1.1.1 材料的采集

酸枣[Zizyphus jujuba Mill.var.spinosa(Bunge)Hu]植株于2015年5月采自延安大学后山、延安凤凰山(不带根), 采样后立即带回实验室供当天试验使用, 剩余的叶片置于4 ℃冰箱备用。

1.1.2 指示菌株

指示菌株均来于延安大学医学院, 由延安大学生命科学学院微生物实验室保藏, 指示菌编号见表1。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 指示菌株编号 Table 1 Indicator strain number 菌株编号 No. of strains 指示菌株 Indicator strain P-1 大肠埃希菌(Escherichia coli) P-2 伤寒杆菌 (Salmonella typhi) P-3 柠檬色葡萄球菌(Staphylococcu scitreus) P-4 福氏痢疾杆菌 (Shigella flexneri) P-5 白色念球菌(Monilia albican) P-6 金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) P-7 白色葡萄球菌(Staphylococcus albus)

表1 指示菌株编号 Table 1 Indicator strain number

1.1.3 培养基

筛选培养基:(1)PDA培养基; (2)牛肉膏培养基; (3)高氏培养基; (4)改良培养基1:叶片煮沸滤液1 000 g、NaCl 5 g、蔗糖10 g、琼脂18 g、pH 自然; (5)改良培养基2:NaCl 1 g、CaCl₂ 0.5 g、K₂HPO₄ 0.5 g、FeCl₃ 0.02 g、(NH₄)₂SO₄ 1 g、MgSO₄· 7H₂O 1 g, 蒸馏水1 000 mL、pH 7.0~7.2;

发酵培养基:马铃薯200 g、葡萄糖20 g、蛋白胨10 g 、NaCl 5 g、MgSO₄ 5 g、K₂HPO₄ 1 g、蒸馏水1 000 mL、pH自然;

优化培养基:(1)碳源筛选用基础培养基(g· L^-1):各种碳源3 g、蛋白胨10 g、K₂HPO₄ 3 g、MgSO₄· 7H₂O 1 g, 蒸馏水1 000 mL、pH自然。(2)氮源筛选用基础培养基(g· L^-1):葡萄糖3 g、各种氮源10 g、K₂HPO₄ 3 g、MgSO₄· 7H₂O 1 g, 蒸馏水1 000 mL、pH自然。

1.2.1 酸枣叶片内生菌的筛选

采集新鲜野生酸枣叶片用自来水冲洗, 在无菌条件下, 用无菌滤纸吸干水分, 操作为:无菌条件下95%乙醇中浸泡3 min→ 无菌水冲洗2次→ 0.1%升汞浸泡3 min→ 75%乙醇浸泡30 s→ 无菌水冲洗4~6次, 接着按以下两种方法进行试验:(1)组织分离法:无菌刀片将叶片切成大小为0.5 cm块, 接种于5种培养基平板上。(2)研磨涂布法:将材料放入无菌研钵中并加入5 mL无菌水研磨, 静置10 min, 取其上层液和残渣, 分别涂布于5种培养基平板上, 以上各处理均重复3次, 接种后的培养基分别放置在28 ° C和32 ° C的恒温培养箱中培养5~7 d, 同时取最后1次冲洗液涂布于PDA培养基平板上, 作为对照, 如对照平板无菌长出即表明消毒彻底, 则筛选的菌为酸枣体的内生菌。待观察到实验材料边缘有菌长出, 根据颜色和形态的差异挑取不同菌落, 四区划线纯化, 直至得到单菌落, 斜面保存备用。

1.2.2 内生菌抑菌活性测定

挑取备用斜面上的菌种复壮, 无菌条件下取直径为10 mm的复壮菌株的菌饼3~5个, 接种于已灭菌的PDA液体培养基中, 置于32 ℃恒温振荡培养器中以160 r· min^-1培养18~24 h。无菌条件下, 用无菌棉签将致病菌株涂满牛肉膏固体培养基, 接着用直径10 mm的无菌打孔器在涂满致病菌的培养基上打孔并注入内生菌发酵液, 对照组在孔中注入无菌水, 试验组设置3个重复, 置于32 ℃恒温培养箱培养2~4 d后观察并测量抑菌圈直径。发酵产物抑菌活性测定参考文献^[22]。

1.2.3 菌种鉴定

生理生化鉴定:筛选的内生菌菌株进行革兰氏染色、甲基红测定、V-P 测定、淀粉水解、吲哚产生和柠檬酸利用检测试验, 试验测定方法及初步鉴定方法参考《常见细菌系统鉴定手册》^[23]。

16S rRNA鉴定:采用菌落PCR^[24]方法扩增菌株C-22-1的16S rDNA, 采用基因保守序列通用引物, P₁(5’ -CGGGATCCAGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT-3’ )和P₆ (5’ -CGGGATCCTACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3’ )进行 PCR扩增, 50 μ L 反应体系:2× Es Taq Masterase 25 μ L, 上下游引物各 1 μ L(10 μ mol· L^-1), 模板DNA 1 μ L, 无菌双蒸水补足至反应总体积50 μ L。反应条件:94 ℃预变性2 min; 94 ℃变性30 s, 60 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s, 30个循环; 72 ℃终延伸7 min; 4 ℃保存。获得的 16S r RNA 基因序列提交到NCBI的GenBank基因库, 进行BLAST比对, 与数据库中的已知序列进行同源性分析, 运用MEGA 6.06软件生成NJ进化树。

1.2.4 代谢产物的分离提取

将菌株C-22-1扩大培养, 无菌条件下, 取直径1 mm的内生菌菌饼4~5个, 接种于含200 mL的发酵液培养基中, 接种25瓶, 置于32 ° C、160 r· min^-1摇床中振荡培养7 d。将发酵液离心去菌体, 收集并浓缩菌液, 将5 L的发酵液浓缩至300 mL。浓缩后的发酵液与70%乙醇按体积比1:9混合后浸泡2 h, 40 ° C超声处理10 min, 收集液体, 浓缩, 用正丁醇进行萃取, 浓缩, 再用正丁醇反复萃取2次, 收集液体并用砂芯过滤装置过滤, 最后进行浓缩并收集。

1.2.5 C-22-1发酵产物的定性试验

在研究C-22-1菌株所产皂苷的生物活性之前, 首先通过皂苷的通性进行定性试验, 确定C-22-1菌株发酵产物的总皂苷中含有皂苷类物质, 从而对其进行下一步研究。泡沫试验、浓硫酸-乙酸反应、氯仿-浓硫酸反应、香草醛-高氯酸反应参考邵青^[25]的方法进行定性试验。

HPLC检测:甲醇分别溶解标准品、样品于容量瓶中备用。

皂苷检测:色谱柱为Kromasil C18(5 μ m, 4.6 mm× 150 mm); 流动相:V(甲醇):V(0.2%磷酸)=50:50; 流速0.8 mL· min^-1; 检测波长210 nm; 柱温25 ° C; 进样量10 μ L。

1.2.6 菌株发酵条件优化

单因素试验:菌株C-22-1分别接种于以葡萄糖、甘露醇、蔗糖、麦芽糖、淀粉为碳源的液体培养基和以蛋白胨、酵母膏、硝酸钠、硫酸铵、硝酸铵为氮源的液体培养基中, 在32 ° C, 恒温振荡培养器中以160 r· min^-1的转速培养4 d后取出备用。以金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)为指示菌, 参照1.2.2节的方法进行抑菌活性测定, 设置3重复。选出最佳碳源、氮源的培养基为发酵培养基, 发酵时间按5、6、7、8、9 d, 参照1.2.2节进行试验。

响应面试验设计:为了优化发酵条件, 在单因素试验的基础上, 采用Design-Expert试验设计软件对菌株C-22-1的发酵条件进行优化, 以对金黄色葡萄球菌的抑菌圈大小为响应值(Y), 对碳、氮源和发酵时间3个因素设计3因素3水平的Box-Behnken中心组合试验因素与水平(表2)。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 响应面设计表 Table 2 Response surface design 水平 Level A, 葡萄糖 A, Glucose B, 酵母膏 B, Yeast extract C, 时间 C, Fermentation time/d -1 3 8 7.5 0 5 10 8.0 1 5 12 8.5

表2 响应面设计表 Table 2 Response surface design

采用组织分离法和研磨涂布法从酸枣叶片组织中共分离得到23株内生菌, 编号为C-01-1至C-23-1, C-22-1的发酵液的抑菌效果好, 对7种人体常见致病菌均有抑制作用, 除对白色念球菌(Monilia albican)的抑菌圈直径为12 mm外, 对其他病原菌的抑菌圈直径均大于16 mm, 抑菌活性强, 所以选择其作进一步研究。

对所分离的内生菌的抑菌活性进行初步筛选, 其中菌株C-22-1对7种人体常见致病菌的抑制效果均较好(表3), 因此选择其进行后续试验。同时发酵产物对人体常见致病菌的抑菌活性测定结果(图1)显示, 4号致病菌(福氏痢疾杆菌Shigella flexneri)的最低抑制浓度最小, 对其抑制效果最好。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 C-22-1对7种致病菌的抑制直径 Table 3 Inhibitory effect of C-22-1 on 7 kinds of pathogenic bacteria in diameter 病原菌株 Pathogen 抑菌圈直径/mm Antibiotic circle diameter/mm P-1 24.33± 1.155 ab AB P-2 21.33± 1.527 b BC P-3 23.00± 2 b AB P-4 24.33± 4.932 ab AB P-5 13.67± 2, 887 c C P-6 24.00± 4.582 ab AB P-7 29.33± 3.055 a A Different from the column data is marked with a lowercase letter, the difference was significant (P< 0.05), marked with a different capital letters, the differences were extremely significant (P< 0.01). 同列数据后标有不同小写字母者表示差异显著(P< 0.05), 标有不同大写字母者表示差异极显著(P< 0.01)。

表3 C-22-1对7种致病菌的抑制直径 Table 3 Inhibitory effect of C-22-1 on 7 kinds of pathogenic bacteria in diameter

图1

Fig.1

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	图1 C-22-1产物对5种致病菌的抑制直径 1, 大肠埃希菌(Escherichia coli); 2, 伤寒杆菌 (Salmonella typhi); 3, 柠檬色葡萄球菌(Staphylococcus citreus); 4, 福氏痢疾杆菌 (Shigella flexneri); 5, 白色念球菌(Monilia albican)Fig.1 Inhibitory effect of C-22-1 on 5 kinds of pathogenic bacteria in diameter

菌株C-22-1的菌落特征是表面粗糙, 扁平, 菌落不规则, 菌株C-22-1的细胞呈直杆状, 菌落圆形, 乳白色, 边缘整齐, 光滑; 菌株C-22-1的V.P、柠檬酸盐反应均为阴性, 产生吲哚、能水解淀粉, 甲基红试验显阳性。菌株C-22-1的16S rDNA序列(GenBank登录号KY393358)与NCBI数据库进行比对分析, 与其同源性较高的菌株均属于芽孢杆菌属, 通过构建的系统发育树聚类分析可以看出, 菌株C-22-1与Bacillus gaemokensis KCTC 13318 (登录号LTAQ01000012)属于同一分支即它们有可能为同一类群(图2)。综合形态、结构、生理生化特征和同源性分析, 菌株C-22-1为蜡状芽孢杆菌。

图2

Fig.2

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	图2 菌株C-22-1的16S rDNA基因系统发育树Fig.2 Phylogenntic tree of strain C-22-1 based on 16S rDNA gene sequence

(1)泡沫试验:样品产生了肥皂样泡沫, 且15 min后泡沫仍未消失, 空白对照处理虽然也出现泡沫, 但量极少且在30 s内消失, 此结果也可以初步说明C-22-1粗皂苷样品中可能含有皂苷。

(2)浓硫酸-乙酸反应:试管内显示红色, 并未出现污绿色, 说明样品中含有三萜皂苷。

(3)氯仿-浓硫酸反应:试验结果显示溶液出现分层, 在氯仿层颜色为浅红色, 硫酸层出现绿色的荧光。空白对照试验则无此色泽变化。

(4)香草醛-高氯酸反应:试管溶液最终显示红色。香草醛-高氯酸反应是皂苷类物质的显色方法, 高氯酸的酸性极强, 可与皂苷发生氧化反应使其脱氢, 再与香草醛作用继而形成特征性的红色。

(5)HPLC检测:由图3-a-可以发现, 标准品的出峰时间大约在3.762 min, 受样品中杂质等干扰的影响, 两个图谱存在一定的差别, 但两图谱就总体对比而言, C-22-1正丁醇部位的样品的出峰时间和柴胡皂苷A标准品的出峰时间大致相同(图3-b), 因此可以初步判定C-22-1正丁醇部位提取的样品中含有皂苷类物质。

图3

Fig.3

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	图3 HPLC色谱图 a, 柴胡皂苷A标准品的HPLC色谱图; b, C-22-1正丁醇部位提取的样品的HPLC色谱图Fig.3 High performance liquid chromatography (HPLC) figure a, Saiko saponin A standard HPLC chromatogram; b, C-22-1 N-butanol extraction HPLC chromatogram of the sample

由图4-a可知, 菌株C-22-1以葡萄糖为碳源时抑菌圈最大, 故最优碳源选为葡萄糖; 由图4-b可以看出, 菌株C-22-1以酵母膏为氮源时抑菌圈最大, 因此最佳氮源为酵母膏; 由图4-c可知, 菌株C-22-1在发酵前8 d抑菌圈也呈上升趋势, 第9天开始下降, 因此最佳发酵时间为8 d。

图4

Fig.4

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图4 不同碳源、氮源、时间对菌株C-22-1抑菌活性的影响Fig.4 Effect of different carbon source, nitrogen source and time on antibacterial activity of strain C-22-1

回归模型P< 0.01表明, 回归模型极显著; 失拟项P=0.392, 不显著, 说明该模型成立, 回归模型中一次项A、二次项A²、B²、C²以及AC的交互作用对金黄色葡萄球菌的抑菌圈的影响极显著(P< 0.01)。

响应曲面能直观地反映出各因素交互作用对响应值的影响, 交互作用不显著时, 表现为曲线较为平滑, 近似圆形, 交互作用极显著时表现为曲线较陡, 接近椭圆形。由图5可以看出, A和B、C和D的交互作用不显著, A和C的交互作用显著, 与表4结果基本一致。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 回归模型方差分析 Table 4 Regression model variance analysis 变异源 Source 平方和 SS 自由度 df 均方 MS F值 F value P值 P value 显著性 Significance 模型Model 15.10991176 9 1.678879085 16.80079141 0.0006 Significant A-葡萄糖 2.31125 1 2.31125 24.9095458 0.0016 * * B-酵母膏 0.10125 1 0.10125 1.091224018 0.3309 C-时间 0.405 1 0.405 4.364896074 0.0751 AB 0.0025 1 0.0025 0.026943803 0.8743 AC 0.81 1 0.81 8.729792148 0.0013 * * BC 0.09 1 0.09 0.969976905 0.3575 A^2 14.13918421 1 14.13918421 152.3853572 < 0.0001 * * B^2 6.9255 1 6.9255 74.63972286 < 0.0001 * * C^2 2.107605263 1 2.107605263 22.71476034 0.0020 * * 残差Residual 0.6495 7 0.092785714 失拟项Lack of fit 0.2575 3 0.085833333 0.87585034 0.5244 not significant 纯误差Pure error 0.392 4 0.098 总误差Cor total 29.82117647 16

表4 回归模型方差分析 Table 4 Regression model variance analysis

图5

Fig.5

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图5 葡萄糖、酵母膏和发酵时间对金黄色葡萄球菌的抑菌圈的响应曲面Fig.5 Response surface of glucose, yeast extract and fermentation time

利用Design-Expert 8.06软件得出菌株C-22-1的最佳发酵条件为葡萄糖4.28 g· L^-1, 酵母膏10.12 g· L^-1, 发酵时间8.01 d, 考虑到实际操作, 将最佳发酵条件设定为葡萄糖4.30 g· L^-1, 酵母膏10 g· L^-1, 发酵时间8 d。

表5

Table 5

表5(Table 5)

表5 方差分析其他参考项 Table 5 Other variance analysis references 参考项 Reference items 数值 Value 参考项 Reference items 数值 Value 标准偏差 Std. Dev. 0.304607476 R-Squared 0.978220175 Mean 29.54117647 Adj R-Squared 0.950217543 C.V.% 1.031128452 Pred R-Squared 0.841304048 PRESS 4.7325 Adeq Precision 16.2226991

表5 方差分析其他参考项 Table 5 Other variance analysis references