以种植在浙江农林大学铁线莲种质资源圃的15个进口铁线莲栽培品种和11个国产野生种为研究对象。除单一样本的野生种类外(安徽铁线莲、圆锥铁线莲、大花威灵仙和天台铁线莲野生资源稀少, 种质资源圃目前仅各保留了1株), 相同野生种类的不同单株均来自于同一居群, 栽培品种种苗购自波兰CLEMATIS Ź ró d/lo Dobrych Pnᶏczy公司。以健康的新叶为试材, 其中, 野生种类46个单株, 分别取样; 每个栽培品种3个单株, 取混合叶样, 共计61个样本作为试验材料(表1)。叶片经液氮速冻后带回实验室, -80 ℃保存备用。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 供试材料信息 Table 1 Information of samples 序号 No. 名称 Names 学名或英文名 Latin name or English name 编号 No. 样本数 Sample numbers 来源 Origins 海拔 Altitude/m 1 山木通* C. finetiana 1-13 13 浙江天目山Tianmu Mountain in Zhejiang Province 499 2 短尾铁线莲* C. brevicaudata 14-16 3 浙江天目山Tianmu Mountain in Zhejiang Province 431 3 毛萼铁线莲* C. hancockiana 17-18 2 浙江丽水Lishui City in Zhejiang Province 579 4 女萎* C. apiifolia 19-32 14 浙江天目山Tianmu Mountain in Zhejiang Province 533 5 柱果铁线莲* C. uncinata 33-37 5 浙江省杭州市临安区 Lin'an District of Hangzhou City in Zhejiang Province 350 6 安徽铁线莲* C. chinensis var. anhweiensis 38 1 安徽滁州Chuzhou City in Anhui Province 334 7 单叶铁线莲* C. henryi 39-41 3 浙江天目山Tianmu Mountain in Zhejiang Province 322 8 圆锥铁线莲* C. terniflora 42 1 浙江淳安Chun'an County in Zhejiang Province 735 9 大花威灵仙* C. courtoisii 43 1 浙江临安 Lin'an District of Hangzhou City in Zhejiang Province 477 10 毛蕊铁线莲* C. lasiandra 44-45 2 浙江临安 Lin'an District of Hangzhou City in Zhejiang Province 503 11 天台铁线莲* C. patens subsp. tientaiensis 46 1 浙江天台 Tiantai County in Zhejiang Province 611 12 维新斯基主教 Kardyna/l Wyszyń ski 47 1 波兰 Poland 13 戴安娜公主 Princess Diana 48 1 英国 Great Britain 14 狂想曲 Rhapsody 49 1 英国 Great Britain 15 吉泽拉 Gizela 50 1 波兰 Poland 16 皇室 Royalty 51 1 英国 Great Britain 17 乌托邦 Utopia 52 1 日本 Japan 18 丹尼尔德隆达 Daniel Deronda 53 1 英国 Great Britain 19 蓝光 Blue Light 54 1 荷兰 Netherlands 20 罗曼蒂克 Romantika 55 1 爱沙尼亚 Estonia 21 吉恩斯 Girenas 56 1 立陶宛 Lithuania 22 面白 Omoshiro 57 1 日本 Japan 23 倪欧碧 Niobe 58 1 波兰 Poland 24 雪舞 Snowdrift 59 1 英国Great Britain 25 粉香槟 Pink Champagne 60 1 日本 Japan 26 仙女座 Andromeda 61 1 英国 Great Britain · wild species * 表示野生

表1 供试材料信息 Table 1 Information of samples

1.2.1 cpSSR位点搜寻与引物开发

从GeneBank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez)下载C. fusca var. coreana的叶绿体全基因组序列(GenBank No. KM652489.1), 用Misa软件分析其SSR位点信息, 参数设置:单碱基、二碱基和三碱基重复微卫星最小重复次数分别为10、6和4, 四碱基和四碱基以上微卫星最小重复次数为3。使用微软Windows 7系统的记事本和Excel 2007软件打开Misa软件的分析结果文件* .statistics和* .misa, 查看和统计C. fusca var. coreana叶绿体基因组序列全长、SSR位点数量和具体分布位置、不同类型SSR占比等信息。利用Primer Premier 5软件, 按照引物长度20~25 bp, PCR产物100~300 bp, 退火温度50~65 ℃, 正、反向引物退火温度之差在5 ℃以内, GC含量30%~60%设计引物, 尽量避免引物出现二级结构。

1.2.2 DNA提取、PCR扩增与产物检测

使用E.Z.N.A Plant DNA Mini Kit Spin Protocol (Omega Bio-tek)试剂盒提取叶片基因组DNA。PCR总反应体系为20 μ L:ddH₂O 11 μ L, 10× buffer 2 μ L, dNTP(10 mmol· L^-1)0.4 μ L, Dynazyme II DNA polymerase 0.6 μ L, DNA(约20 ng)2 μ L, 引物各2 μ L。PCR反应程序:94 ℃ 45 s; 94 ℃ 30 s, 72 ℃ 40 s, 35个循环; 72 ℃ 5 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳初步检测后, 使用Qsep100毛细管电泳(中国台湾产)测定产物片段大小。

1.2.3 数据分析

使用Powermarker V3.25和Popgene 3.2软件统计主等位基因频率、等位基因数、有效等位基因数、多态信息含量等信息, 并依据Nei's遗传距离, 采用UPGMA法构建系统进化树^[20]。

C. fusca var. coreana的叶绿体基因组全序列长度为159 609 bp, 从1 088 bp到158 278 bp共分布有67个SSR位点。经统计, SSR位点序列总长度777 bp, 为叶绿体基因组长度的0.5%; 其中, 单碱基重复微卫星50个, 占比74.63%, A和T是主要重复单元, 分别占38.0%和60.0%, G仅出现1次, C没有出现; 二至四碱基微卫星包括14种基元, 二碱基微卫星共3个(占4.5%), 所含基元仅TA一种; 三碱基微卫星共4个(占6.0%), 含有4种基元; 四碱基微卫星共10个(占14.9%), 含9种基元, 其中ATAA出现了2次, 占微卫星总数的3.0%(表2)。cpSSR在整个叶绿体基因组中分布并不均匀, 在1 088~41 445 bp(占总长度25.3%)和50 125~127 217 bp(占总长度48.3%)区域相对密集, 分别有27(占40.3%)和38(占56.7%)个微卫星。而在起始区域1~1 087 bp没有SSR位点分布, 末尾区域157 054~159 609 bp仅有2个SSR位点。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 C. fusca var. coreana叶绿体微卫星基元组成信息 Table 2 Repeat motifs in cpDNA of C. fusca var. coreana 重复碱基数 Repeat types 基元组成 Repeat motifs 微卫星数量 Number of cpSSRs 单碱基重复Mononucleotides 8[A]10, 5[A]11, 3[A]12, 2[A]14, [A]15, [G]10, 18[T]10, 8[T]11, 2[T]13, 2[T]14, 50 二碱基重复Dinucleotides 2[TA]6, [TA]7 3 三碱基重复Trinucleotides [ATA]4, [ATT]4, [TAT]4, [TTG]6 4 四碱基重复 Tetranucleotides [AAAG]3, [ACCA]3, [AGAA]3, [AGAT]3, 2[ATAA]3, [CATT]3, [CTAA]3, [TTAG]3, [TTTC]3 10

表2 C. fusca var. coreana叶绿体微卫星基元组成信息 Table 2 Repeat motifs in cpDNA of C. fusca var. coreana

使用Primer Premier 5对随机挑选的5个单碱基重复微卫星[A]₁₁、[A]₁₄、[G]₁₀、[T]₁₀、[T]₁₃及二碱基及以上重复的17个微卫星位点进行引物设计。共筛选获得11对引物, 具体信息见表3。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 11对引物信息表 Table 3 The information of 11 pairs of cpSSR primer 标记位点 在基因组中的位置 重复类型 引物序列 退火温度 产物大小 Locus Location Repeat types Primer sequences (5' to 3') TM/℃ Product sizes/bp Clecp1 rps16/trnK intergenic [ATA]4 F: AAATGCCAATCCAACA 48 218 R: CCCGGATAAGATAAATGA Clecp2 psbE/petL intergenic [ATT]4 F: ATGTGCCATTCAAGAT 49 184 R: TGGCGGGAATAGAAAT Clecp3 trnS/trnVintergenic [TTG]6 F: GAAATTCCCTTGGTTG 48 269 R: CATTGAAACGCTTACTT Clecp4 atpB/rbcL intergenic [AAAG]3 F: CCGTTGTTTCTTATTT 44 267 R: TGAAAGTTTCGCATTA Clecp5 rpl16 intron [AGAA]3 F: AAGGGATATGGATAAATGG 53 277 R: TGACTAGGCCCGAACT Clecp6 rps16/trnK intergenic [AGAT]3 F: TGACCCAAGAAATCCC 51 181 R: CCATAGGCTCATAAAGAAT Clecp7 ndhH/rps15 intergenic [ATAA]3 F: ACCGTTGGTAGAGTTT 48 284 R: AATTAAGAACCGAAGC Clecp8 trnK intron [ATAA]3 F: TTGATGGGTGTTGAGG 50 274 R: ACTCCTGGCTTATTTG Clecp9 ycf1 intron [CATT]3 F: TTTGCGGTACTAATCT 48 246 R: TATCACAAGCCCAAGT Clecp10 rpl14/rpl16 intergenic [CTAA]3 F: GTAGAGGCATATTGGG 49 295 R: ATGGAACGAAAGGAAA Clecp11 rpl16 intron [TTTC]3 F: AATGACTAGGCCCGAACT 53 281 R: CAAAGGGATATGGATAAATG

表3 11对引物信息表 Table 3 The information of 11 pairs of cpSSR primer

引物在11种野生铁线莲的46个样本和9个栽培品种的9个样本中, 共得到120条产物带, 毛细管检测结果清晰、明确(图1)。各引物对在仙女座、倪欧碧、粉香槟、吉恩斯、面白和雪舞等6个栽培品种中均未能得到扩增产物, 所得产物片段大小为191~303 bp。由表4可知, 得到有效扩增产物的55个样本(野生种和栽培品种)中:产物条带数7~18, 平均10.91; 有效条带数3.92~8.33, 平均5.40; 主等位基因频率0.22~0.44, 平均0.31; 多态信息含量0.72~0.88, 平均0.79, 其中, 引物Clecp3多态信息含量最高, Clecp9最低(表4)。11个cpSSR位点均呈现良好的多态性, 多态基因位点百分比为100%。

图1

Fig.1

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	图1 引物Clecp3扩增野生样本8(A)和栽培品种64(B)的产物毛细管电泳结果 Marker-L和Marker-H分别表示20和1 000 bp标准峰, Product为产物峰Fig.1 Product sizes of primer Clecp3 from sample 8 and 64 tested by capillary electrophoresis Marker-L and Marker-H represent the standard peak of 20 and 1 000 bp, Product represents the peak of product size

由UPGMA法构建的系统发育树(图2)可知, 在Nei's遗传距离0.886 5处(图2虚线位置), 55个铁线莲样本分别聚为5组。10个野生种类聚集在第Ⅰ ~Ⅳ 组, 1个野生种类和9个栽培品种聚集在第Ⅴ 组。其中, 单叶铁线莲的3个样本单独聚为1组(Ⅰ ), 柱果铁线莲、山木通共18个样本和女萎、短尾铁线莲共17个样本分别聚为2组(Ⅱ 和Ⅲ ), 圆锥铁线莲、安徽铁线莲、大花威灵仙、天台铁线莲和毛蕊铁线莲共6个样本聚集为第Ⅳ 组, 毛萼铁线莲和9个栽培品种共11个样本集合为第Ⅴ 组。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 铁线莲11对cpSSR引物的遗传多样性参数 Table 4 Genetic diversity of 11 pairs of cpSSR primers of C. fusca var. coreana 标记位点 主等位基因频率 观测等位基因数 等位基因数 多态信息含量 Locus MAF Na Ne PIC Clecp1 0.2909 9.0000 4.7488 0.7589 Clecp2 0.2909 7.0000 4.5217 0.7455 Clecp3 0.2182 15.0000 8.3333 0.8808 Clecp4 0.4182 18.0000 4.4032 0.7752 Clecp5 0.2909 11.0000 5.4114 0.7991 Clecp6 0.3091 10.0000 5.5915 0.8035 Clecp7 0.2727 9.0000 5.8738 0.8157 Clecp8 0.2364 13.0000 6.2371 0.8296 Clecp9 0.4364 9.0000 3.9235 0.7235 Clecp10 0.3273 9.0000 4.6467 0.7615 Clecp11 0.2727 10.0000 5.6754 0.8125 均值Mean 0.3058 10.9091 5.3970 0.7914

表4 铁线莲11对cpSSR引物的遗传多样性参数 Table 4 Genetic diversity of 11 pairs of cpSSR primers of C. fusca var. coreana

图2

Fig.2

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	图2 基于UPGMA法构建的55个样本聚类树 虚线处为Nei's遗传距离0.886 5Fig.2 Cluster tree of 55 samples based on UPGMA algorithm Nei's genetic distance of 0.886 5 was marked by dotted line

叶绿体基因组保守性强, 具有细胞质遗传的特点, 除少数植物外, 一般为单亲遗传。遗传物质由亲代向子代传递过程中不发生基因重组, 不会受到选择压力, 由于突变等因素产生的变异也因此更容易保存。叶绿体基因组具有独立的进化路线, 因此, cpSSR技术在进行植物分类、群体遗传结构及物种演化等研究中优势显著。cpSSR标记应用的难点在于需要进行引物设计和筛选, 通过构件基因组文库的方法耗时耗力, 效率较低。数据库搜索法则是利用已知的核酸序列, 搜索SSR位点进行引物设计和验证。目前, GeneBank数据库中存储有大量高等植物叶绿体基因组全部或部分序列^{[21, 22, 23]}, 在此基础上进行叶绿体微卫星标记开发, 较文库构建等方法更为经济、高效。

C. fusca var. coreana的叶绿体微卫星以单碱基低重复基元为主, 且A和T占比较高, 与水稻、黄瓜、拟南芥等多种植物^{[24, 25, 26, 27]}相似, 这种以单碱基重复为主、低丰度的分布特点可能与叶绿体基因组自身特性和进化方向有关。此外, 二碱基和三碱基微卫星分别出现了3和4个, 与其他高等植物相比, 含量偏低^[28]。

叶绿体基因组序列十分保守, 其进化速率仅为核基因组的1/5^[29], 这使得cpSSR标记可在近源物种通用^[30]。本研究筛选的11对cpSSR引物在铁线莲11个(100%)野生种和9个(60%)栽培品种中均可获得扩增产物, 有效等位基因数均值为5.40, 显示了其在铁线莲不同种间良好的通用性。微卫星序列多态性的产生源于重复基元数目的改变, 与碱基的插入或缺失有关, 多态信息含量PIC可以显示SSR序列的变异程度^[31]。11对引物在55个样本中检测到的PIC平均值较高, 达到0.791 4, 所得PCR扩增条带均大于预计目标条带, 表明此11个位点均存在由碱基插入所致的微卫星长度变异。

用于本研究的46个铁线莲野生种类样本源于浙江和安徽省, 通过植物志信息核对和专家鉴定的方式进行种类确认。15个栽培品种由波兰进口, 通过将观测到的植株花、叶形态信息在国际铁线莲协会(International Clematis Society, http://www.clematisinternational.com/)的数据库逐一核对进行品种身份确认。Upmga聚类分析发现, 绝大多数野生种类、栽培品种聚集在不同的组, 表明其遗传背景存在显著差异。铁线莲不同野生种分别聚类, 其中单叶铁线莲的3个样本自成1组, 女萎、短尾铁线莲和山木通、柱果铁线莲分别聚集成2个组, 显示了较近的亲缘关系。但蒋明等^[18]利用ITS序列所得聚类结果中, 女萎与毛蕊铁线莲聚为1组, 山木通与柱果铁线莲则分属于2个组, 这表明不同的分子标记方法和所检测种类总数可能会对研究结果产生影响。

圆锥铁线莲(1个样本)、安徽铁线莲(1个样本)、大花威灵仙(1个样本)、天台铁线莲(1个样本)和毛蕊铁线莲(2个样本)聚集为第Ⅳ 组, 而毛萼铁线莲(2个样本)则同栽培品种聚集于1组, 这可能是由于供试样本少, 导致聚类图分辨率较低所致, 并不能准确显示不同种类之间的遗传差异, 可通过增加检测样本数量进一步验证。铁线莲栽培品种育种多采用杂交获取, 多代杂交与回交、F₁代间再次杂交的情况并不鲜见, 遗传信息的交换与重组比较复杂, 亲缘关系远近不一。本研究中, 仙女座等6个品种没有获得目标PCR产物, 其育种过程信息在国际铁线莲协会数据库中并无记录, 遗传背景暂无法确认。此外, 叶绿体SSR具有单亲遗传特性, 这为评判杂交后代与母本的亲缘关系提供了有效工具, 但同时也对遗传背景不明的杂交后代亲缘关系评价造成了局限。本次参试的样本中不包括杂交亲本与子代或驯化栽培品种与原种, 有关11对cpSSR引物在铁线莲栽培品种杂交亲本与子代中应用的有效性有待进一步研究。

(责任编辑 侯春晓)