引用本文
蒋晗, 刘娇, 郦萍, 顾青. 乳酸菌细菌素plantaricin JK的异源表达、分离纯化及抗菌活性[J]. 浙江农业学报, 2017,29(2): 332-337.
JIANG Han, LIU Jiao, LI Ping, GU Qing. Heterologous expression and purification of plantaricin JK and analysis of its antibacterial activity[J]. ACTA AGRICULTURAE ZHEJIANGENSIS, 2017,29(2): 332-337.
  
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乳酸菌细菌素plantaricin JK的异源表达、分离纯化及抗菌活性
蒋晗1,2, 刘娇1, 郦萍1, 顾青1,*
1.浙江工商大学 浙江省食品微生物技术研究重点实验室,浙江 杭州 310018
2.中国计量大学 浙江省海洋食品品质及危害物控制技术重点实验室,浙江 杭州 310018
*通信作者,顾青,E-mail:guqing2002@hotmail.com

作者简介:蒋晗(1987—),女,浙江杭州人,博士研究生,研究方向为食品生物技术。E-mail:jianghan825@126.com

收稿日期: 2016-12-12
基金资助: 国家国际科技合作专项(2013DFA32330); 国家自然科学基金项目(31540044,31271821); 国家高技术研究发展计划(863计划) (2014AA022210-08)
摘要

为获得高产双肽细菌素plantaricin JK,通过PCR扩增获得 pln J和 pln K基因,构建表达载体pET32a(+)- pln J-BL21(DE3)和pET32a(+)- pln K-BL21(DE3),经IPTG诱导表达后,利用镍亲和层析柱进行分离纯化,重组蛋白经肠激酶酶切纯化后,细菌素pln J和pln K的产量分别为2~3、5~8 mg·L-1。利用牛津杯平板抑菌法研究抗菌活性,结果显示细菌素pln J和pln K对柠檬色葡萄球菌( Staphylococcus citreus)、大肠埃希菌( Escherichia coli)、藤黄微球菌( Micrococcus luteus)和单核细胞增生李斯特菌( Listeria monocytogenes)都有明显抑制作用,且双肽细菌素plantaricin JK的抑菌圈直径大于单独的细菌素pln J或pln K。

关键词: plantaricin JK; 异源表达; 分离纯化; 抗菌活性
中图分类号:Q786 文献标志码:A 文章编号:1004-1524(2017)02-0332-06 doi: 10.3969/j.issn.1004-1524.2017.02.21
Heterologous expression and purification of plantaricin JK and analysis of its antibacterial activity
JIANG Han1,2, LIU Jiao1, LI Ping1, GU Qing1,*
1. Key Laboratory for Food Microbial Technology of Zhejiang Province, Zhejiang Gongshang University, Hangzhou 310018, China
2. Key Laboratory of Marine Food Quality and Hazard Controlling Technology of Zhejiang Province, China Jiliang University, Hangzhou 310018, China
Abstract

In order to obtain the high-yield two-peptide bacteriocin plantaricin JK, pln J and pln K were successfully heterologously expressed in Escherichia coli BL21 (DE3), and were induced by IPTG. Then the two peptides were expressed as His6-tag fusion proteins and were separated by Ni2+ chelating affinity chromatography. The fusion proteins were cleaved by enterokinase and further purified. The yields of pln J and pln K were around 2-3 and 5-8 mg·L-1. The antibacterial activity of the peptides against 4 indicator strains, i.e. Staphylococcus citreus, Escherichia coli, Micrococcus luteus, Listeria monocytogenes, was analyzed by agar diffusion method. It was shown that pln J and pln K both could inhibit the growth of the 4 indicator strains, but plantaricin JK had larger inhibition zone than pln J or pln K alone.

Keyword: plantaricin JK; heterologous expression; expression and purification; antibacterial activity

乳酸菌(lactic acid bacteria, LAB)是美国食品与药品监督管理局(FDA)认定的食品级微生物, 乳酸菌及其代谢产物一般被认为是安全的(generally regarded as safe, GRAS)[1]。乳酸菌细菌素作为一种天然的食品防腐剂, 其原始产生菌对细菌素具有自身免疫性, 又因为其本质为蛋白质或多肽, 所以能够被胃肠道内的蛋白酶降解, 具有高效、无毒、无残留、无抗药性、耐酸、耐高温等特点, 受到各国科学家的关注[2, 3]。目前, 已在乳球菌、片球菌、双歧杆菌、肠球菌、明串珠菌、链球菌、肉食杆菌、乳杆菌等8属的乳酸菌中发现40多种乳酸菌细菌素[4]。

笔者所在实验室团队从健康婴儿粪便中筛选到1株具有良好抑菌活性的新型植物乳杆菌(Lactobacillμ s plantarum) ZJ316, 经全基因组测序, 发现其基因簇中含有编码二肽细菌素plantaricin JK的基因pln J和pln K[5]。天然plantaricin JK的分离纯化方法复杂, 表达困难且产量很低, 不利于大规模生产和后续深入研究, 化学合成细菌素效率高, 可用作深入研究, 但成本太高不利于市场应用; 而异源表达在提高细菌素产量上提供了新的可能。在所有的表达宿主中, 大肠埃希菌(Escherichia coli)被认为是遗传背景最清楚、表达系统最成熟完善的基因工程菌。Plantaricin JK属于Class Ⅱ b类细菌素, 少有翻译后修饰, 是基因工程技术的主要研究对象。本研究拟以细菌素pln J和pln K为研究对象, 通过基因工程手段将其在E. coli BL21 (DE3)中表达, 形成带His标签的融合蛋白, 经镍柱纯化和肠激酶酶切分离纯化后, 再采用RT-HPLC纯化, 获得高产高纯并有抑菌活性的双肽细菌素plantaricin JK, 为其作为生物防腐剂投入市场提供可能。

1 材料与方法
1.1 试验材料

1.1.1 菌株与载体

宿主菌E. coli DH5α 购自宝生物工程(大连)有限公司, E. coli BL21 (DE3)购自New England Biolabs (NEB, USA)公司。克隆载体pUC57和表达载体pET 32a(+)购自美国Novagen公司。抗菌活性检测菌株藤黄微球菌(Micrococcus luteus), 柠檬色葡萄球菌(Staphylococcus citreus), 单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)和大肠埃希菌(E. coli)均为本实验室保存。

1.1.2 主要仪器

蛋白质快速纯化系统AKTA purifier 100, GE; 蛋白质垂直电泳系统, Bio-Rad; 台式高速冷冻离心机3K30, Sigma; 恒温振荡器 DHZ-C-1, 太仓市实验设备厂; 超净台SW-CJ-2FD, 上海博迅; 高压细胞破碎仪AH-1500, 德国力士乐。

1.1.3 主要试剂

DNA电泳和蛋白电泳所需试剂均购自生工生物工程(上海)有限公司。PCR试剂购自Takara公司。SanPrep 柱式质粒DNA小量抽提试剂盒、SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒、SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒均购自生工生物工程(上海)有限公司。肠激酶购自英国New England Biolabs (NEB)公司。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.2 试验方法

1.2.1 基因片段设计与合成

基因片段pln J和pln K的序列来自于实验室分离的植物乳杆菌ZJ316, 去除前导序列, 添加1个肠激酶位点(用斜体表示)(5’ -GATGATGATGATAAA-3’ )和2个限制性内切酶位点(用下划线表示)— — Kpn Ⅰ (-GGTACC-), Nco Ⅰ (-CCATGG-), 两端最后加入保护碱基, 并由生工生物工程(上海)有限公司合成。完整序列如下。

pln J: CGGGGTACCGATGATGATGATAAAGG-

CGCTTGGAAAAATTTCTGGTCTAGTTTAAGAAAA-

GGATTTTATGATGGCGAAGCTGGCAGAGCAATC-

CGTCGTTAACCATGGCATG;

pln K: CGGGGTACCGATGATGATGATAAACG-

TCGGAGTCGTAAAAATGGAATTGGATACGCTAT-

TGGTTATGCGTTTGGCGCGGTTGAACGGGCCGT-

GCTTGGTGGTTCAAGGGATTATAATAAGTGACC-

ATGGCATG。

1.2.2 引物设计及 PCR扩增

根据合成的碱基序列设计相应引物。Kpn Ⅰ 和 NcoⅠ 酶切位点用下划线表示。pln J的引物:P1, 5’ -CGGGGTACCGATGATGATGATAAAGGC-3’ ; P2, 5’ -CATGCCATGGTTAACGACGGATTG-3’ 。pln K的引物:P3, 5’ -CGGGGTACCGATGATGATGATAAAC-3’ ; P4, 5’ -CATGCCATGGT CACTTATTATAATCCC-3’ 。PCR扩增体系(50 μ L): PrimeSTAR HS DNApolymerase 0.5 μ L, 5× PS buffer (Mg2+ plus) 10 μ L, dNTPs (10 mmol· L-1) 4 μ L, 上下游引物(10 μ mol· L-1)各1.5 μ L, 模板DNA 1.5 μ L。扩增程序:94 ℃预变性5 min; 94 ℃变性30 s, 56 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s, 35个循环; 72 ℃延伸10 min。产物经琼脂糖凝胶电泳检测分子量和纯度。

1.2.3 原核表达载体构建

PCR 产物与pET 32a(+)质粒分别进行Kpn Ⅰ 和 Nco Ⅰ 双酶切, 酶切产物纯化回收, 经T4-DNA连接酶16 ℃过夜连接, 转化至E. coli DH5α 感受态细胞, 涂布于氨苄抗性琼脂平板, 37 ℃过夜培养, 选择阳性克隆菌株转化至表达菌株E. coli BL21 (DE3), 再次涂布于氨苄抗性琼脂平板, 37 ℃过夜培养, 选择阳性克隆菌株进行菌落PCR鉴定, 提取质粒进行Kpn Ⅰ 和 Nco Ⅰ 双酶切鉴定, 后将阳性克隆送至生工生物工程(上海)有限公司测序。

1.2.4 融合蛋白表达

重组菌株pET32a(+)-pln J-BL21(DE3)和pET32a(+)-pln K-BL21(DE3)分别以1%的接种量接种至50 mL LB液体培养基(含氨苄)中, 200 r· min-1, 37 ℃过夜培养。将新鲜菌液以1%的接种量转接至2 L的LB液体培养基(含氨苄)中, 200 r· min-1, 37 ℃培养至菌液D600达到0.6~0.8时, 向培养基中添加异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl β -D- thiogalactoside, IPTG), 终浓度为1 mmol· L-1, 140 r· min-1, 18 ℃摇床诱导16 h。将过夜诱导的菌液8 000 r· min-1离心10 min, 收集菌体沉淀, -20 ℃备用。将收集的菌体沉淀用少量PBS缓冲液(pH为7.4)洗涤, 4 ℃, 8 000 r· min-1离心10 min, 收集菌体沉淀, 然后按照每100 mL培养基所得菌体10 mL缓冲液的比例加入预冷的PBS缓冲液重悬细胞。菌体悬液通过超高压破碎系统进行细胞破碎, 800 MPa重复破碎3次, 此时菌悬液基本澄清。以4 ℃、10 000 r· min-1、20 min的条件对菌悬液进行离心。此时可溶性表达的蛋白存在于上清中。收集上清, 经SDS-PAGE鉴定后用于后期的亲和纯化。

1.2.5 融合蛋白亲和纯化

利用5 mL HisTrap HP预装柱和AKTA Purifier蛋白纯化仪进行蛋白纯化。所有样品液采用0.22 μ m一次性针头式过滤器过滤。结合缓冲液包含20 mmol· L-1 Tris, 300 mmol· L-1氯化钠, 10 mmol· L-1咪唑, 用HCl调节pH至8.0; 洗脱缓冲液包含20 mmol· L-1 Tris, 300 mmol· L-1氯化钠, 500 mmol· L-1咪唑, 用HCl调节pH至8.0。HisTrap预装镍柱以10倍柱体积的超纯水和结合缓冲液清洗后, 洗脱缓冲液以10%~100%的梯度, 流速0.5 mL· min-1洗脱目标蛋白, 每5 mL收集1管。洗脱缓冲液100%洗脱完后, 继续跑3~5个柱体积。之后采用100%结合缓冲液、超纯水冲洗管路, 最后以20%乙醇冲洗管路, 保存HisTrap HP预装柱。收集与洗脱峰对应的收集管溶液, 进行SDS-PAGE检验, 将目标蛋白于-4 ℃冷藏暂存。

1.2.6 融合蛋白肠激酶酶切

利用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定重组蛋白浓度。利用肠激酶对重组蛋白进行酶切, 13 ℃过夜酶切 16 h。采用规格为15 mL、滤膜孔径大小为10 ku的超滤离心管对酶切产物进行初步分离, 离心条件为4 ℃, 4 800 g, 60 min。离心后下层滤液中含有目标细菌素片段。

1.2.7 pln J和pln K抑菌活性测定

将冷冻干燥得到的细菌素pln J和pln K以0.05%乙酸溶解, 终浓度为20 μ mol· L-1。利用琼脂扩散实验[6]研究单独的pln J或pln K及plantaricin JK的抗菌效果, 指示菌分别为柠檬色葡萄球菌、大肠埃希菌、藤黄微球菌和单核细胞增生李斯特菌。

2 结果与分析
2.1 pln J和pln K基因的合成及扩增

pln J和pln K的基因PCR扩增结果如图1所示, 扩增片段大小均在100~200 bp之间, 与理论值基本相符, 阴性对照则没有出现特异性片段。

图1 pln J和 pln K基因片段的PCR扩增结果
M, 分子量标记; 泳道1~2, pln J基因片段; 泳道3, 不加DNA模板的阴性对照; 泳道4~5, pln K基因片段; 泳道6, 不加DNA模板的阴性对照Fig.1 PCR amplification result of pln J and pln K gene fragments
M, Marker; Lane 1-2, Gene fragments of pln J; Lane 3, Negative control; Lane 4-5, Gene fragments of pln K; Lane 6, Negative control

2.2 原核表达质粒鉴定

重组质粒转化表达菌株E.coli BL21(DE3)后, 在氨苄抗性平板上筛选出阳性转化子。转化子在含有氨苄的LB培养基培养后, 取适量菌液作模板, 进行菌液PCR验证, PCR产物片段大小与理论值基本相符(图2)。将阳性转化子测序, 测序结果与目标基因序列一致。

图2 重组质粒菌液PCR验证
M, 分子量标记; A 中泳道1~3, pln J阳性转化子菌液PCR结果; B中泳道1~5, pln K阳性转化子PCR验证结果; B中泳道6为阴性对照Fig.2 Bacterial PCR amplification result of recombinant plasmids
M, Marker; Lane 1-3 in part A, PCR result of positive transformants of pln J; Lane 1-5 in part B, PCR result of positive transformants of pln K; Lane 6 in part B, Negative control

2.3 融合蛋白的表达和镍柱亲和纯化

对重组菌株pET32a(+)-pln J-BL21(DE3)和pET32a(+)-pln K-BL21(DE3)进行IPTG诱导表达及镍柱亲和纯化, 并做SDS-PAGE鉴定。如图3所示, 与未诱导的重组菌株相比, 诱导后重组菌株表达出目的蛋白条带。理论上, Trx-His6-pln J和Trx-His6-pln K的大小分别为22.7和23.5 ku, 图3中的目的蛋白条带均与理论值相符。经镍柱亲和纯化后的融合蛋白与未纯化时相比, 条带较为单一, 杂质已基本去除。

图3 重组融合蛋白的表达纯化及SDS-PAGE鉴定
A 中:M, 蛋白质量标记; 泳道1, Trx-His6-pln J诱导前的总蛋白; 泳道2, Trx-His6-pln J诱导后的总蛋白; 泳道3, Trx-His6-Pln J可溶性蛋白; 泳道4, 镍柱纯化的穿透峰; 泳道5~7, 镍柱纯化的洗脱峰, 即Trx-His6-pln J 目标条带。B 中:M, 蛋白质量标记; 泳道1, Trx-His6-pln K诱导前的总蛋白; 泳道2, Trx-His6-pln K诱导后的总蛋白; 泳道 3~4, Trx-His6-pln K可溶性蛋白; 泳道5, 镍柱纯化的穿透峰; 泳道6~7, 镍柱纯化的洗脱峰, 即Trx-His6-pln K目标条带Fig.3 Identification of expression and purification of recombinant fusion protein by SDS-PAGE
A: M, Marker; Lane 1, Trx-His6-pln J before induction; Lane 2; Trx-His6-pln J after induction; Lane 3, Trx-His6-pln J soluble fractions; Lane 4, Binding buffer washed proteins; Lane 5-7, Target Trx-His6-pln J. B: M, Marker; Lane 1, Trx-His6-pln K before induction; Lane 2; Trx-His6-pln K after induction; Lane 3-4, Trx-His6-pln K soluble fractions; Lane 5, Binding buffer washed proteins; Lane 6-7, Target Trx-His6-pln K

2.4 融合蛋白的肠激酶酶切

利用BCA蛋白浓度测定试剂盒及标准曲线计算出浓缩后的重组蛋白Trx-His6-pln J和Trx-His6-pln K的浓度分别为2.46和3.17 mg· mL-1。按说明书要求计算, 1 mL Trx-His6-pln J需用肠激酶7.88 μ L, 1 mL Trx-His6-pln K需用肠激酶10.14 μ L。

图4是Trx-His6-pln J和Trx-His6-pln K酶切的Tricine-SDS-PAGE鉴定结果, 在4 ku附近均有条带, 与pln J和pln K的理论大小4.6和3.5 ku相符。但pln J的条带颜色较浅, 表明经镍柱亲和纯化和肠激酶切割融合标签后, 损失较大。

图4 Trx-His6-pln J和 Trx-His6-pln K的肠激酶酶切
A中:M, 蛋白质量标记; 泳道1, 未进行肠激酶酶切的Trx-His6-pln J融合蛋白; 泳道2~3, 肠激酶酶切后的Trx-His6-pln J融合蛋白。B中:M, 蛋白质量标记; 泳道1, 未进行肠激酶酶切的Trx-His6-pln K融合蛋白; 泳道2~3, 肠激酶酶切后的Trx-His6-pln K融合蛋白Fig.4 Cleavage of enterokinase of fusion protein Trx-His6-pln J and Trx-His6-pln K
A: M, Marker; Lane 1, Trx-His6-pln J fusion before enterokinase cleavage; Lane 2-3, Trx-His6-pln J fusion after enterokinase cleavage. B: M, Marker; Lane 1, Trx-His6-pln K fusion before enterokinase cleavage; Lane 2-3, Trx-His6-pln K fusion after enterokinase cleavage

2.5 异源表达plantaricin JK的抑菌活性鉴定

以实验室保存的4株菌为指示菌, 用终浓度为20 μ mol· L-1的pln J、pln K和以pln J、pln K等摩尔混合的plantaricin JK进行琼脂扩散实验, 以0.05%乙酸为阴性对照(CK), 检测并比较其抑菌活性。抑菌圈的评价标准是直径和透明度, 越大越透明说明抑菌效果越好。结果如图5所示:阴性对照对各指标菌均无抑菌活性; 单独的细菌素pln J或pln K对大肠埃希菌均有一定的抑菌效果, 两者混合得到的双肽细菌素plantaricin JK条件下, 抑菌圈变大, 说明抑菌效果增强(图5-A); 单独的细菌素pln J或pln K对单核细胞增生李斯特菌均有一定的抑菌效果, 两者混合得到的双肽细菌素plantaricin JK条件下, 抑菌圈略变大, 圈变得更透明, 说明抑菌效果增强(图5-B); 在柠檬色葡萄球菌(图5-C)和藤黄微球菌(图5-D)上的试验结果与在大肠埃希菌、单核细胞增生李斯特菌上相似。由此推断, 异源表达的pln J 和pln K仍能保持较好的抑菌活性, 且等摩尔比混合后, 存在一定的协同作用。

图5 细菌素plantaricin JK对4种指示菌的抑菌效果
A, 大肠埃希菌; B, 单核细胞增生李斯特菌; C, 柠檬色葡萄球菌; D, 藤黄微球菌Fig.5 Antibacterial activities of plantaricin JK against 4 indicator strains
A, Escherichia coli; B, Listeria monocytogenes; C, Staphylococcus citreus; D, Micrococcus luteus

3 讨论

乳酸菌细菌素在食品防腐保鲜、饲料和医疗中的应用研究均有报道[7, 8, 9], 其中Nisin更是成为FDA认证的已大量投入商业使用的乳酸菌细菌素[10]。通过传统分离纯化手段获得细菌素的得率很低, 化学合成细菌素工业化生产成本较高。基因工程技术近几年的飞速发展使这个问题有望解决。Pediocin PA-1是最常被用于异源表达的乳酸菌细菌素, Beaulieu等[11]利用大肠埃希菌基因工程菌和Thioredoxin(Trx)标签以及肠激酶酶切位点, 最终得到有活性的纯化蛋白, 含量达到10 mg· L-1。亦有研究利用大肠埃希菌构建基因工程菌进行异源表达, 得到能够抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的Plantaricin Pln1, 得率为9~11 mg· L-1[12]。二肽细菌素Plantaricin EF通过异源表达, 得率在1~1.5 mg· L-1[13]。Plantaricin JK是Class Ⅱ b类乳酸菌细菌素, 由位于同一个操纵子的2个基因编码的寡肽pln J和pln K组成, 可利用2条寡肽的协同作用抑制多种细菌, 是潜在的天然食品防腐剂和抗生素替代品[14]。本研究通过基因工程手段成功在E. coli BL21 (DE3) 中实现pln J和pln K的异源表达, 形成带His标签的可溶性融合蛋白, 经镍柱纯化和肠激酶酶切纯化后, pln J的产量为每升培养基2~3 mg, pln K的产量为每升培养基5~8 mg。经抗菌活性实验可知, 异源表达的plantaricin JK也有很好的抑菌活性, 且pln J与pln K存在一定的协同作用。若能在今后的研究中进一步优化分离纯化方法, 将有良好的市场应用前景。

The authors have declared that no competing interests exist.

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