作者简介:杨颜铱(1991—),女,四川南充人,硕士研究生,从事反刍动物疾病研究。E-mail: ash_lee_love@yeah.net
试验旨在研究精料水平和添加复合抗菌肽对川中黑山羊生长性能及免疫球蛋白、补体、细胞因子、激素水平的影响。将24只4月龄川中黑山羊按照体质量相近的原则分为4组,每组6只。Ⅰ组为普通精料对照组(300 g精料),Ⅱ组为普通精料+抗菌肽组(300 g精料+3.0 g抗菌肽),Ⅲ组为高精料组(600 g精料),IV组为高精料+抗菌肽组(600 g精料+3.0 g抗菌肽)。预饲1周后开始试验,试验期60 d。于0、20、40、60 d时,每组选取4只山羊颈静脉采血制备血清,检测免疫球蛋白、补体、细胞因子和激素指标,同时每组每只山羊依次空腹称量体质量。结果显示:与普通精料对照组相比,添加复合抗菌肽和饲喂高精料组的山羊血清中免疫球蛋白IgA、IgG、IgM,细胞因子IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、IFN-γ、TNF-α,补体C3、C4,生长激素ACTH、IGF-1、T3、T4等指标有明显升高的趋势,且山羊体质量和平均日增重均有显著增加。证实复合抗菌肽以及高精料均能够增强山羊机体的免疫功能,促进生长。
This study is to evaluate the effects of dietary additive of antimicrobial peptides (AMPs) on growth performance, immunoglobulin, cytokines,complement and hormone levels of male Chuanzhong black goats. A total of 24 male goats were allotted to four groups on the basis of initial body weight, each group with 6 goats. Dietary treatments were Ⅰ-normal concentrate group (300 g concentrate), Ⅱ-normal concentrate and antimicrobial peptide group(300 g concentrate+3.0 g antimicrobial peptides), Ⅲ-high concentrate group (600 g concentrates), Ⅳ-high concentrate and antimicrobial peptide group (600 g concentrate+3.0g antimicrobial peptides). After a week of pre-feeding test, the 60 day test was conducted. On 0, 20th, 40th and 60th day, 4 goats were randomly selected from each group, whose jugular vein blood samples were collected to test immunoglobulin, cytokines, complement and hormone levels, and were weighed one by one. The results showed, compared with the control group, the recombinant antimicrobial peptides and high concentrate could significantly increase the levels of immunoglobulin IgA, IgG, IgM, cytokine IL-2, IL-6, IL-10, IL-12, IFN-γ, TNF-α, complement C3, C4, hormone ACTH, IGF-1, T3, T4 in serum, the body weights and average daily gains, which confirmed that the recombinant antimicrobial peptides and high concentrate could enhance the immune function and promote the growth of the goat.
抗菌肽(AMPs)是具有两亲性的, 带有正电荷的疏水性小分子多肽[1, 2]。大多数抗菌肽是有遗传基因编码的, 通常由10~50个氨基酸组成, 分子质量比较小, 约为4~10 ku[3]。抗菌肽具有广谱的抗菌活性, 对革兰氏阳性和阴性细菌、病毒、寄生虫、真菌和原生动物等均表现出高效的杀灭作用[4]。除了抗菌特性之外, 抗菌肽也被用于预防和治疗炎症和脓毒症[5, 6], 抗菌肽作为抗内毒素及趋化因子的成分在体内发挥着体液和细胞免疫的重要作用[7, 8, 9], 还可以诱导或激活信号分子和免疫系统增强免疫细胞。已有大量的研究表明, 抗菌肽作为饲料添加剂对于家畜生长性能、免疫器官指数、血液生化指标、抗氧化活性、肠黏膜功能以及免疫功能等有积极影响[10, 11, 12, 13, 14, 15]。到目前为止, 许多研究都集中在抗菌肽对单胃动物的影响上, 如猪[16, 17]、鲤鱼[18, 19]、鸡[15]、小鼠[20]等, 抗菌肽作用于反刍动物免疫功能的报道并不多。因此, 本试验在之前研究的基础上, 研究抗菌肽和精料水平对于川中黑山羊生长性能及血清中免疫球蛋白、补体、细胞因子和激素水平的影响, 初步探讨了复合抗菌肽对于山羊的免疫功能及生长状况的作用机制, 为川中黑山羊的饲养管理提供理论依据。
抗菌肽由苍蝇抗菌肽(ATCDLLSGTGVKHSACAAHCLLRGNRGGYCNGRAICVCRN)和猪防御素(DHYICAKKGGTCNFSPCPLFNRIEGTCYSGKAKCCIR)按等比例组成。由四川华德工程有限公司提供, 规格:每袋500 g。
IgA、IgG、IgM, IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、IFN-γ 、TNF-α , C3、C4, ACTH、IGF-1、T3、T4等ELISA试剂盒均购买自南京建成生物工程研究所。
试验动物选用24只4月龄的雄性川中黑山羊, 平均体质量(15.90± 0.44)kg。预饲1周后开始正式试验。每天8∶ 00和16∶ 00各饲喂精料一次, 精料全部采食后, 饲喂足够青草, 全天自由饮水。室外与舍饲相结合。试验用精料参照《山羊饲养标准》(NY / T 816— 2004)配制, 其组成及营养水平见表1。
24只体质量相近的4月龄健康雄性山羊随机分为4组, 每组6只。试验处理如下:Ⅰ 组-普通精料对照组(300 g精料), Ⅱ 组-普通精料+抗菌肽组(300 g精料+3.0 g抗菌肽), Ⅲ 组-高精料组(600 g精料), Ⅳ 组-高精料+抗菌肽组(600 g精料+3.0 g抗菌肽), 括号中的饲喂量为每只山羊每天的量, 早晚饲喂精料比例为1∶ 1, 试验期为60 d。
在试验第0、20、40、60天分别从各组随机选取4只试验公羊, 颈静脉采集血5 mL, 静置后于KDC-140HR冷冻离心机835 g(3 000 r· min-1)离心15 min制备血清, -20 ℃保存。
1.5.1 生长性能指标的测定
分别于试验第0、20、40、60天逐头空腹称山羊初始体质量, 计算山羊的平均日增重。
1.5.2 免疫性能指标的测定
采用酶联免疫吸附测定法检测免疫球蛋白IgA、IgG、IgM, 细胞因子IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、IFN-γ 、TNF-α , 及补体C3、C4含量, 参照ELISA诊断试剂盒说明书进行检测。
1.5.3 激素水平指标的测定
采用酶联免疫吸附测定法检测激素ACTH、IGF-1、T3、T4水平, 参照ELISA诊断试剂盒说明书进行检测。
使用Excel进行数据前的处理, 用SPSS 19.0统计软件进行统计分析, 多重比较用邓肯法(Duncan)。所有表格内数据用
由表2可以看出, 0 d时, 4组之间体质量差异不显著。20 d时, 高精料+抗菌肽组的体质量显著高于普通精料组(P< 0.05)。40 d时, 高精料组与高精料+抗菌肽组的山羊体质量显著高于另外2组(P< 0.05)。60 d时, 高精料+抗菌肽组山羊体质量显著高于普通精料组与普通精料+抗菌肽组(P< 0.05), 而与高精料组差异不显著。山羊平均日增重最高的阶段为0~40 d时, 整个试验期间, 高精料+抗菌肽组山羊平均日增重都维持在一个比较好的水平, 效果最佳。
由表3可以看出, 0 d时, 4组之间3种免疫球蛋白含量差异均不显著。20 d时, 高精料+抗菌肽组, 高精料组, 普通精料+抗菌肽组等3组的IgA含量显著高于普通精料组(P< 0.05), 而此时3组之间的免疫球蛋白IgG、IgM含量差异不显著。40与60 d时, 高精料+抗菌肽组、高精料组、普通精料+抗菌肽组的IgA含量均极显著地高于普通精料组(P< 0.01), 但3组之间彼此差异不显著; 同样地, 2抗菌肽组与高精料组的IgG和IgM的含量均显著高于普通精料对照组(P< 0.05或0.01); 60 d时, 2高精料组IgG含量极显著高于普通精料+抗菌肽组(P< 0.01), 且高精料+抗菌肽组的IgM含量也显著高于高精料组和普通精料+抗菌肽组。
由表4 可以看出, 0 d时, 4个组之间各个指标含量差异均不显著。除20 d时普通精料+抗菌肽组与普通对照组IL-2含量差异不显著外, 普通精料+抗菌肽组, 高精料组, 高精料+抗菌肽组的IL-2和IL-10含量均出现了显著高于对照组的趋势(P< 0.05或0.01), 且一直维持到试验结束。对于IL-6和IL-12, 20 d时, 4组之间差异仍均不显著, 40 d开始, 其余3组含量均显著高于普通精料组(P< 0.05或0.01)。从20 d开始, 高精料+抗菌肽组的IFN-γ 含量就持续高于对照组(P< 0.05或0.01), 而对于普通精料+抗菌肽组与高精料组, 除60 d时其含量显著高于对照组之外, 20与40 d时与对照组差异不显著。整个试验期间, 除了60 d时, 两抗菌肽组与高精料组的TNF-α 含量明显高于对照组之外(P< 0.01或0.05), 其余时间点均不显著, 且普通精料组+抗菌肽的效果好于高精料组。
由表5可以看出, 0与20 d时, 4个组之间C3含量差异均不显著。40与60 d时, 普通精料对照C3组含量均显著低于其余3组(P< 0.05或0.01)。在整个试验期间, 普通精料对照组C3含量维持在一个较为恒定的水平, 其余3组C3含量均呈现一个较为明显的上升的趋势, 其中高精料+抗菌肽组效果最为显著。
由表6可以看出, 0 d时, 4组各个指标之间差异均不显著。20 d时, 4个组之间ACTH含量差异依旧不显著, 40 d时, 普通精料+抗菌肽组含量与普通精料组差异不显著, 但高精料+抗菌肽组和高精料组的ACTH含量均显著高于对照组(P< 0.05), 到60 d时, 两抗菌肽组与高精料组ACTH水平均显著高于对照组(P< 0.05)。20 d时, 两高精料组的IGF-1含量显著高于两普通精料组的含量(P< 0.05), 普通精料+抗菌肽组与对照组之间无显著差异。从40 d开始, 3个处理组IGF-1含量都出现了显著高于对照组的趋势且持续到试验结束(P< 0.05或0.01)。从20 d开始, 高精料与添加抗菌肽组的T3、T4含量均显著高于对照组(P< 0.05或0. 01), 且3组之间效果并无显著差异。
大量研究证实, 抗菌肽能提高动物代谢率, 提高平均日增重, 从而增强动物的生长性能等[21, 22, 23]。本试验证明在饲料中添加复合抗菌肽以及饲喂高精料能有效提高山羊的体质量以及平均日增重, 与前人的研究结果一致。过去的研究中, 有不少关于抗菌肽改善动物肠道菌群结构的报道[24, 25], 而对于反刍动物瘤胃微生物影响的研究较少。王洪荣等[26]试验证实, 肽能够缩短瘤胃菌群生长周期, 加快菌群繁殖速度, 促进生长。
特异性免疫球蛋白是一组具有活性且化学结构与抗体相似的肌球蛋白, 血清中的免疫球蛋白水平是宿主抵抗细菌和病毒等病原体入侵能力的指标。血清免疫球蛋白IgA、IgG、IgM在体液免疫应答中发挥着重要的作用[27, 28], IgA是机体黏膜防御系统的重要组成部分, 是机体防止病原微生物入侵的第一道防线。IgG是动物机体内含量最高的免疫球蛋白, 在体液免疫中发挥着主导作用, 是最持久的抗体, 而IgM是机体免疫应答时最先产生的免疫球蛋白, 这3种免疫球蛋白含量的增加提示着机体的免疫功能增强[29]。
本研究结果表明, 在川中黑山羊的饲料中添加抗菌肽以及饲喂高精料对其血清中免疫球蛋白含量有显著影响(P< 0.05), 与Yoon等[30]报道的试验结果相反, 他们的研究认为, 抗菌肽P5作为饲料添加剂对断奶仔猪血清IgM、IgA和IgG的含量无显著影响, 这种差异可能是由于抗菌肽的种类以及试验选取的动物种类不同所导致的。本试验结果与Prgomet等[31]研究结果一致, 他们的试验选用的抗菌肽为乳铁蛋白, 试验动物为犊牛。以前关于抗菌肽的报道[10, 11, 32, 33]中大多都证实了它具备提高家畜机体的免疫球蛋白含量的功效。这些研究结果证实了抗菌肽对免疫球蛋白的分泌有积极影响, 从而提高了动物机体特异性免疫应答, 增强其抵抗力, 与本研究结果一致, 且由于3种不同的免疫球蛋白在机体内免疫应答的作用不同, 其含量出现显著差异的时间也略有不同。关于抗菌肽可以增强免疫球蛋白的分泌的原因, 我们推测是由于淋巴细胞分泌产生免疫球蛋白的过程涉及蛋白质的分泌与合成, 这个步骤需要大量的氨基酸的参与, 而抗菌肽又属于小分子的多肽, 可以分解成多个氨基酸, 因此可能有利于细胞储存氨基酸从而促进免疫球蛋白的合成。
细胞因子是一种由造血系统和免疫系统激活, 细胞产生的具有高活性的功能性肽、蛋白质或糖蛋白类, 在免疫反应和炎症反应中起着关键的作用[34]。IFN-γ 、TNF-α 和IL-2、IL-6、IL-12α 主要由Th1细胞分泌, 增强细胞免疫应答, 而IL-4和IL-10主要由Th2细胞分泌, 增强体液免疫应答[35]。IL-2具有广泛的生物活性, 诱导T细胞的增殖和分化, 促进IgM和IgG的分泌, 激活Th细胞释放的辅助因子, 有助于外周血单核细胞释放IFN-γ 、TNF-α [36], 是衡量机体免疫功能的重要指标。IL-6能够促进B细胞分化增殖, 诱导浆细胞产生免疫球蛋白, 并诱导T细胞IL-2受体(IL-2R)的表达[37]等。IL-10是一种抗炎细胞因子, 抑制巨噬细胞细胞因子的分泌, 间接抑制Th1细胞分泌的细胞因子的过度表达, 如IL-6和TNF-α [38]。TNF-α 促进T细胞和NK细胞等对肿瘤细胞的杀伤活性和肠组织炎症的发生和维持中起着至关重要的作用, 有利于启动和调节免疫反应[39, 40]。 Bowdishet等[7]报道, 抗菌肽可以作为一种添加剂刺激体液免疫反应从而调节获得性免疫。同样, 有报道称抗菌肽LL-37可以通过受体依赖机制促进免疫细胞释放IL-1[41], 并且协同IL-1促进IL-6、IL-10以及其他趋化因子在外周血中的释放[42]。
本试验中, 高精料+抗菌肽组, 高精料组, 普通精料+抗菌肽组的细胞因子IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、IFN-γ 和TNF-α 含量显著高于对照组(P< 0.05), 与Yuan等[43]、Chen等[44]、Wu等[25]的研究结果一致, 提示抗菌肽作为饲料添加剂以及饲喂高精料对动物机体免疫力都有增强作用。IL-2、IL-10分泌增多, 增强了与其他细胞因子联合作用促进T细胞的早期生长与发育, 增强T细胞的数量和分泌其他细胞因子的功能; IL-6含量的升高可以促使机体分泌更多免疫球蛋白, 与前面的试验结果保持一致, 证实抗菌肽可以增强动物免疫应答, 提高抗病力。本试验中, 与对照组相比其余各组TNF-α 含量升高与一些研究结果不一致, 有报道认为TNF-α 增多会导致机体的免疫功能降低和免疫细胞数量减少[45], 但也有文献称, LL-37可诱导大鼠结缔组织中成熟的肥大细胞分泌多种细胞因子, 其中就包括TNF-α [46]。细胞因子网络是一个复杂的调控系统, 受到多种因素的影响, 其作用机理也不会是单一的。应当指出的是, 抗菌肽对于以TNF-α 为主的炎症因子的表达调控机制还有待进一步的研究。
补体系统由20 多种血浆蛋白组成, 是人体天然免疫的重要组成部分。补体第3组分(C3) 是补体系统的核心物质, 是连接天然免疫和获得性免疫的重要桥梁[47]。C3 在血清中含量最高, 它是几条激活途径的中间物质。C3在免疫病理、免疫调控以及免疫防御中发挥着重要作用。C4 主要参与补体经典途径的激活过程, 而C3在补体激活的经典途径和替代途径中都起作用[48]。机体的补体系统是机体防御系统的一部分, 可以通过防止病原微生物侵入从而参与机体的免疫调控[49]。
本试验中, 添加抗菌肽与使用高精料的山羊血清中补体C3、C4含量均显著高于普通对照组, 这与Shan等[10]在断奶仔猪的日粮中添加乳铁蛋白能够的提高机体C4的含量但对C3含量影响不显著研究结果有细微差别。类似的Zhou等[50]、Yao等[51]报道抗菌肽能分别显著提高鸡和锦鲤血清C4水平。不过也有研究报道, 饲喂2 g的抗菌肽可以明显提高新西兰肉兔血清中C3含量的水平[52]。而不同剂量, 不同种类的抗菌肽对于不同种属补体系统的作用差异机制, 还有待进一步的研究。
生长激素被认为是一种正常生长, 泌乳和增加蛋白质合成以及诱导脂肪分解和脂肪酸氧化所必需的激素[53]。Parmentier等[54]也报道认为生长激素是家畜生长、胴体性状和泌乳性状的重要指标。动物机体的生长受到多种激素的调控, 包括有肝脏分泌的胰岛素样生长因子(IGF-1), 甲状腺分泌的甲状腺激素(T3、T4)等, 且它们是动物生长轴激素的重要组成激素, 以前的研究已经证实它们能够参与调节糖、脂和蛋白质的代谢, 对于动物的生长发育发挥着关键的调控作用。已经有研究证实, 甲状腺激素在动物生长方面与生长激素(GH)共同表现出协同作用。而IGF-1又是GH促进生长的介导激素, 因此该指标能良好地反应动物的生长状况, 且血清中的IGF-1水平与动物体质量呈现正相关趋势[55]。促肾上腺素皮质激素(ACTH) 是皮质醇合成与代谢最重要的调节物, 而皮质醇在机体的抗炎与免疫反应中发挥着重要作用[56]。
本试验中, 除对照组之外, 其余3组血清ACTH水平均有明显提高, 证实抗菌肽和高倍精料可以增强动物机体的抗应激能力, 促进肾上腺素分泌皮质醇, 参与机体免疫应答从而进一步增强动物机体的内环境稳态。以往的报道指出, 在一定的范围内, T3与T4水平与生长率呈现正相关。本试验结果显示, 抗菌肽和高精料分别都显著地促进T4与T3含量的升高, 与刘忠渊等[57]研究结果并不完全一致, 这可能是由于选用的动物品种及抗菌肽种类和浓度不同, 或者饲喂时间的长短不同所致, 禽类和反刍动物的生长激素调控系统可能存在一定的差异。本试验中, 抗菌肽和高精料组IGF-1的水平均出现显著升高, 与陈晓生等[58]之前的研究证实饲粮中添加抗菌肽可以提高胰岛素样生长因子1(IGF-1)和甲状腺素T3水平的结果一致, 表明抗菌肽能增强动物的新陈代谢, 促进生长发育。目前关于抗菌肽对于山羊生长激素的相关报道较少, 我们推测可能是由于抗菌肽可以促进GH的合成, 调节T3、T4及IGF-1的合成与分解, 从而增强了动物机体的消化吸收功能, 并促进肌肉蛋白质沉积, 加速了生长发育。
本试验结果表明, 添加抗菌肽以及饲喂高精料均能够显著提高川中黑山羊免疫球蛋白细胞因子、补体以及生长激素含量, 证实了抗菌肽可以增强动物机体的细胞与体液免疫应答, 提高抗病能力。结合体质量增长情况, 可知, 抗菌肽和高精料能够提高动物的生长性能, 促进生长。
The authors have declared that no competing interests exist.
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