的变化,最后制作进化树。结果表明,25个鸡种中外显子存在8个SNPs、19个Indels,内含子有67个SNPs、327个Indels;同时氨基酸序列也呈现出相应的多态性,中国地方鸡种也表现出丰富的遗传多样性。来航鸡、仙居鸡、隐性白羽鸡的 B-G基因存在丰富的多态性;来航鸡在进化树上单独为一类,藏鸡、文昌鸡由于地理位置因素也分别为单独一类;现代肉鸡中罗斯与隐性白羽鸡聚为一类;不同类型的中国地方鸡种间同源性较小。中国地方鸡种 B-G基因存在多源性进化以及丰富的遗传多样性,进而产生抗病性差异。

关键词: 鸡; B-G基因; SNPs; Indels; 进化树
中图分类号:S831.2 文献标志码:A 文章编号:1004-1524(2016)08-1338-05 doi: 10.3969/j.issn.1004-1524.2016.08.10
SNP and Indel analysis of B-G gene of some Chinese chicken breeds
WU Yun, BI Yu-lin, ZHANG Yang, GUO Xiao-min, LI Zhi-teng, WAN Fang, ZHU Peng-fei, XU Lu, CHANG Guo-bin*, XU Qi, CHEN Guo-hong
College of Animal Science and Technology, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China
Abstract

B-G gene of the MHC families is related to the traits of disease resistance in chicken breeds. Investigation on the polymorphism of B-G genes can fundamentally improve the chickens’ disease resistance, and then lay a foundation for resistance breeding. In this study, the DNA samples of 25 chicken breeds were used by target capture sequencing method for gene sequencing. Considering B-G gene sequence of Gallus gallus as the reference, we used MEGA6 software for gene analysis to seek out single nucleotide polymorphism (SNP), insertion-deletion (Indel) and the changes of amino acid, and finally constructed the evolutionary tree. The results revealed that exons had 8 SNPs, 19 Indels and introns had 67 SNPs, 327 Indels in 25 chicken breeds. Amino acids also presented certain polymorphisms and local breeds showed high degree of genetic diversity. This method provided abundant B-G genotypes in the chickens, such as recessive white chicken, Xianju chicken, Leghorns chicken. Leghorns chicken was in separate evolutionary tree for category. Tibetan chickens and Wenchang chickens were also separately categorized due to the geographical location factor. Rose in modern poultry and recessive white chickens gathered for one class, but homology between different types of Chinese local breeds were smaller. The above experiments showed that there were several origins and plenty of genetic diversities of B-G gene, which resulted in different disease resistance in Chinese indigenous breeds.

Keyword: chickens; B-G gene; SNPs; Indels; phylogenetic tree

鸡的主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)基因是在16号微小染色体上一组紧密连锁的基因簇[1], 其编码的蛋白质在细胞的自我识别中有重要作用, 并且其参与细胞免疫和体液免疫[2]。家禽中MHC基因群有2个独立的区域, B基因座和Rfp-Y基因座[3]。B基因座由B-F(Ⅰ 类)、B-L(Ⅱ 类)、B-G[4](Ⅳ 类)基因组成。B-G基因是家禽特有的, 该基因家族多数在红细胞、血小板表面表达, 在红细胞表面表达的不仅具有抗原呈递和抗原识别的免疫功能, 而且对MHCⅠ 类和Ⅱ 类抗原的体液免疫应答具有辅助作用[5]; 有较少的在肠上皮细胞和白细胞表面表达[6], 其功能尚不清楚。我国鸡种资源丰富, 分布广泛, 经历长期的自然选择和人工选择[7], 使得我国的鸡有着优良的性状, 如:抗逆性强、繁殖率高、肉质好等特点。这些优良性状中鸡的抗性主要与MHC基因簇相关, MHC基因家族中关于B-F、B-L基因的报道较多, 而对B-G基因的多态性的报道较少。本次研究旨在以25种鸡为试验材料, 通过目标序列捕获方法对B-G基因进行SNPs和插入和缺失(Indels)分析, 以期能探明该基因的遗传多样性, 为家禽的抗病育种提供参考依据。

1 材料与方法
1.1 鸡品种来源及基因组DNA提取

本试验共采集25个鸡品种, 其中罗斯鸡(LS)、广西黄鸡(GH)、青脚麻鸡(QM)、绿壳蛋鸡(LD)、太湖鸡(TH)、溧阳鸡(LYA)、如皋鸡(RC)、雪山草鸡(XC)、文昌鸡(WC)、隐性白羽鸡(YB)、 来航鸡(LH)、安卡鸡(AK)等鸡种来自扬州大学动物科学与技术学院遗传资源实验室禽种资源基因库; 北京油鸡(YJ)、萧山鸡(XS)、泰和乌骨鸡(WG)、黑狼山鸡(HL)、斗鸡(DJ)、固始鸡(GS)、藏鸡(ZJ)、大骨鸡(DG)、茶花鸡(CH)、鹿苑鸡(LY)、仙居鸡(XJ)、白耳鸡(BE)等地方鸡种来自中国农业科学研究院家禽科学研究所; 红色原鸡 (HY)亚种采自云南省野生动物救护中心。每个品种随机抽取10只鸡, 采取无菌翅静脉采血, 每只鸡采血3 mL, 用常规的酚— 氯抽提法, 提取DNA, 将每个鸡种的10个个体的DNA混合, 然后4℃保存。

基因外显子1.2 B-G基因序列分析与构建进化树

将DNA样品送深圳华大基因公司进行目标序列捕获测序, 所获序列用以NCBI 中Gallus gallus为标准基因库, 并用CLUSTALW软件对25个鸡种进行对比分析, 筛选B-G基因的SNPs和Indels, 运用MEGA6软件邻接法(NJ)构建 Phylogenetic tree。

2 结果与分析
2.1 B-G基因外显子SNPs

NCBI中 Gallus gallus 的B-G基因有16个外显子、15个内含子, 其中外显子1 008 bp、内含子3 259 bp。25个鸡种的B-G基因外显子发生的SNPs见表1, 外显子SNPs相对较少, 仅在斗鸡、红色原鸡、绿壳蛋鸡、仙居鸡中Exon1上发现一个碱基突变, 来航鸡在3个外显子上均发生碱基的突变, 碱基突变后相应的氨基酸发生改变, 表现出一定的多态性。

表1 不同鸡的B-G基因外显子SNPs分布 Table 1 SNPs distribution of B-G gene in different chick breeds
2.2 B-G基因外显子碱基的Indels

对25个鸡种的B-G基因上外显子分析结果见表2, 其中固始鸡、斗鸡、黑狼山鸡、罗斯鸡、青脚麻鸡、泰和乌骨鸡、北京油鸡、安卡鸡均发生碱基缺失, 其中, 斗鸡缺失最多, 多达6个碱基, 并且氨基酸也发生了改变, 呈现出一定的多态性。

表2 不同鸡的B-G基因外显子Indels分布 Table 2 Indels distribution of B-G gene in different chick breeds
2.3 B-G基因中内含子SNPs

由图1可知, 25种鸡中内含子有67个碱基发生了突变, 其中来航鸡、大骨鸡、鹿苑鸡、萧山鸡、泰和乌骨鸡、发生碱基突变的数目较多, 呈现出丰富的多态性。

图1 不同鸡的内含子SNPs数量Fig.1 SNPs distribution of introns in different chick breeds

2.4 B-G基因中内含子Indels

由图2可知, B-G基因中内含子中有327个碱基发生插入/缺失, 其中红色原鸡、绿壳蛋鸡、溧阳鸡、泰和乌骨鸡、文昌鸡、来航鸡、雪山草鸡、北京油鸡的Indels较多, 内含子呈现出更丰富的多态性。

图2 不同鸡的内含子Indels数量Fig.2 Indels distribution of introns in different chick breeds

2.5 B-G基因进化树分析

用MEGA6软件构建25个鸡种NJ进化树(图3), 树枝的长度代表了树的距离, 树枝上显示Bootstrap 1 000个循环设置的置信度。25个鸡种分为6大类, 其中22种鸡分为3类; 现代肉鸡中罗斯与隐性白羽鸡聚为1类, 而不同类型的中国地方鸡种间同源性较小, 表明中国地方鸡种B-G基因存在多源性进化以及丰富的遗传多样性, 这可能是中国地方鸡种与现代商业品种存在抗性差异的主要原因。

图3 不同鸡种NJ系统进化树Fig.3 NJ phylogenetic tree of different chick breeds

3 讨论

哺乳动物中都含有MHC基因群[8], 该基因与多种疾病的抗性和生产性能相关, 并且在不同种群中的结构和表现不同。本研究结果表明, 仅在B-G基因Exon1、2、3、12、15、16上存在碱基的突变和缺失, 而其他外显子没有发生SNPs、Indels, 呈现出较高的保守性。斗鸡、红色原鸡、绿壳蛋鸡、仙居鸡、来航鸡的B-G基因外显子发生了SNPs, 固始鸡、斗鸡、黑狼山鸡、罗斯鸡、青脚麻鸡、泰和乌骨鸡、北京油鸡、安卡鸡的外显子发生了Indels, 并且氨基酸都发生了改变, 可能对先天免疫性能产生了影响。其中来航鸡、固始鸡的Exon2分别发生了碱基的突变和缺失, 这与徐日福等[9]研究结果一致, 中国地方鸡种的B-G基因第2外显子呈现出遗传多态性, 因为第2外显子所编码的类Ig-V结构域, B-G基因的多态性与抗原决定簇的结构域相关。B细胞、T细胞表面的特异B-G基因的抗原决定性受体被B簇识别[10], 由此可见, 第2外显子的多态性对免疫学有重要的作用。斗鸡、红色原鸡、绿壳蛋鸡、仙居鸡在Exon 1上发生了碱基的突变, 这与商鹏等[11]研究结果一致, 在地方鸡种B-G基因第1外显子发现了遗传多态性, 可能第1外显子多态性也与抗病性有关。

在研究外显子的过程中, 内含子越来越受到人们的重视, 对内含子的研究目前还处于初级阶段, 研究内含子对于编码序列和蛋白质的调控都有重要的作用。王晓斌等[12]有关内含子功能研究的新进展表明, mRNA突变主要发生在内含子上, 这是由于内含子的位置是非常保守的, 而长度保守型很低造成的。本次试验内含子发生SNPs位点67个, Indels位点327个, 也证明了这一点。通过对25种鸡B-G基因内含子发生SNPs、Indels的研究, 为今后深入研究内含子的功能提供了参考。

从25个鸡种构建进化树中看出, 藏鸡、来航鸡、文昌鸡单独为一类。来航鸡是来自意大利高产蛋鸡, 与其他鸡种存在明显的起源与进化差异, 故在进化树上单独为一类; 藏鸡是产自西藏的传统鸡种; 文昌鸡产自我国海南省的传统鸡种, 由于地理位置与生态类型差异, 与其他鸡种同源性较低。另外22种鸡分为3类, 并无规律可寻, 现代商品鸡种中隐性白羽鸡、罗斯鸡聚在一起。我国不同类型的地方鸡种同源性很低, 例如大体型的溧阳鸡、产蛋性能高的仙居鸡, 这可能与地理位置和长期历史文化有关, 表明中国地方鸡种B-G基因存在多源性进化以及丰富的遗传多样性, 这可能是中国地方鸡种与现代商业品种存在抗性差异的主要影响因素。隐性白羽鸡、罗斯鸡、安卡鸡等外来品种与我国地方鸡种并没有形成单独分类, 这可能由于20世纪70年代开始我国部分鸡种[13], 如狼山鸡、丝羽乌骨鸡被引种到国外进行杂交、混群造成的。综上所述, 鸡的MHC B-G基因存在着丰富的多态性, 这与不同鸡种的抗性差异有关, 为利用我国丰富的鸡种资源培养出具有高抗病能力的新品种奠定了理论基础。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] 欧阳建华, 袁立, 孙汉, 等. 中国泰和乌骨鸡MHC与其繁殖性能相关性能的研究[J]. 江西农业大学学报, 2000, 22(1): 99-101.
OUYANG J H, YUAN L, SUN H, et al. A study on the relationship of MHC gene variant to breeding performance in chinese Taihe silky fowl[J]. Act Agriculture University Jiangxi, 2000, 22(1): 99-101. (in Chinese with English abstract) [本文引用:1]
[2] 程光潮, 黄凡美, 周勤宣, 等. 中国地方鸡种种质特性[M]. 上海: 上海科学技术出版社, 2000: 78-80. [本文引用:1]
[3] 于春林, 徐亚欧, 杜华锐, 等. 鸡MHC基因B-G区域的生物信息学分析[J]. 四川畜牧兽医, 2010, 37(5): 26-28.
YU C L, XU Y O, DU H R, et al. Bioinformatics analysis of chicken major hiscompatibility complex B-G gene[J]. Sichuan Animal & Veterinary Sciences, 2010, 37(5): 26-28. (in Chinese) [本文引用:1]
[4] BRILES W E, MCGIBBON W H, IRWIN M R. On multiple alleles affecting cellular antigens in the chicken[J]. Genetics, 1950, 35(6): 633-652. [本文引用:1]
[5] 屠云洁, 苏一军, 李国辉, 等. 江西2个地方鸡品种MCH B-G座位多态性及生物信息学分析[J]. 扬州大学学报, 2013, 34(3): 29-32.
TU Y J, SU Y J, LI G H, et al. MHC B-G loci polymorphism and bioinformatics analysis of two indigenous chicken breeds in Jiangxi[J]. Journal of Yangzhou University, 2013, 34(3): 29-32. (in Chinese with English abstract) [本文引用:1]
[6] 陈国宏, 张勤. 动物遗传原理与育种方法[M]. 北京: 中国农业出版社, 2009: 66-78. [本文引用:1]
[7] 李玉祥. 中国泰和鸡种质资源开发史[J]. 自然资源学报, 1992, 4(7): 347-353.
LI Y X. Taihe chicken germplasm resources development history[J]. Journal of Natural Resources, 1992, 4(7): 347-353. (in Chinese with English abstract) [本文引用:1]
[8] 周童, 马建民, 顾万君, 等. 哺乳动物MHC密码子使用概率的聚类分析[J]. 东南大学学报, 2001, 31(2): 6-10.
ZHOU T, MA J M, GU W J, et al. Mammalian MHC codes using the cluster analysis of probability[J]. Journal of Southeast University, 2001, 31(2): 6-10. (in Chinese with English abstract) [本文引用:1]
[9] 徐日福, 李奎, 陈国宏, 等. 中国部分地方鸡种MHC B-G基因第二外显子遗传多态性[J]. 动物学报, 2006, 52(1): 160-169.
XU R F, LI K, CHEN G H, et al. Genetic polymorphism within exon 2 of MHC B-G gene in nine Chinese indigenous chicken breeds[J]. Current Zoology, 2006, 52(1): 160-169. (in Chinese with English abstract) [本文引用:1]
[10] SALOMONSEN J, DUNON D, SKJODT K, et al. Chicken major histocompatibility complex-encoded B-G antigens are found on many cell types that are important for the immune system[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1991, 88(4): 1359-1363. [本文引用:1]
[11] 商鹏, 强巴央宗, 张浩, 等. 藏鸡MHC B-G基因第1、2外显子的遗传多态性分析[J]. 四川畜牧兽医, 2009, 36(9): 26-27.
SHANG P, QIANG B Y Z, ZHANG Het al. The B-G gene genetic polymorphisms analysis of 1, 2 exon in Tibet chicken[J]. Animal Husband ry & Veterinary in Sichuan, 2009, 36(9): 26-27. (in Chinese) [本文引用:1]
[12] 王晓斌, 刘国仰. 有关内含子功能研究的新进展[J]. 中华医学遗传杂志, 2000, 17(3): 211-212.
WANG X B, LIU G Y. About the new progress in the study of function of introns[J]. Chinese Journal of Medical Genetics, 2000, 17(3): 211-212. (in Chinese) [本文引用:1]
[13] 朱元照. 我国引进商用品系鸡种简况[J]. 中国家禽, 1984 (3): 21-24.
ZHU Y Z. Commercial strains breeds brief introduced into China[J]. China Poulty, 1984 (3): 21-24. (in Chinese) [本文引用:1]