引用本文
杜宇, 熊翠玲, 史秀丽, 郑燕珍, 付中民, 徐细建, 陈大福, 郭睿. 意大利蜜蜂6日龄幼虫肠道内球囊菌的差异表达基因分析[J]. 浙江农业学报, 2017,29(7): 1119-1128.
DU Yu, XIONG Cuiling, SHI Xiuli, ZHENG Yanzhen, FU Zhongmin, XU Xijian, CHEN Dafu, GUO Rui. Transcriptome analysis of differentially expressed genes in Ascosphaera apis stressing the 6-day-old larval gut of Apis mellifera ligustica [J]. ACTA AGRICULTURAE ZHEJIANGENSIS, 2017,29(7): 1119-1128.  
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意大利蜜蜂6日龄幼虫肠道内球囊菌的差异表达基因分析
杜宇1, 熊翠玲1, 史秀丽2, 郑燕珍1, 付中民1, 徐细建1, 陈大福1, 郭睿1,*
1.福建农林大学 蜂学学院,福建 福州 350002
2.新疆维吾尔自治区蜂业发展中心,新疆 乌鲁木齐 830000
*通信作者,郭睿,E-mail:ruiguo@fafu.edu.cn

作者简介:杜宇(1994—),男,河北唐山人,本科生,专业为蜂学,E-mail:599195720@qq.com

收稿日期: 2016-03-08
基金资助: 现代农业产业技术体系建设专项资金(CARS-45-KXJ7); 福建农林大学科技发展资金(KF2015123); 国家级大学生创新创业项目(201610389016)
摘要

为检测蜜蜂球囊菌( Ascosphaera apis)在胁迫意大利蜜蜂( Apis mellifera ligustica,简称意蜂)幼虫后期的基因表达谱,利用RNA-seq技术对纯培养的球囊菌孢子及球囊菌胁迫的意蜂6日龄幼虫肠道进行深度测序。通过比较处理组和对照组得到21 361个差异表达基因(DEGs),包括15 306个上调基因和6 055个下调基因。GO富集分析结果显示,上调基因富集于39个GO条目(term),基因富集数最多的为细胞进程(2 416 unigenes)、细胞(2 408 unigenes)和细胞组件(2 408 unigenes);下调基因富集于38个GO term,基因富集数最多的为代谢进程(1 227 unigenes)、细胞进程(1 185 unigenes)和细胞(1 131 unigenes)。KEGG代谢通路富集分析结果显示,上调基因富集在119个通路,其中基因富集数最多的是核糖体(221 unigenes),其次为内质网中蛋白加工(190 unigenes)和内吞作用(177 unigenes);下调基因富集在113个通路上,基因富集数最多的是核糖体(144 unigenes),其次为RNA转运(113 unigenes)和氨基酸生物合成(108 unigenes)。进一步分析发现,富集在MAPK信号通路上的64个基因上调表达,说明该通路在球囊菌胁迫后期被激活。研究结果不仅为揭示球囊菌在胁迫意蜂幼虫后期的病原-宿主互作提供了重要信息,也为阐明球囊菌致病的分子机制奠定了基础。

关键词: 球囊菌; 意大利蜜蜂; 幼虫肠道; 差异表达基因; RNA-seq
中图分类号:S895.1 文献标志码:A 文章编号:1004-1524(2017)07-1119-10 doi: 10.3969/j.issn.1004-1524.2017.07.09
Transcriptome analysis of differentially expressed genes in Ascosphaera apis stressing the 6-day-old larval gut of Apis mellifera ligustica
DU Yu1, XIONG Cuiling1, SHI Xiuli2, ZHENG Yanzhen1, FU Zhongmin1, XU Xijian1, CHEN Dafu1, GUO Rui1,*
1. College of Bee Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China
2. Apicultural Development Centre in Xinjiang Uygur Autonomous Region, Urumqi 830000, China
Abstract

The purified Ascosphaera apis spores and the 6-day-old larval gut of Apis mellifera ligustica under the stress of A. apis were sequenced using RNA-seq technology to detect gene expression patterns of the fungal pathogen. A total of 21 361 differentially expressed genes (DEGs) were obtained, including 15 306 up-regulated genes and 6 055 down-regulated genes. GO enrichment analysis showed that the up-regulated genes were enriched in 39 terms, among them the mostly enriched ones were cellular process (2 416 unigenes), cell (2 408 unigenes) and cell part (2 408 unigenes); the down-regulated genes were enriched in 38 terms, and the mostly enriched ones were metabolic process (1 227 unigenes), cellular process (1 185 unigenes) and cell (1 131 unigenes). KEGG enrichment analysis displayed that the up-regulated genes were enriched in 119 pathways, and the largest groups were ribosome (221 unigenes), protein processing in endoplasmic reticulum (190 unigenes) and endocytosis (177 unigenes); the down-regulated genes were enriched in 113 pathways, and the mostly enriched ones were ribosome (144 unigenes), RNA transport (113 unigenes) as well as biosynthesis of amino acid (108 unigenes). Furthermore, 64 up-regulated genes were found to be enriched in MAPK signaling pathway, suggesting that it was induced to a large extent. The data not only provided key information for uncovering the pathogen-host interaction during the late stage of the stress of A. apis on A. m. ligustica larvae, but also laid some foundation for clarifying molecular mechanisms regulating the pathogenesis of A. apis.

Keyword: Ascosphaera apis; Apis mellifera ligustica; larval gut; DEGs; RNA-seq

蜜蜂是世界范围内最重要的授粉昆虫, 其在经济创收和生态保护等方面均发挥着重要作用[1]。蜜蜂作为社会学模式昆虫, 在行为学、生态学、遗传学和流行病学等领域具有很高的研究价值[2]。蜜蜂易遭受细菌、真菌、病毒、寄生虫及农药的危害[3]。其中, 白垩病是最具代表性的蜜蜂真菌病, 是一种由蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis)特异性侵染蜜蜂幼虫而导致的致死性真菌病。该病最早于1913年由Maassen发现[4], 至1992年该病已经遍及我国全部的蜜蜂饲养区[5]。目前, 球囊菌已被我国列入蜜蜂进出口检疫的对象[6]。

近20年来, 人们对球囊菌开展了大量研究, 主要集中在培养方法[7, 8]、形态学[9, 10]、流行病学[11, 12]、增殖方式[13, 14]、病理学[15, 16]、免疫防御[17, 18]以及疾病防治[19, 20]等方面。本课题组也在球囊菌的生化和病理等方面开展了较多研究[21, 22, 23, 24, 25], 如梁勤等[22]从碳源、氮源、维生素、矿质元素等方面研究了营养生态条件对球囊菌生长及产孢的影响, 结果表明, 营养生态条件的变化对球囊菌的影响极大; 郑志阳等[24]对健康及白垩病患病意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica, 意蜂)幼虫的血淋巴进行SDS-PAGE电泳和酶学研究, 发现健康蜜蜂幼虫血淋巴中的蛋白含量丰富, 主要由4种高分子质量的蛋白组成, 而患病幼虫血淋巴中的蛋白含量很少, 主要蛋白组分被降解, 多种蛋白酶和酯酶的活性在患病幼虫血淋巴中可检测到, 但在健康幼虫中检测不到。随着二代测序技术的兴起及广泛应用, Qin等[26]完成了A. apis的基因组测序工作, 为在分子水平研究球囊菌奠定了重要基础, 但作者当时并未公布基因的位置和功能注释信息。2012年Cornman等[27]利用Roche 454焦磷酸测序技术比较培养基培养的纯净球囊菌菌丝和胁迫西方蜜蜂幼虫肠道组织内的球囊菌菌丝转录组表达情况, 分析表明, 球囊菌的病原差异表达基因(DEGs)参与了关键分子途径如应激反应、交配类型、信号传导等。由于球囊菌的基因位置及功能注释信息、参考转录组信息的缺失, 球囊菌的分子研究进展极为缓慢。

目前, 球囊菌致病的分子机理尚不明确。本课题组前期已组装并注释了球囊菌参考转录组[28], 可为在分子水平深入研究球囊菌提供重要的参考信息。本研究在前期研究基础上进一步对球囊菌胁迫意蜂6日龄幼虫肠道内的DEGs进行深入分析, 旨在提供球囊菌在胁迫意蜂幼虫后期的基因表达谱信息, 为阐明球囊菌致病的分子机理奠定基础。

1 材料与方法
1.1 供试生物材料

本研究所使用的意蜂幼虫取自福建农林大学蜂学学院教学蜂场; 球囊菌菌株由福建农林大学蜂学学院蜜蜂保护学实验室保存与活化。

1.2 球囊菌活化与孢子悬液制备

将4 ℃保存的球囊菌培养皿置于已紫外灭菌的超净台, 用酒精灯上灼烧片刻的镊子夹取少量菌丝在平板中央2 cm左右圆心区域内划线操作, 培养皿封口后置于37 ℃生化箱恒温培养。接种8~10 d天后, 待培养皿上黑色孢子较多时, 刮取孢子至干净的离心管中, 充分研磨, 按照Jensen等[29]的方法离心纯化球囊菌孢子, 梯度稀释后用血球计数板进行计数。

1.3 意蜂幼虫的人工饲养及球囊菌接种感染

按照李江红等[25]的方法配制意蜂幼虫的饲料, 预实验结果显示, 意蜂7日龄幼虫的成活率可达90%以上。从学院教学蜂场群势较强的健康意蜂蜂群(无白垩病症状且PCR检测为阴性)中提取巢脾, 将2日龄幼虫移至已预置饲料的24孔培养板中, 置于35 ℃、70%相对湿度(RH)条件下培养。配制终浓度为1× 107cfu· mL-1的饲料, 饲喂3日龄幼虫, 24 h后饲喂不含球囊菌孢子的正常饲料。每24 h更换饲料。

1.4 测序样品的准备、cDNA文库构建及Illumina测序

剖取上述球囊菌感染的6日龄幼虫肠道, 液氮速冻后超低温保存备用。本实验进行3次生物学重复。测序样品分别为球囊菌的纯化孢子(AaCK)和球囊菌胁迫的意蜂6日龄幼虫肠道。AaCK的3个生物学重复分别为AaCK-1、AaCK-2和AaCK-3。cDNA文库构建按照张曌楠等[28]的方法进行。上述6个样品的Illumina测序委托广州基迪奥生物科技有限公司进行, 测序平台为Illumina HiSeq 2500。

1.5 差异表达基因(DEGs)分析

利用Perl脚本除去测序数据原始读段(raw reads)中未知核苷酸含量大于5%和质量低的reads, 得到有效读段(clean reads)。利用短reads比对工具bowtie分别将各测序样品的有效读段映射到核糖体数据库, 去除mapping上核糖体的reads后, 进一步mapping西方蜜蜂参考基因组(Amel_4.5, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/48?genome_assembly_id=22683)。利用SOAP aligner/soap2软件将未mapping上西方蜜蜂基因组的reads(AamT: AamT-1、AamT-2和AamT-3)mapping到球囊菌参考转录组[28]。通过Pearson相关性评估样品的生物学重复性。利用FPKM(Fragments per kilobase of transcript per Million mapped reads)法计算基因表达量。利用R软件计算各样品之间的相关性系数。DEGS的筛选标准为FDR≤ 0.05且|log2Fold change|≥ 1。

利用WEGO软件对DEGs进行GO富集分析。利用Blastall将DEGs比对KEGG(Kyoto Encyclopaedia of Genes and Genomes)数据库(http://www.kegg.jp/), 进行KEGG 代谢通路(pathway)富集分析。

2 结果与分析
2.1 RNA-seq数据的质控与评估

球囊菌纯化孢子的RNA-seq共产生84 724 576条raw reads, 过滤得到80 091 556条clean reads, 各样品clean reads数均在2 253 412以上, 两端Q20(99%碱基正确率)均在97.05%以上, 两端Q30(99.9%碱基正确率)均在92.55%以上(表1)。为获得纯净的球囊菌数据, 将测序数据先mapping核糖体数据库, 再mapping西方蜜蜂参考基因组和球囊菌参考转录组。上述结果说明本研究中的转录组数据质量良好, 可用于进一步分析。

表1 RNA-seq数据统计 Table 1 A summary of RNA-seq data

Pearson相关性分析结果显示AaCK与AamT的各生物学重复之间的相关性均在0.801以上(0.801 0~0.999 9), 说明样本组内重复性较高。进一步对AaCK与AamT进行主成分分析(PCA), 并进行归一化处理, 结果显示第1主成分(PC1)与第2主成分(PC2)可分别解释样品基因表达总体差异的67.1%和14.4%, 而且各样品重复的聚类情况良好, 说明本研究中处理组和对照组样品的基因表达总体差异明显(图1)。

图1 AaCK与AamT的主成分分析Fig.1 Principal components analysis of AaCK and AamT

2.2 差异表达基因(DEGs)分析

通过比较处理组和对照组, 共得到21 361个DEGs, 其中包括15 306个上调基因与6 055个下调基因(图2)。上调基因的数量远多于下调基因, 说明在胁迫意蜂幼虫肠道的后期, 球囊菌的多数基因被激活表达。

图2 AamT和AaCK的差异表达基因分析Fig.2 DEGs analysis in AamT and AaCK

GO富集分析结果显示, 上调基因富集于39个GO term, 其中基因富集数最多的是细胞进程(2 416 unigenes)、细胞(2 408 unigenes)、细胞组件(2 408 unigenes)、代谢进程(2 347 unigenes)、催化活性(2 310 unigenes)、结合(1 870 unigenes)、单组织进程(1 852 unigenes)、细胞器(1 536 unigenes)、大分子复合物(817 unigenes)和定位(757 unigenes)(图3-A)。下调基因富集于38个GO term, 基因富集数最多的是代谢进程(1 227 unigenes)、细胞进程(1 185 unigenes)、细胞(1 131 unigenes)、细胞组件(1 131 unigenes)、催化活性(1 115 unigenes)、结合(920 unigenes)、单组织进程(859 unigenes)、细胞器(644 unigenes)、大分子复合物(384 unigenes)及定位(349 unigenes)(图3-B)。

图3 AamT VS AaCK中DEGs的GO富集分析
A, AamT VS AaCK中上调基因的GO富集分析; B, AamT VS AaCK中下调基因的GO富集分析。A: 1, 生物附着; 2, 生物学调控; 3, 细胞成分组成或生物合成; 4, 细胞进程; 5, 发育进程; 6, 生长; 7, 定位; 8, 代谢进程; 9, 多组织进程; 10, 多细胞生物进程; 11, 生殖; 12, 生殖进程; 13, 应激; 14, 信号; 15, 单组织进程; 16, 细胞; 17, 细胞连接; 18, 细胞组件; 19, 大分子复合物; 20, 细胞膜; 21, 细胞膜组件; 22, 膜内腔; 23, 拟核; 24, 细胞器; 25, 细胞器组件; 26, 病毒粒子; 27, 病毒粒子组件; 28, 抗氧化活性; 29, 结合; 30, 催化活性; 31, 电子载体活性; 32, 酶调节活性; 33, 鸟嘌呤核苷酸交换因子活性; 34, 分子功能调节器; 35, 分子传感器活性; 36, 核苷酸结合转录因子活性; 37, 蛋白结合转录因子活性; 38, 结构分子活性; 39, 转运器活性
B:1, 生物学调控; 2, 细胞成分组成或生物合成; 3, 细胞进程; 4, 发育进程; 5, 生殖; 6, 定位; 7, 代谢进程; 8, 多组织进程; 9, 多细胞生物进程; 10, 生殖; 11, 生殖进程; 12, 应激; 13, 信号; 14, 单组织进程; 15, 细胞; 16, 细胞连接; 17, 细胞组件; 18, 大分子复合物; 19, 细胞膜; 20, 细胞膜组件; 21, 膜内腔; 22, 拟核; 23, 细胞器; 24, 细胞器组件; 25, 病毒粒子; 26, 病毒粒子组件; 27, 抗氧化活性; 28, 结合; 29, 催化活性; 30, 电子载体活性; 31, 酶调节活性; 32, 鸟嘌呤核苷酸交换因子活性; 33, 分子功能调节器; 34, 分子传感器活性; 35, 核苷酸结合转录因子活性; 36, 蛋白结合转录因子活性; 37, 结构分子活性; 38, 转运器活性Fig.3 GO enrichment analysis of the DEGs in AamT VS AaCK
A: GO enrichment analysis of up-regulated genes in AamT VS AaCK; B: GO enrichment analysis of down regulated genes in AamT VS AaCK. A: 1, biological adhesion; 2, biological regulation; 3, cellular component organization or biogenesis; 4, cellular process; 5, developmental process; 6, growth; 7, localization; 8, metabolic process; 9, multi-organism process; 10, multicellular organismal process; 11, reproduction; 12, reproductive process; 13, response to stimulus; 14, signaling; 15, single-organism process; 16, cell; 17, cell junction; 18, cell part; 19, macromolecular complex; 20, membrane; 21, membrane part; 22, membrane-enclosed lumen; 23, nucleoid; 24, organelle; 25, organelle part; 26, virion; 27, virion part; 28, antioxidant activity; 29, binding; 30, catalytic activity; 31, electron carrier activity; 32, enzyme regulator activity; 33, guanyl-nucleotide exchange factor activity; 34, molecular function regulator; 35, molecular transducer activity; 36, nucleic acid binding transcription factor activity; 37, protein binding transcription factor activity; 38, structural molecule activity; 39, transporter activity
B: 1, biological regulation; 2, cellular component organization or biogenesis; 3, cellular process; 4, developmental process; 5, growth; 6, localization; 7, metabolic process; 8, multi-organism process; 9, multicellular organismal process; 10, reproduction; 11, reproductive process; 12, response to stimulus; 13, signaling; 14, single-organism process; 15, cell; 16, cell junction; 17, cell part; 18, macromolecular complex; 19, membrane; 20, membrane part; 21, membrane-enclosed lumen; 22, nucleoid; 23, organelle; 24, organelle part; 25, virion; 26, virion part; 27, antioxidant activity; 28, binding; 29, catalytic activity, 30, electron carrier activity; 31, enzyme regulator activity; 32, guanyl-nucleotide exchange factor activity; 33, molecular function regulator; 34, molecular transducer activity; 35, nucleic acid binding transcription factor activity; 36, protein binding transcription factor activity; 37, structural molecule activity; 38, ransporter activity

KEGG 代谢通路富集分析结果显示, 上调基因富集在119个通路, 其中, 基因富集数量最多的是核糖体(221 unigenes), 其次为内质网中蛋白加工(190 unigenes)和内吞作用(177 unigenes)(图4), 说明球囊菌在胁迫意蜂幼虫肠道的后期, 通过大幅提高蛋白合成来满足病原孢子萌发与菌丝生长的需要。此外, 大量DEGs富集在各类物质代谢, 如碳代谢、嘌呤代谢、嘧啶代谢及氨基酸和核苷酸糖代谢, 说明球囊菌在胁迫后期因增殖对蛋白、核酸等物质需求大增; 也有大量DEGs富集在能量代谢, 如氧化磷酸化和糖酵解/糖异生, 说明球囊菌在胁迫意蜂幼虫肠道的过程中, 伴随着物质代谢的提升, 其能量代谢也相应增强。下调基因富集在113个通路, 其中基因富集数量最多的是核糖体(144 unigenes), 其次为RNA转运(113 unigenes)和氨基酸生物合成(108 unigenes)(图4), 说明球囊菌在胁迫后期受到宿主一定程度的抑制, 球囊菌— 意蜂幼虫肠道间存在复杂的互作。

图4 AamT VS AaCK中DEGS的KEGG 代谢通路富集分析
A, AamT VS AaCK中上调基因的KEGG代谢通路富集分析; B, AamT VS AaCK中下调基因的KEGG 代谢通路富集分析Fig.4 KEGG pathway enrichment analysis of the DEGS in AamT VS AaCK
A, KEGG pathway enrichment analysis of the up-regulated genes in AamT VS AaCK; B, KEGG pathway enrichment analysis of the down regulated genes in AamT VS AaCK

进一步分析发现, 有64个上调基因富集在MAPK信号通路(图5), 表达量聚类分析结果显示这些基因的表达水平上调程度不同, 说明该通路在胁迫后期极为活跃。

图5 AamT中的MAPK信号通路Fig.5 MAPK signaling pathway in AamT

3 讨论

意蜂是我国养蜂生产中的主要蜂种, 其幼虫极易被球囊菌侵染而罹患白垩病。近20年来, 人们对球囊菌开展了一系列研究, 但由于基因组信息的缺失, 其分子研究一直进展缓慢。球囊菌基因组信息的公布[26]为在分子水平深入研究该病原奠定了重要基础, 但作者当时并未公布基因位置及功能注释信息, 以致球囊菌的分子研究举步维艰。为了对球囊菌进行转录组学研究, 我们在前期研究中de novo组装了球囊菌的参考转录组并对其进行了功能及代谢通路注释[28], 可为深入开展球囊菌的转录组学研究提供可靠的参考信息。

Cornman等[27]曾对纯培养的球囊菌菌丝和西方蜜蜂幼虫感染组织长出的球囊菌菌丝进行转录组测序分析, 但后者是幼虫肠道内萌发生长的菌丝穿透肠壁后继而穿透体壁的菌丝, 因此时已不再与宿主互作, 其转录组变化并不能精确反映球囊菌在侵染过程中的基因表达情况。本研究的测序对象是纯培养的球囊菌及球囊菌胁迫的意蜂6日龄幼虫肠道, 肠道内的球囊菌此时与宿主间存在复杂的互作。通过对球囊菌胁迫幼虫肠道测序数据的过滤得到肠道内球囊菌的转录组数据, 进而与纯培养的球囊菌转录组数据进行比较分析, 能够更为精确地反映球囊菌在胁迫后期的基因表达情况。本研究发现, 胁迫后期的球囊菌有15 306个基因上调表达, 说明球囊菌的多数基因被激活。球囊菌是蜜蜂幼虫的专性真菌病原, 与意蜂幼虫在长期的协同进化中相互适应。本研究中, 球囊菌的6 055个基因下调表达, 表明球囊菌— 意蜂幼虫间存在较为复杂的互作, 意蜂幼虫可通过某种互作机制对球囊菌的部分基因产生抑制。球囊菌的许多下调基因富集在物质代谢通路和信号通路, 如富集在核糖体上的40S核糖体蛋白S8编码基因(unigene 0015791)和60S酸性核糖体蛋白P1(unigene 0016073), 富集在RNA转运上的翻译起始因子eif3亚基编码基因(unigene 0016266)和氨基酸转运载体编码基因(unigene 0039179), 富集在mRNA监督上的RNA结合结构域蛋白编码基因(unigene 0005915)和mRNA输出因子TAP/MEX67编码基因(unigene 0036972), 表明宿主能通过影响球囊菌的物质、能量代谢以及信号转导对病原产生抑制, 二者之间互作机制的阐明有待于进一步研究。球囊菌在侵染过程中需要不断合成蛋白质和遗传物质来满足自身增殖需要。本研究中, 大量参与蛋白质与遗传物质合成相关通路的基因表现为上调, 如富集在核糖体上的60S核糖体蛋白L18-B编码基因(unigene 0031257)和40S核糖体蛋白S3编码基因(unigene 0030940), 富集在内质网蛋白质加工上的HDEL序列结合蛋白编码基因(unigene 0041878)和J结构域蛋白编码基因(unigene 0001009), 富集在DNA复制上的DNA复制许可因子MCM5编码基因(unigene 0029460)和核糖核酸酶H2亚基C编码基因(unigene 0006716), 富集在RNA转运上的ATP依赖的RNA解旋酶eIF4A编码基因(unigene 0018630)和泛素结合酶9编码基因(unigene 0042593)。

真菌可通过复杂而保守的信号级联反应以快速响应外界环境变化[30]。通过将相应的环境信号因子级联传递至细胞内, 引起特定的基因表达来调节形态、繁殖和毒力等过程。信号通路中涉及真菌的主要有MAPK信号通路、双组分信号传导通路和cAMP-PKA信号通路等[31], 其中MAPK信号通路最为关键[32]。MAPK级联反应均参与了真菌的应激反应和致病性的关键途径[33]。本研究发现, 球囊菌在胁迫意蜂幼虫肠道过程中, 有64个DEGs在MAPK信号通路中表现为上调, 如p38MAP激酶编码基因(unigene 0012136)和MAP激酶编码基因(unigene 0001592)等, 推测MAPK信号通路在球囊菌胁迫意蜂幼虫的后期扮演着重要角色, 该通路上的基因上调表达经级联反应对球囊菌的配合、细胞周期、渗透物合成及菌丝形成产生重要影响(图5)。本研究只针对意蜂6日龄幼虫肠道内的球囊菌进行分析, 该通路在其他日龄幼虫中表现如何有待于进一步研究。下一步我们将通过人工合成siRNA对球囊菌MAPK信号通路上的主要基因进行沉默, 验证该通路在球囊菌胁迫过程中的作用, 有望为白垩病的治疗提供潜在的分子靶点。

昆虫的体壁及消化道上皮围食膜的角质层对于保护昆虫的体内器官和防止病原体的侵害有重要作用, 一般由几丁质和蛋白质形成[34]。而丝状真菌产生的各种次生代谢产物(包含几丁质酶、蛋白酶、淀粉酶、脂酶等)多涉及毒力调控, 对宿主的致死过程具有相当重要的辅助作用。陈大福等[35]发现A. apis的胞外蛋白酶活性与其菌株毒力和蜜蜂幼虫日累计致死数量密切相关。昆虫病原真菌主要是依靠酶的降解和机械压力的作用侵入宿主[36, 37]。本研究发现共有12个DEGs涉及编码几丁质酶, 其中9个基因表达水平上调, 如Ⅴ 类几丁质酶编码基因(unigene 0018355)和几丁质酶3编码基因(unigene 0028056)等, 表明球囊菌在侵染意蜂幼虫的过程中, 可通过分泌几丁质酶协助其穿透幼虫肠道的围食膜, 并在疾病后期病原突破宿主体表的过程中发挥关键作用。

本研究利用RNA-seq技术对意蜂6日龄幼虫肠道内球囊菌进行DEGS分析, 研究结果不仅为揭示胁迫后期的球囊菌— 意蜂幼虫互作提供了重要信息和线索, 也为阐明球囊菌致病的分子机理奠定了基础。未来的研究方向是通过趋势分析和基因权重共表达(WGCNA)分析进一步筛选得到球囊菌的关键致病基因, 并对其进行分子克隆和功能验证。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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