BL21(DE3)菌株和pET-32a购自Novagen公司; 重组菌株BL21(DE3)(pXETA02)由韶关学院许崇波教授惠赠; 活性检测用的小鼠购自吉林大学实验动物中心。

QDL2000 DNA分子量标记、Ex Taq酶、T₄ DNA连接酶、限制性核酸内切酶(EcoRⅠ 、BamHⅠ 、NcoⅠ )和IPTG购自宝生物工程有限公司; 氨苄西林(Amp)和卡那霉素购自Sigma公司; Wizard PCR preps DNA Purification System购自Promega公司。

根据Titball等^[10]报道的PLC1-250基因序列设计PCR扩增引物并合成, 引物序列为:上游引物P1, 5'-CATGCCATGGCATGGGATGGAAAGATTGAT-3', 下游引物P2, 5'-CCGGAATTCTGATGGATCATTACCCTC-3'。上游引物和下游引物分别含EcoRⅠ 和NcoⅠ 的酶切位点及保护性碱基。利用这对PCR引物从重组质粒pXETA02扩增出α 毒素氨基端PLC1-250基因片段。参照文献^[11]的方法, NcoⅠ 和EcoRⅠ 分别酶切PCR产物和pET-32a载体, 16 ℃ T₄ DNA连接酶连接过夜。随后将连接产物转化至感受态细胞BL21(DE3)中, 利用Amp抗性筛选出阳性克隆, 提取重组表达质粒pN-PLC1-250, 并进行酶切鉴定和测序。

按文献^[11]报道的方法进行。

按Geourjon等^[12]介绍的方法, 在EXPASY服务器(http://www. expasy. org/ tools)上利用SOPMA法预测α 毒素和PLC1-250蛋白二级结构。

以蛋白质结构数据库(PDB)提供的α 毒素三维结晶结构(3D)为模板, 使用EXPASY服务器(http:// www.expasy.org/swissmod/SWISS-MODEL.html)对α 毒素和PLC1-250蛋白3D结构进行同源模型构建, 并用Rasmol软件绘制其3D结构图^[13]。

使用J810-150S型圆二色谱仪测定α 毒素和PLC1-250蛋白的CD光谱, 并记录数据^[14]。

将A型魏氏梭菌标准株C57-1的培养上清液和重组菌株BL21(DE3)(pN-PLC1-250)的菌体、菌体裂解物和上清液分别接种于卵黄琼脂平板和血琼脂平板, 观察是否具有磷脂酶C活性和溶血活性^[15]。将100 μ L含卵磷脂的卵黄稀释液分别加入3只Eppendorf管, 再分别加入100 μ L生理盐水、PLC1-250蛋白和α 毒素进行混匀, 37 ℃恒温孵育24 h, 通过观察浑浊环出现与否来检测是否具有磷脂酶C活性^[16]。另取80只小鼠分为4组, 每组20只, 将A型魏氏梭菌标准株C57-1和5× 10⁹个重组菌株BL21(DE3) (pN -PLC1-250)经口服或腹腔注射到小鼠体内, 观察临床症状并进行病理检测^[17]。

利用PCR扩增技术, 以pXETA02质粒为模板, 扩增出α 毒素氨基端0.75 kb的PLC1-250基因, NcoⅠ 和EcoRⅠ 分别酶切PCR产物和pET-32a载体, 连接后转化至BL21(DE3)中, 构建含PLC1-250基因表达质粒的重组菌株BL21(DE3)(pN-PLC1-250), 提取重组质粒pN-PLC1-250, 并用限制性核酸内切酶NcoⅠ /EcoRⅠ 进行酶切鉴定, 结果证实重组质粒pN-PLC1-250含有PLC1-250基因, 核苷酸序列分析表明其基因序列和阅读框架均正确(图1)。

图1

Fig.1

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	图1 重组质粒pN-PLC1-250酶切鉴定结果 M, DL2000 DNA分子量标准; 1, pN-PLC1-250+NcoⅠ /EcoRⅠ Fig.1 Identification of recombinant plasmid pN-PLC1-250 by enzyme digestion M, DL2000 DNA marker; 1, pN-PLC1-250+NcoⅠ /EcoRⅠ

重组菌株BL21(DE3)(pN-PLC1-250)IPTG诱导4 h后取样, 进行SDS-PAGE分析。结果表明, PLC1-250基因在BL21(DE3)宿主菌中得以表达, 经凝胶成像仪扫描分析, PLC1-250蛋白表达量占菌体总蛋白相对含量的18.76%(图2)。

图2

Fig.2

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	图2 PLC1-250基因表达产物SDS-PAGE结果 M, 低分子量蛋白标记; 1, BL21(DE3)(pET-32a)全菌体; 2, BL21(DE3)(pN-PLC1-250)全菌体; 3, BL21(DE3)(pN-PLC1-250)包涵体Fig.2 SDS-PAGE analysis of expressed products of recombinant strain BL21(DE3)(pN-PLC1-250) M, Low molecular protein marker; 1, Total cell lysate of BL21(DE3)(pET-32a); 2, Total cell lysate of BL21(DE3)(pN-PLC1-250); 3, The inclusion bodies of BL21(DE3)(pN-PLC1-250)

应用EXPASY服务器(http://www. expasy.org/ tools)上的SOPMA法预测α 毒素和PLC1-250蛋白分子的二级结构(图3)。α 毒素蛋白中:α 螺旋118个, 占31.9%; β 折叠78个, 占21.1%; β 转角44个, 占11.9%; 无规则卷曲130个, 占35.1%。PLC1-250蛋白中:α 螺旋97个, 占38.8%; β 折叠42个, 占16.8%; β 转角36个, 占14.4%; 无规则卷曲75个, 占30.0%。预测结果表明, PLC1-250蛋白分子的二级结构与α 毒素氨基端部分的二级结构相比发生了一些变化, 其二级结构主要为α 螺旋和无规则卷曲, 二者共占68.8%。

图3

Fig.3

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	图3 α 毒素和PLC1-250蛋白分子的二级结构预测及比较 h, α 螺旋; e, β 折叠; t, β 转角; c, 无规则卷曲Fig.3 Prediction and comparison of the second structure of α -toxin and PLC1-250 protein h, alpha helix; e, beta extended strand; t, beta turn; c, random coil

以蛋白质结构数据库(PDB)提供的α 毒素的三维结晶结构(3D)作为模板, 利用EXPASY服务器(http:// www.expasy.org/swissmod/SWISS-MODEL.html)对α 毒素和PLC1-250蛋白3D结构进行同源模型构建, 并用Rasmol软件绘制其3D结构图。结果显示, α 毒素蛋白共有9段α 螺旋和8段β 折叠, PLC1-250蛋白3D结构也包括9段α 螺旋, 与α 毒素蛋白氨基端部分的3D结构相类似(图4)。

图4

Fig.4

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	图4 α 毒素(A)和PLC1-250蛋白(B)分子3D结构预测Fig.4 Prediction of the three-dimensional structure (3D) of α -toxin (A) and PLC1-250 protein(B)

借助圆二色谱仪测定α 毒素和PLC1-250蛋白分子的CD光谱(图5、表1), 结果显示, 二者的CD光谱相类似。

图5

Fig.5

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	图5 α 毒素(A)和PLC1-250蛋白分子(B)的圆二色谱图Fig.5 Circular dichroism (CD) spectrum of α -toxin (A) and PLC1-250 protein (B)

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 圆二色谱测定的α 毒素和PLC1-250蛋白分子二级结构成分比较 Table 1 Comparison of secondary structure elements of α -toxin and PLC1-250 protein based on circular dichroism spectrum 成分 Element α 毒素α -toxin α 毒素氨基端PLC1-250蛋白PLC1-250 of α -toxin amino-terminal 氨基配数量 Quantity of amino acids 所占比例 Proportion/% 氨基配数量 Quantity of amino acids 所占比例 Proportion/% α -螺旋Alpha helix 120 32.5 98 39.2 β -折叠Beta extended strand 76 20.5 38 15.2 β -转角Beta turn 43 11.6 38 15.2 随机卷曲Random coil 131 35.4 76 30.4

表1 圆二色谱测定的α 毒素和PLC1-250蛋白分子二级结构成分比较 Table 1 Comparison of secondary structure elements of α -toxin and PLC1-250 protein based on circular dichroism spectrum

A型魏氏梭菌标准株C57-1培养上清液和重组菌株BL21(DE3)(pN-PLC1-250)的培养上清液及菌体培养物在卵黄琼脂平板上均出现了特征性浑浊环, 而BL21(DE3) (pN-PLC1-250)菌体裂解物并没有出现特征性浑浊环, 这说明PLC1-250是以分泌形式表达的, 并且能分解卵黄琼脂平板中的卵磷脂。磷脂酶C活性检测结果显示(图6):出现浑浊环的1号和2号管均能分解卵黄中的卵磷脂。上述结果表明, PLC1-250蛋白与α 毒素一样具有磷脂酶C活性。

图6

Fig.6

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	图6 α 毒素和PLC1-250蛋白的磷脂酶C活性检测 1, α 毒素; 2, PLC1-250蛋白; 3, 生理盐水Fig.6 Detection of phosphalipase C activity of α -toxin and PLC1-250 1, α -toxin; 2, PLC1-250 protein; 3, Physiological saline water

在血琼脂平板上, A型魏氏梭菌标准株C57-1培养上清出现了溶血环, 而重组菌株BL21(DE3)(pN-PLC1-250)的培养上清液、菌体培养物及菌体裂解物均没出现溶血环, 表明PLC1-250表达产物不具备α 毒素的溶血活性。口服和腹腔注射重组菌株BL21(DE3)(pN-PLC1-250)的小鼠(试验组), 观察3周后没有出现临床症状, 且剖检后组织学检查显示, 无病理变化(图7), 表明重组菌株BL21(DE3) (pN-PLC1-250)已经没有致病性, 而对照组(A型魏氏梭菌标准株C57-1)则出现明显的临床症状, 且剖检后组织学检查显示, 发生病理变化(图8)。

图7

Fig.7

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	图7 试验组小鼠组织学检查结果 A, 空肠; B, 肝脏; C, 肺脏; D, 心脏。图8同Fig.7 Histological examination results of mice in the experimental group A, Jejunum; B, Liver; C, Lung; D, Heart. The same as in Fig. 8

图8

Fig.8

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	图8 对照组小鼠组织学检查结果Fig.8 Histological examination results of mice in the control group