1.1.1 样品来源

草莓分批采于浙江省若干生产基地和市场, 采样时间为2016年3月— 4月, 采用随机抽样, 选取18个批次进行检测, 编号分别为1— 18。

1.1.2 仪器与试剂

VITEK微生物自动鉴定仪和检测卡(GNI), 生物梅里埃公司(美国); 微生物培养纯化所用的麦康凯培养基、孟加拉红培养基、PCA培养基、乳糖蛋白胨等均为杭州微生物试剂有限公司产品。

1.2.1 检测方法

草莓样品中大肠菌群、菌落总数和霉菌的测定分别按中华人民共和国国家标准GB4789.2— 2010^[5]、GB4789.3— 2010^[6]、GB 4789.15— 2010^[7]进行。

1.2.2 细菌分离与鉴定

将分离的细菌划线培养于LB培养基平板, 约12~18 h后挑取单菌落, 按照VITEK2 Compact全自动微生物分析系统仪标准操作流程进行。鉴定前先用棉签刮取少量菌落于0.45% NaCl, 调浊度至0.50~0.63麦氏浊度, 然后放置于充填机, 通过真空泵以负压形式使菌液均匀分布于鉴定卡片。最后取出并放置于系统培养室, 并启动程序。VITEK系统自动检测, 在8~10 h后进行数据分析并得到最终结果^{[8, 9]}。质控菌株为产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)ATCC700324。

1.2.3 真菌鉴定

真菌提取方法参照ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrep^TM(Zymo Research)。刮取少量真菌到0.45% NaCl, 经过一系列分离和洗脱后得到DNA样品, 用1%的琼脂糖凝胶进行电泳分析。并对真菌V3区进行PCR扩增, PCR产物经切胶回收、加尾后, 与pGM-Simple-T Fast 载体进行连接, 转化大肠埃希氏菌DH5α , 筛选阳性克隆进行测序鉴定。V3区引物序列^[10]:ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3', ITS5:5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'。PCR反应体系50 μ L:基因组DNA、引物各1μ L, 灭菌双蒸水2 μ L, Platinum® PCR SuperMix 45 μ L。反应条件:95 ℃ 5 min; 94 ℃ 30 s, 58 ℃ 30 s, 68 ℃ 1 min, 35个循环; 72 ℃10 min。

按照食品检验程序, 分别对3月份16批和4月份15批草莓样品及时进行卫生微生物学检测, 结果见表1和表2。总体上看, 草莓的含菌量比较高:一方面, 草莓顺地生长, 直接接触土壤, 极大地增加了感染土壤微生物的机会; 另一方面, 草莓为喜温湿植物, 一般适宜生长温度18~25 ℃, 湿度60%, 温湿环境也为微生物的生长繁衍提供了良好条件, 这些条件都有可能造成草莓污染程度较高。另外, 市场草莓的污染程度比温棚高, 这可能与草莓运输或储存过程中的二次污染有关。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 三月份草莓采后卫生微生物学检测结果 Table 1 Results of microbiological determination of food hygiene detection for strawberry in March 批次 NO. 地点 Site 菌落总数 Total numbers of colony/(cfu· g-1) 大肠菌群 Enumeration of coliforms /(MPN· g-1) 霉菌 Mold /(cfu· g-1) 1 温棚Greenhouse 120 3 0 2 温棚Greenhouse 180 6 23 3 温棚Greenhouse 230 7.4 46 4 温棚Greenhouse 350 11 120 5 温棚Greenhouse 410 23 110 6 温棚Greenhouse 530 27 160 7 温棚Greenhouse 600 43 210 8 温棚Greenhouse 1100 35 260 9 温棚Greenhouse 1270 21 200 10 温棚Greenhouse 15360 1100 220 11 市场Market 1900 15 200 12 市场Market 2660 23 380 13 市场Market 3300 43 380 14 市场Market 8800 240 400 15 市场Market 9800 240 1340 16 市场Market 12000 1100 1900

表1 三月份草莓采后卫生微生物学检测结果 Table 1 Results of microbiological determination of food hygiene detection for strawberry in March

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 四月份草莓采后卫生微生物学检测结果 Table 2 Results of microbiological determination of food hygiene detection for strawberry in April 批次 NO. 地点 Site 菌落总数 Total numbers of colony/(cfu· g-1) 大肠菌群 Enumeration of coliforms/(MPN· g-1) 霉菌 Mold /(cfu· g-1) 1 温棚Greenhouse 130 3 0 2 温棚Greenhouse 210 11 60 3 温棚Greenhouse 290 16 80 4 温棚Greenhouse 710 14 400 5 温棚Greenhouse 860 27 260 6 温棚Greenhouse 1230 36 210 7 温棚Greenhouse 1330 23 270 8 温棚Greenhouse 3400 64 1730 9 温棚Greenhouse 3700 290 2900 10 温棚Greenhouse 48600 1100 2300 11 市场Market 4680 93 3500 12 市场Market 9800 1100 6100 13 市场Market 14650 93 2450 14 市场Market 23000 1100 1500 15 市场Market 36900 240 2900

表2 四月份草莓采后卫生微生物学检测结果 Table 2 Results of microbiological determination of food hygiene detection for strawberry in April

在VITEK系统中进行鉴定, 获得了19株细菌, 编号分别为B1-B19。这19株菌的名称及致病性见表3。其中, 阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、溶血巴斯的菌(Pasteurella haemolytica)、鲁氏不动杆菌(Presumptive Acinetobacter Lwoffi)、河生肠杆菌(Ent.amnigenus)等可引起人体呼吸道疾病, 气味沙雷菌(Serratia odorifera)可释放高致病毒素, 大肠埃希菌(Escherichia coli)和居泉沙雷菌(Serratia fonticola)可引起人体腹泻。根据伯杰氏细菌鉴定手册, 这19种细菌分别属于3科(假单胞菌科、肠杆菌科和弧菌科)和8个属, 且在土壤中均有分布^[11]。草莓果实贴地生长, 这些细菌可能直接来源于土壤, 或是储运过程中的污染。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 草莓细菌的VITEK鉴定结果 Table 3 Bacteria identified by VITEK in strawberry 序号 NO. 科 Family 名称 Name 致病性 Pathogenicity B1 假单胞菌科 Pseudomonadaceae 假单胞菌 Pseudomonas spp. 引起蛋白类食物(牛奶, 鱼和鸡蛋等食物腐败)[11] Cause the spoilage of protein food (such as milk, fish and eggs) B2 假单胞菌科 Pseudomonadaceae 荧光假单胞菌 Pseudomonas fluorescens 引起急性骨髓炎[12] Cause acute osteomyelitis B3 肠杆菌科 Enterobacteriaceae 阴沟肠杆菌 Enterobacter cloacae 可引起呼吸道、泌尿道等多个部位的感染[13] Cause the infection of respiratory tract and urinary B4 肠杆菌科 Enterobacteriaceae 阿氏肠杆菌 Enterobacter asburiae 感染动物, 可致死[14] Can infect animals and cause death B5 肠杆菌科 Enterobacteriaceae 成团范菌 Pantoea agglomerans 引起水稻等植物病害[15] Cause plant disease of rice B6 肠杆菌科 Enterobacteriaceae 溶血巴斯德氏菌 Pasteurella haemolytica 引起咽部感染[16] Can cause pharyngeal infection B7 肠杆菌科 Enterobacteriaceae 鲁氏不动杆菌 Presumptive acinetobacter Lwoffi 引起呼吸机相关性肺炎[17] Cause breathing associated pneumonia B8 肠杆菌科 Enterobacteriaceae 泛菌属 Pantoea spp. 引起植物病害[18] Cause plant disease B9 肠杆菌科 Enterobacteriaceae 植生拉乌尔菌 Raou planticola 引起肺部感染[19] Cause the infection of lung B10 肠杆菌科 Enterobacteriaceae 液化沙雷菌群 Serratia liquefaciens group 引起肺部、泌尿系统、创口等感染[20] Cause the infection of lung, urinary system and wound B11 肠杆菌科 Enterobacteriaceae 河生肠杆菌亚种1 Ent.amnigenus1 引起肺部感染[21] Cause the infection of lung B12 肠杆菌科 Enterobacteriaceae 河生肠杆菌亚种2 Ent.amnigenus 2 引起肺部感染[21] Cause the infection of lung B13 肠杆菌科 Enterobacteriaceae 弗氏柠檬酸杆菌 Citrobacter freundii 可引起婴幼儿感染性肠炎[22] Induce the infants infecting infective enteritis B14 肠杆菌科 Enterobacteriaceae 气味沙雷菌 Serratia odorifera 释放高致病性的内毒素, 可引起发热、脓毒性休克等症状[23] Release endotoxin with high pathogenicity which could cause fever and shock B15 肠杆菌科 Enterobacteriaceae 中间克吕沃尔菌 Kluyvera intermedia 可引起人腹痛等着症状[24] Cause the stomachache B16 肠杆菌科 Enterobacteriaceae 水生拉恩菌 Rahnella aquatilis 可导致人体肺部感染[25] Could infect lung B17 肠杆菌科 Enterobacteriaceae 大肠埃希菌 Escherichia coli 引起呼吸道、泌尿道等感染[26] Cause the infection of respiratory tract and urinary B18 肠杆菌科 Enterobacteriaceae 居泉沙雷菌 Serratia fonticola 引起致婴儿重症腹泻[27] Cause severe diarrhea for infants B19 弧菌科 Vibrionaceae 多杀巴斯德菌 Pasteurella multocida 引起血液感染[28] Cause blood infection

表3 草莓细菌的VITEK鉴定结果 Table 3 Bacteria identified by VITEK in strawberry

草莓真菌鉴定结果如表4, 编号为F1— F5, 根据真菌分类手册^[29]分别为:接合菌亚门毛霉属卷枝毛霉菌(Mucor circinelloides), 接合菌亚门毛霉属多变根毛霉变种(Rhizomucor variabilis var. regularior), 半知菌亚门植孢属极细枝孢菌(Cladosporium tenuissimum), 子囊菌门镰刀菌属真菌(Fusarium sp.)和接合菌亚门毛霉属冻土毛霉菌(Mucor hiemalis)。其中, 毛霉菌属真菌可引起皮肤病等疾病^[30], 镰刀菌属真菌与植物病害有关, 同时也产生真菌毒素^[31]。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 草莓真菌鉴定结果 Table 4 Fungi identified in strawberry 序号 NO. 霉菌形态 Mold form 名称 Name 致病性 Pathogenicity F1 绿霉 Green mold 卷枝毛霉菌 Mucor circinelloides f. circinelloides 引起易感人群鼻、脑、胃肠道、皮肤等多部位的感染[30] Cause the infection of nose, brain, gastrointestinal tract and skin F3 白霉 White mold 多变根毛霉变种 Rhizomucor variabilis var. regularior 引起易感人群鼻、脑、胃肠道、皮肤等多部位的感染[31] Cause the infection of nose, brain, gastrointestinal tract and skin F2 绿霉 Green mold 极细枝孢菌 Cladosporium tenuissimum 引起雪松针叶枯斑[31] Cause leaf necrotic spot for cedar F4 粉霉 Pink mold 镰刀菌 Fusarium sp. 引起赤霉病产生毒素[32] Cause gibberellic disease and release toxin F5 黄霉 Yellow mold 冻土毛霉菌 Mucor hiemalis 引起原发性皮肤毛霉病[33] Cause primary skin hair mildew

表4 草莓真菌鉴定结果 Table 4 Fungi identified in strawberry

在数量上, 采自于生产基地或是市场的草莓表面微生物数量都超出了直接食用食品的卫生学标准^[34]。在种类上, 草莓中含有较多的致病菌, 实验鉴定的草莓细菌有3科8属, 鉴定的真菌有3属5种。这些微生物多数具有致病性, 如假单胞菌多引起蛋白类食品腐败, 阴沟肠杆菌、溶血巴斯德氏菌等可造成呼吸道等感染, 大肠埃希菌和居泉沙雷菌多引起腹泻等症状, 霉菌如镰刀菌属可引起食物中毒, 毛霉菌等可引发皮肤病^{[12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28]}。由水果中微生物污染导致的食源性疾病较为严重, 并逐渐引起人们重视。2009— 2012年在北京市某区市售食品的卫生状况调查中, 45.95%的水果类食品微生物检测不合格^[35]。2011年5月, 果蔬微生物污染造成的疫情从德国向欧洲各国扩张, 截止2011年7月7日, WHO公布已有3 941人发病, 其中, 3 032人患出血性肠炎但未发生溶血性尿毒综合征(HUS), 909人患溶血性尿毒综合征^[36]。因此, 草莓等水果的卫生安全应该予以重视。

从微生物污染情况来看:一方面草莓种植环境的微生物可以在草莓生长过程中造成直接污染, 管理措施、采摘条件的不合理因素也会增加草莓被感染的可能性; 另一方面是草莓从基地到市场运输过程中造成的二次污染, 使草莓表面的污染微生物数量增加。因此, 为保证草莓的卫生与安全, 需要在各个环节进行控制。对生产者来说, 在种植上要注意对土壤及环境的消毒工作, 储运销售过程中要无菌包装, 减少在空气中的暴露时间; 对消费者来说, 购买新鲜草莓至关重要, 同时鉴于草莓有较多微生物, 在食用之前应进行适当的除菌措施, 以确保食用安全。更重要的是开发新的杀菌除菌技术, 例如可运用超高压、脉冲电磁等高新冷杀菌加工技术, 既要保证草莓风味, 又要保障食用安全^[37]。

近几年来, 国内外食品安全事故已经严重威胁到市场秩序, 也给公众带来了恐慌。根据世界卫生组织统计, 全球每年发生300~1 000万因食源性疾病而死亡的案例^[38]。食源性疾病的发生与食品中的微生物及其毒素相关, 因此, 加强对食品微生物在生产中各个环节的监测, 开发新的食品微生物快速检测技术, 对于控制以及预防食源性疾病的发生和传播至关重要^[39]。传统的微生物检测技术(如平板计数分离法)不仅耗时长, 而且效率低下, 越来越难以满足现代食品安全检测的需要。目前, 一些新技术例如基于PCR技术、电化学原理和免疫学原理的技术在实践中逐步得到了应用^[38]。随着科学技术的不断发展, 更加灵敏、快速、低成本检测技术的开发将成为食品检测技术的发展方向。