引用本文
肖翰, 刘标, 尹红梅, 许隽, 杜东霞, 贺月林. 病死猪堆肥高效油脂降解菌的筛选及堆肥效果研究[J]. 浙江农业学报, 2017,29(1): 44-50.
XIAO Han, LIU Biao, YIN Hongmei, XU Jun, DU Dongxia, HE Yuelin. Isolation and identification of oil degradation bacteria for efficient dead-pig composting[J]. ACTA AGRICULTURAE ZHEJIANGENSIS, 2017,29(1): 44-50.
  
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病死猪堆肥高效油脂降解菌的筛选及堆肥效果研究
肖翰, 刘标, 尹红梅, 许隽, 杜东霞, 贺月林*
湖南省微生物研究院,湖南 长沙 410009
*通信作者,贺月林,E-mail:hyl200866@yeah.net

作者简介:肖翰(1974—),男,湖南涟源人,工程师,从事环境微生物研究。E-mail:1227204689@qq.com

收稿日期: 2016-08-17
基金资助: 湖南省科技厅农业支撑计划(2015NK3057); 湖南省生猪产业技术体系生猪产业规模养殖与环境控制岗位项目
摘要

为加快病死猪堆肥过程中油脂的降解,从受油脂污染的样品中分离、筛选高效油脂降解菌,并将其接种至堆肥中进行堆肥效果验证。共分离得到6株具有油脂降解能力的菌株,其中菌株D-4降解能力最强。在初始筛选条件下,该菌对油脂的降解率达57.21%,在发酵48~54 h时达到产脂肪酶的高峰。经形态特征、生理生化特征、16S rDNA序列系统发育分析,将其鉴定为黏质沙雷氏菌( Serratia marcescens)。D-4菌株不同添加量的堆肥效果表明,接种D-4菌各组堆肥的油脂含量均显著( P<0.05)低于各时期对照组中的油脂含量。结果表明,筛选获得的菌株D-4为高效油脂降解菌株,可以用于病死猪腐熟堆肥,加快病死猪中油脂的降解。

关键词: 油脂降解菌; 脂肪酶; 沙雷氏菌属; 堆肥效果
中图分类号:S141.4;X713 文献标志码:A 文章编号:1004-1524(2017)01-0044-07 doi: 10.3969/j.issn.1004-1524.2017.01.07
Isolation and identification of oil degradation bacteria for efficient dead-pig composting
XIAO Han, LIU Biao, YIN Hongmei, XU Jun, DU Dongxia, HE Yuelin*
Hunan Microbiology Institute, Changsha 410009, China
Abstract

To accelerate the oil degradation of dead-pig, microorganisms able to degrade lipids efficiently were screened and isolated from oil-polluted samples. The isolated strains were mixed and inoculated in composting of dead-pigs and wheat bran with different doses to test its effects on oil degradation. Six oil-degrading strains were isolated, and among them strain D-4 showed the highest degradation ability, with the degradation rate up to 57.21%. The lipase production of strain D-4 reached a peak at 48~54 h of fermentation. Based on morphological, physiological and biochemical characteristics, and phylogenic analysis of 16S rDNA sequences, strain D-4 was identified as Serratia marcescens. At the end of composting, the oil contents of all inoculation groups with strain D-4 were significantly ( P<0.05)lower than that of the control group. It was indicated that sufficient amount inoculation of D-4 could effectively accelerate lipid degradation of dead-pig by composting.

Keyword: oil-degrading strain; lipase; Serratia sp.; composting effect

我国是畜牧产业大国, 养殖规模居世界前列。以生猪为例, 据统计, 2015年我国生猪存栏4.51亿头、出栏7.08亿头。在生猪养殖过程中, 每年因各类疾病引起的死亡率占养殖总数的8%~12%[1], 产生了数量巨大的染疫动物尸体。死畜禽携带大量的病原微生物, 对人类及畜牧业的健康发展构成了严重威胁[2, 3]。如何无害化处理病死畜禽尸体, 是目前规模养殖过程中急需解决的问题。根据中华人民共和国农业部2013年颁布的《病死动物无害化处理技术规范》, 我国病死动物无害化处理技术主要包括4类, 即焚烧法、化制法、掩埋法和发酵法, 以上技术在病死动物无害化处理中都有应用。焚烧法对动物尸体处理彻底, 通过高温可以彻底消灭病原微生物, 但会造成空气污染, 而且需要大量燃料, 费用较高; 化制法在处理过程中易产生恶臭气体和废水, 且费用较高[4]; 掩埋法虽具有处理速度快、花费小等优点, 但可能会造成地下水和土壤污染, 且该方法处理周期长[5]; 发酵法是指将动物尸体与稻糠、木屑等辅料混合, 利用动物尸体的生物热或加入特定的微生物, 发酵动物尸体, 最后把病死动物变为有机肥的过程。国内外研究表明, 通过对病死畜禽进行堆肥处理可以较好地分解畜禽残体, 且堆肥过程中温度能达到60 ℃以上, 能有效杀死病原微生物实现无害化, 是一种低成本的死畜禽处理方法[6, 7, 8, 9, 10]。

目前市面上的堆肥菌剂主要是针对畜禽粪便和城市生活垃圾中的成分研制的[11, 12, 13], 而畜禽尸体堆肥在理化性质上与其他种类的堆肥不同, 因此市场上专门针对畜禽尸体堆肥的菌剂较少, 经过发酵获得的有机肥中油脂含量可达20.3%[14], 这是影响畜禽尸体肥料化产品品质的主要因素, 而且对堆肥设备也有不利影响[15]。鉴于此, 本试验对可以加快畜禽尸体中油脂降解的菌株进行筛选, 并对其在病死猪堆肥中的效果进行验证, 为其在病死猪无害化处理中的应用提供一定的理论依据。

1 材料与方法
1.1 材料

1.1.1 样品来源

样品分别采自餐馆周边长期受油脂污染的下水道及土壤, 共6份水样、6份土样。

1.1.2 培养基

富集培养基:NaCl 0.5 g, 蛋白胨 5.0 g, 牛肉膏 0.5 g, 猪油按周期逐次递增加入(方法见1.2.1), pH 7.0~7.2, 蒸馏水1 000 mL。121 ℃灭菌20 min。

中性红培养基:1 000 mL的牛肉膏蛋白胨培养基分别加入熟猪油10 mL和0.6%的中性红水溶液1 mL。121 ℃灭菌20 min。

降解培养基:熟猪油 10 g, (NH4)2SO4 5 g, Na2HPO4 2 g, KH2PO4 2 g, NaCl 2 g, 加蒸馏水定容至1 L, pH 7.0~7.4。

产酶发酵培养基:蔗糖 0.50 g, 蛋白胨 2.00 g, K2HPO4· 3H2O 0.10 g, (NH4)2SO4 0.10 g, MgSO4· 7H2O 0.05 g, 1 mL猪油, 用蒸馏水定容至100 mL, 自然pH, 115 ℃灭菌15 min。

LB液体培养基:胰蛋白胨10 g· L-1, 酵母提取物5 g· L-1, 氯化钠10 g· L-1, 121 ℃灭菌20 min。

LB固体培养基:在LB液体培养基的基础上加入2%的琼脂, 121 ℃灭菌20 min。

1.2 试验方法

1.2.1 驯化

将采集到的样品用无菌水10倍稀释后充分混合, 取5 mL稀释液到45 mL富集培养液中, 30 ℃, 100 r· min-1条件下振荡培养, 每4 d为1周期, 接种10 mL菌液到40 mL新培养液中以促进菌株的生长, 驯化持续5个周期。初始加油量随周期逐次递增, 分别为0.8、1.6、2.4、3.2、4.0 mL· L-1。

1.2.2 油脂降解菌的筛选

取最后一次驯化的菌液1 mL用无菌蒸馏水梯度稀释, 分别取10-4、10-5、10-6梯度的菌液涂布中性红油脂平板, 30 ℃恒温培养3~5 d, 观察菌落生长情况和菌落周围是否变红, 若变红则表明菌株能够分解油脂产生脂肪酸[16]。将初筛入选的菌株以1%的接种量接种到以熟猪油为唯一碳源的降解培养液中, 30 ℃, 150 r· min-1条件下培养96 h, 用紫外分光光度法[17]测定样品在223 nm 波长下的吸光度值, 同时以猪油为溶质、石油醚为溶剂, 测定不同猪油浓度的吸光度值, 绘制标准曲线, 根据标准曲线计算猪油含量以及各菌株的油脂降解率。

1.2.3 降解菌产脂肪酶活性测定

选取油脂降解率最高的菌株D-4接种到LB培养液中培养18 h, 再以1%的接种量接入产酶发酵培养基, 30 ℃, 180 r· min-1, 每6 h取样1次, 在波长600 nm处测定菌液的吸光度值绘制生长曲线, 同时将发酵液8 000 g离心10 min, 测定发酵液的上清液中脂肪酶酶活, 从而绘制出菌株产酶曲线。脂肪酶酶活采用橄榄油滴定法测定[18]。

1.2.4 高效油脂降解菌的鉴定

对筛选到的产酶活性最高的菌株D-4进行形态学、显微镜观察后, 用DNA提取试剂盒提取细菌的基因组DNA, PCR扩增采用16S rDNA通用引物:27F, 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'; 1492R, 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR反应条件:95 ℃预变性3 min; 94 ℃变性1 min, 56 ℃退火1 min, 72 ℃延伸2 min, 反应进行30个循环; 最后72 ℃延伸10 min, 4 ℃终止。将PCR产物利用回收试剂盒纯化后交由上海生物工程有限公司测定其序列。

测得的序列通过NCBI比对分析, 利用Mega 5.0软件中NJ法构建16S rDNA系统发育树, bootstrap检验, 重复1 000 次, 确定该菌的分类地位。

1.2.5 D-4在堆肥中对油脂的降解效果

在塑料桶内进行病死猪模拟堆肥, 按病死猪(粉碎)和麦麸质量比为1:1混合均匀, 调节含水率60%左右, 每个重复30 kg。试验设对照组(CK)、试验1组(T1)、试验2组(T2)和试验3组(T3), 试验组添加事先制备的油脂降解菌D-4菌液(活菌数3.0× 108 cfu· mL-1), 添加量分别为混合物料湿质量的0.5%(T1)、1.0%(T2)和1.5%(T3)(V/m)。将混合均匀的物料装入塑料桶内(塑料桶直径为35 cm, 高60 cm), 最后将塑料桶放置在长× 宽× 高为1. 2 m× 1. 2 m× 1. 2 m的试验池内, 桶四周和底部填充水稻秸秆进行保温, 顶部用石棉瓦覆盖。每个组3个重复。每5 d人工倒桶翻堆1次, 并随机取样, 利用索氏提取法测定样品中的油脂含量。

1.3 统计分析

试验数据采用SPSS 18.0和Microsoft Excel 2007进行统计分析和作图。试验结果以平均值± 标准差表示, 数据间差异显著性分析采用One-way ANOVA方法进行。

2 结果与分析
2.1 菌株分离及筛选

从餐馆周边取得的水样和土壤样品中, 经5 个周期的富集驯化共分离得到6株对油脂有降解作用的菌株, 分别将其命名为D-1~D-6, 根据形态特征和分子序列分析结果, D-1、D-2为酵母菌, D-3、D-4、D-5、D-6为细菌。6株菌在中性红培养基中培养4 d后, 菌落周围明显变红(图1), 初步断定这6株菌能够分解油脂产生脂肪酸, 具有一定的油脂降解能力。将初筛获得的6株菌接种到以猪油为唯一碳源的降解培养液中培养96 h 后, 测定培养基中的剩余含油量, 计算油脂降解率。从图2可以看出, 6株菌均能分解培养基中的油脂, 其中菌株D-4的降解率最大, 达到57.21%, 因此选取该菌株作进一步研究。

图1 中性红培养基上的菌落特点Fig.1 Characteristic of colony on plate of neutral red culture-medium

图2 各菌株的油脂降解率Fig.2 Grease-degrading rate of various strains

2.2 菌株D-4的生长曲线及产酶曲线测定

图3显示, 菌株D-4在接种到LB培养液后的0~6 h处于迟缓和适应期, 在6~24 h处于对数生长期, 24~54 h左右处于稳定期, 而54 h后开始进入衰亡期, 符合细菌的一般生长特性。而菌株在迟缓期和对数生长期产脂肪酶较少, 进入稳定期后逐渐进入产酶高峰, 48~54 h时达到产酶最高峰, 54 h后因为菌株进入衰亡期, 菌体大量死亡, 产酶能力也随之下降。

图3 菌株D-4的生长曲线及产酶曲线Fig.3 Growth curve and enzyme production curve of strain D-4

2.3 油脂高效降解菌D-4的鉴定

菌株D-4在LB固体培养基上培养24 h后, 形成的菌落呈浅黄色, 湿润, 表面光滑, 不透明(图4-A)。进一步对菌株D-4进行革兰氏染色观察, 显微镜下观察发现为革兰氏阴性细菌, 呈杆状(图4-B)。以菌株D-4的基因组DNA为模板, 采用27F、1492R通用引物进行PCR扩增后, 获得约1 500 bp的16S rDNA序列。该序列通过BLAST与NCBI GenBank数据库中已报道序列进行同源性比对, 采用Mega 5.0软件中NJ法构建16S rDNA系统发育树(图5)。Blast比对结果显示:D-4与黏质沙雷氏菌的同源性达99%, 结合形态学特征、生理生化试验结果(表1), 鉴定D-4为黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens)。

图4 菌株D-4菌落形态(A)及显微形态(B)观察Fig.4 Colony (A) and cell morphology (B) of strain D-4

图5 D-4的16S rDNA系统发育树Fig.5 Phylogenetic tree of strain D-4 based on 16S rDNA sequence

表1 生化试验结果 Table 1 Results biochemical tests
2.4 堆肥过程中油脂含量的变化

堆肥过程中各组试验装置中的油脂含量如表2所示, 随着堆肥时间推进, 各组推肥中的油脂含量不断降低。堆肥第5天时, 各组的油脂含量降解较少, 且对照组和接菌各组的油脂含量无显著性差异(P> 0.05)。堆肥第10天至堆肥结束, 各添加菌剂的试验组中油脂含量均下降至15%以下, 显著(P< 0.05)低于各时期对照组中的油脂含量。接菌各组中, 1%接菌量组(T2)和1.5%接菌量组(T3)间结果无显著差异, 油脂含量均显著(P< 0.05)低于0.5%接菌量组(T1)。

表2 堆肥过程中油脂含量变化 Table 2 Oil content changes during compost process %
3 讨论

堆肥处理死畜禽相对于其他方法, 设备简单, 易操作, 并且堆肥产品可以用作肥料, 既实现无害化处理又实现了废弃污染物的资源化利用, 是一种较好的死畜禽处理方法。目前在微生物对油脂的降解研究中, 欧美一些发达国家已将油脂降解菌应用到含油废水的处理、生物柴油的生产等多项领域, 而关于油脂降解菌在畜禽尸体堆肥方面的应用研究还较少。因此, 筛选能够在堆肥中高效降解油脂的微生物菌株可以提高肥料的品质, 有助于推广堆肥法在畜禽尸体处理方面的应用。

本研究从受油脂污染的样品中经驯化、分离, 获得1株高效降解动物油脂的菌株D-4, 在初始培养条件下培养96 h, 该菌的油脂降解率达到57.21%。经过鉴定, 该菌属于沙雷氏菌属(Serratia sp)。该菌能够高效降解动物油脂, 与其在含有动物油脂的培养基中产生高浓度的胞外脂肪酶有关(图3)。近些年来, 有关来源于黏质沙雷氏菌的脂肪酶在工业及生产生活中用途的研究越来越多, 但大部分已报道的野生型黏质沙雷氏菌菌株脂肪酶的酶活不高。如蓝卉等[19]筛选到的黏质沙雷氏菌SYBC Y-R的最高酶活仅1.07 U· mL-1, 刘义等[20]筛选到的沙雷氏菌HS-L5的酶活仅1.5 U· mL-1, 朱绮霞等[21]筛选到的菌株沙雷氏菌Lipa1318脂肪酶活性虽有所提高, 达到25.32 U· mL-1, 但仍低于本试验筛选到的菌株D-4的最高酶活(60.25 U· mL-1)。因此, 以该菌株作为出发菌株, 在油脂降解方面具有一定的开发潜力。

本试验结果表明, 添加了D-4菌液的试验组中油脂含量均显著低于对照组中的油脂含量, 是因为接种油脂降解菌后, 菌株D-4在快速生长的同时分泌了大量的脂肪酶, 加速了油脂的降解。但在菌液添加到一定量后, 油脂的降解率并没有明显提高, 可能是因为在一定的营养条件下, 菌株快速繁殖达到一定数量后, 由于缺乏营养物质等因素导致相互竞争, 从而降低了微生物的活性[22]。

堆肥过程中影响堆肥效果的主要因素有通风率、水分、堆体的碳氮比等, 今后对于该菌的研究可集中在堆肥工艺条件参数的优化上, 提高油脂降解率, 以加快其在病死猪堆肥生物处理中的应用。不同微生物来源的脂肪酶的最适温度、pH, 及其他生化指标存在很大的差异[23], 因此, 下一步可对菌株D-4产生的脂肪酶酶学性质进行分析, 以进一步扩大该菌株的应用领域。

The authors have declared that no competing interests exist.

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