土党参茎段的愈伤组织诱导与植株再生
戚甫友1, 范伟军2, 胡秀3,*, 梁韩枝3, 吴永清3, 许炳强4
1.广州普邦园林股份有限公司,广东 广州 510600
2.台山市红岭种子园,广东 台山529223
3.仲恺农业工程学院 园艺园林学院,广东 广州510225
4.中国科学院 华南植物园,广东 广州510650
*通信作者,胡秀,E-mail: 13902215936@139.com

作者简介:戚甫友(1982—),男,山东梁山人,硕士,工程师,主要从事风景园林施工。E-mail:272741918@qq.com

摘要

为了建立土党参愈伤组织途径的高效再生体系,以无菌苗的带芽茎段为外植体,接种于含有不同植物激素的MS培养基中,探讨不同植物激素对愈伤组织诱导、再分化出芽以及生根的影响。结果表明:在不同处理中可获得2种类型的愈伤组织,黄色致密愈伤(类型Ⅰ)和杂夹有少量白色球形体细胞胚的黄色疏松愈伤(类型Ⅱ),细胞分裂素主导着愈伤组织类型的形成。米黄色致密状胚性愈伤(类型Ⅰ)的适宜配方为MS+1.0 mg·L-1 2,4-D+1.0 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1 NAA,米黄色疏松愈伤组织(类型Ⅱ)的适宜配方为MS+1.0 mg·L-1 2,4-D。致密愈伤组织在含有细胞分裂素(6-BA、KT、TDZ)的培养基上可分化出芽点进而形成不定芽块,转接到MS+0.5 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1 GA3+0.1 mg·L-1 NAA培养基后,芽伸长并增殖为丛生芽。单芽体经300 mg·L-1 IBA溶液浸泡15 min 后,转接于不含任何植物激素的MS培养基上,生根率为100%;将生根良好的植株移栽到泥炭土、蛭石、珍珠岩体积比1∶1∶1的基质中培养30 d,成活率为73.3%。通过愈伤组织途径建立了土党参的高效再生体系,为种苗繁育、多倍体育种、转基因操作和细胞突变育种提供了技术基础。

关键词: 土党参; 愈伤组织; 丛生芽; 生根率; 成活率
中图分类号:S567.23+9 文献标志码:A 文章编号:1004-1524(2017)08-1313-08 doi: 10.3969/j.issn.1004-1524.2017.08.12
Callus induction and plant regeneration from stem explants of Campanumoea javanica B1.
QI Fuyou1, FAN Weijun2, HU Xiu3,*, LIANG Hanzhi3, WU Yongqing3, XU Bingqiang4
1. Guangzhou Pubang Landscape Architecture Co., Ltd, Guangzhou 510600, China
2. Hongling Seed Orchard, Taishan 529223, China
3. College of Horticulture and Landscape Architecture, Zhongkai University of Agriculture and Engineering, Guangzhou 510225, China
4. South China Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510650, China
Abstract

In order to estabilished an efficient plant regeneration system via callus from stem segments with bud of Campanumoea javanica B1. The aseptic stems were used as explants and then cultured on MS medium supplemented with different plant growth regulators (PGRs) to establish an effective protocol for callus induction, shoots induction and development, and roots induction. The results showed that two types of callus could be obtained under different treatments, of which type Ⅰ was yellow and compact while type Ⅱ was light yellow, fragile and mixed with a small number of white globular embryos. The type of callus could be regulated by cytokinin. Type I callus was induced on MS medium supplemented with 1.0 mg·L-1 2, 4-D+1.0 mg·L-1 6-BA + 0.5 mg·L-1 NAA, while type Ⅱ callus was induced on MS medium supplemented with 1.0 mg·L-1 2, 4-D. The compact callus could differentiated into adventitious buds on the medium supplementing cytokinin (6-BA, KT, TDZ). The adventitious buds further developed and proliferated after 30 d culture on MS medium containing 0.5 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1 GA3+0.1 mg·L-1 NAA. Excised shoots were treated with 300 mg·L-1 IBA for 15 min and then cultured on MS basal medium for 30 d, and the rooting rate reached 100%. When transplanted into a mixture of peat soil, vermiculite and perlite (volume ratios was 1∶1∶1), the survival rate of regenerated plantlets could reached 73.3% after 30 d. The experiment developed an effective protocol for C. javanica shoot organogenesis via callus, which might laid the foundation of researches on polyploidy, transgenic and cell mutation breeding.

Keyword: Campanumoea javanica B1.; callus; excised shoots; rooting rate; survival rate

土党参(Campanumoea javanica B1.), 又名金钱豹, 为桔梗科(Campanulaceae)金钱豹属(Campanumoea)多年生缠绕草本, 分布于贵州、四川、云南、广东和广西等地的山地、林缘、疏林下、灌木丛及溪谷等较阴湿的地方[1]。土党参根部提取物含有金钱豹苷、党参苷、黄酮、苯丙素苷、甾类等化学成分, 具抗癌、提高免疫、抗血管生成、抗疲劳、抗氧化和提高耐缺氧能力[2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14], 土党参多糖与氯化铁配合而成的铁配合物还可作为新型的补铁剂[15]。土党参不但具有较高的药用价值, 同时也是传统的食疗材料。我国民间取其晒干的根用于炖鸡、炖瘦肉等, 不但味道鲜美而且具有补气、止血、通乳等作用[16]。近年来, 土党参作为新兴的食疗营养保健品深受我国以及东南亚国家人民的青睐, 国内外市场对其需求量呈增长趋势。由于具有良好的耐阴性, 在林下种植可大大地节省土地资源, 在林下经济的发展中前景广阔。目前, 国内外对土党参繁殖方面的研究较少, 主要集中于播种繁殖和丛芽途径的离体繁殖[17], 没有以愈伤组织或体细胞胚发生途径进行植株再生的报道。愈伤组织或体细胞胚再生途径可在短时间内高效地获得再生植株, 再生植株大部分是由单细胞或少量几个细胞起源, 可在细胞水平上研究细胞的分化和胚胎的形成以及用于转基因研究。另外, 体细胞胚还可以制成人工种子。基于此, 本研究采用不同种类及浓度的植物激素, 以无菌苗的带芽茎段为材料, 建立土党参愈伤组织再生体系, 为土党参的种苗繁育、多倍体育种、转基因操作和细胞突变育种等奠定基础。

1 材料与方法
1.1 材料

土党参成熟果实, 于2016年7~8月采集于中国科学院华南植物园高山极地植物温室区。

1.2 试验方法

1.2.1 培养基及培养条件

基本培养基为Murashige and Skoog (MS)[18], 培养基配方:蔗糖30 g· L-1, 琼脂7 g· L-1, 以及不同种类和浓度的植物激素, pH 5.8。培养基在121 ℃、104 kPa条件下灭菌20 min。接种后置于温度(25± 1)℃, 12 h/12 h(L/D)条件下, 在无菌培养室内培养(如无特别说明, 以下培养条件均与此相同)。

1.2.2 无菌体系的建立

将土党参果实在流水下冲洗1.5 h, 置于超净工作台上晾干表面水分, 75%乙醇溶液浸泡1 min, 无菌水冲洗1次, 滤纸吸干, 在0.1%升汞溶液中浸泡15 min, 期间不断搅拌, 无菌水漂洗6次, 晾干表面水分。在无菌滤纸上用无菌镊子和刀片剥开果皮, 取种子接种于不含任何植株激素的MS培养基上。种子在20 d左右开始萌发, 40 d长成高4~6 cm, 带2~3个节的幼苗。

1.2.3 愈伤组织诱导

切取无菌苗带芽茎段(长约1 cm), 横放于含有不同浓度2, 4-D(0.5、1.0、2.0 mg· L-1)、6-BA(0、1.0 mg· L-1)、NAA(0、0.5 mg· L-1)和TDZ(0、0.1 mg· L-1)及其组合的MS培养基上, 在光照下培养, 试验设计见表1。为探讨光照条件对愈伤组织诱导的影响, 将部分带芽茎段接种于含1.0 mg· L-1 2, 4-D的MS培养基, 置于黑暗下培养。每个处理接种45个茎段, 试验重复3次。培养30 d后观察愈伤组织生长情况, 并统计愈伤组织诱导率, 愈伤组织诱导率=(产生愈伤组织的茎段数量/接种数)× 100%。

表1 不同植物激素及其组合对土党参茎段愈伤组织诱导的影响 Table 1 Effects of different phytohormone and their combinations on callus induction of C. javanica from stem with axillary bud

1.2.4 愈伤组织再分化出芽

将诱导出的愈伤组织块切为1 cm × 1 cm大小, 转接至含有不同浓度的6-BA(0、0.5、1.0 mg· L-1)、NAA(0、0.01、0.1 mg· L-1)、TDZ(0、0.01、0.1 mg· L-1)及其组合的培养基上, 30 d后观察记录愈伤组织再分化出芽情况并统计出芽诱导率与平均芽数, 出芽率=出芽的愈伤组织块数/接种数)× 100%; 平均出芽数=芽总数/接种时愈伤组织块数。每个处理接种45个茎段, 试验重复3次。

1.2.5 芽的伸长与扩繁

切取相同大小(2 cm × 2 cm)的不定芽块转接于含有不同浓度6-BA(0、0.1、0.5、1.0 mg· L-1)、NAA(0、0.1、0.5 mg· L-1)、KT(0、0.5 mg· L-1)、TDZ(0、0.1、0.3、0.5 mg· L-1)、GA3(0、0.5、2.0 mg· L-1)及其组合的MS培养基上, 30 d后观察记录生长情况, 并统计芽伸长率、平均芽伸长数与芽增殖率。芽伸长率=(长于0.5 cm的不定芽块数/接种时的总不定芽块数)× 100%; 平均芽伸长数=长度大于0.5 cm的总芽体数/接种时的不定芽块数; 芽增殖率=(出现增殖的芽数/接种时的芽数)× 100%。每个处理接种45个茎段, 试验重复3次。

1.2.6 生根培养

选取长3~4 cm、生长健壮的枝条, 切离不定芽块并将切口以上长0.2~0.5 cm部分置于300 mg· L-1 IBA溶液浸泡15 min, 转接于不含任何植物激素的MS培养基上培养, 30 d后观察记录其生长情况, 并统计生根率与平均生根数。生根率=(生根数/接种数)× 100%, 平均生根数=总根数/生根的植株数量。每个处理接种45个茎段, 试验重复3次。

1.2.7 炼苗移栽

选择生根良好的植株, 去除盖子, 带瓶置于自然光照条件下培养7 d后, 用自来水小心冲洗根系附着的培养基, 略微晾干根系表面水分, 植于泥炭土、蛭石、珍珠岩体积比1∶ 1∶ 1的花盆中, 浇足定根水, 每天早晚用清水喷洒叶面, 30 d后统计成活率。移栽成活率=(30 d后移栽成活的植株数/移栽总株数)× 100%。

1.3 数据统计

采DPS 7.05软件中的Duncan新复极差法对数据进行统计分析, 差异显著性水平为0.05。

2 结果与分析
2.1 激素配比及光照对土党参愈伤组织诱导的影响

培养10 d左右, 茎段切口处开始膨大并形成愈伤组织。在不同激素配比下, 土党参的愈伤组织诱导率呈显著性差异。在不含植物激素的培养基中不能形成愈伤组织, 生长素单用以及与细胞分裂素合用均可形成愈伤组织(表1)。细胞分裂素(6-BA、TDZ)主导着愈伤组织类型的形成, 在同时添加2, 4-D与6-BA或TDZ的培养基上可产生米黄色致密状胚性愈伤(类型Ⅰ , 图1-A), 而单独添加2, 4-D时则产生含有少量白色球形胚的米黄色疏松状愈伤(类型Ⅱ , 图1-B)。

愈伤组织诱导率与2, 4-D浓度呈正相关, 2, 4-D浓度越高则愈伤组织诱导率越高, 最高可达86%; 但当2, 4-D浓度达1.0 mg· L-1以上时, 差异不显著。低浓度2, 4-D诱导的愈伤组织生长旺盛, 分裂速度较快, 高浓度的2, 4-D(≥ 2.0 mg· L-1)诱导的愈伤生长缓慢, 在培养后期甚至出现部分褐化的现象。因此, 高浓度的2, 4-D可在一定程度上抑制土党参愈伤组织的生长甚至对其产生了一定的毒害作用。另外, 无论是在12 h光照/12 h黑暗处理还是在全黑暗处理的情况下, 土党参茎段愈伤组织诱导率以及相应的生长情况并没有显著差异, 可见土党参愈伤组织的形成对光照条件要求不严格。

2.2 激素配比对类型Ⅰ 愈伤组织再分化出芽的影响

致密愈伤组织(类型Ⅰ )在单独含有细胞分裂素(6-BA或TDZ)或与GA3相配合的培养基上均可再分化出不同程度的芽点(图1-C), 而不含任何植物激素的对照组(CK)则产生大量根并褐化死亡, 推测细胞分裂素是愈伤组织再分化出芽的必要条件。虽然单独使用6-BA或TDZ均可诱导芽的分化, 但是诱导再分化出芽的效果却有显著差异。TDZ诱导效果最高, TDZ浓度为0.5~1.5 mg· L-1时, 出芽率和平均芽点数随着浓度的升高而增加, 最高分别可达81.4%和203个。虽然分化出的芽体叶片均为卷缩, 芽点均不能伸长形成正常态的嫩芽, 在相同培养基上继代培养30 d后芽体依然不能伸长形成常态芽, 但可使不定芽块长大并出现更多的芽点(表2)。

表2 不同植物激素及其组合对Ⅰ 类愈伤组织再分化的影响 Table 2 Effects of different phytohormone and their combinations on differentiation of callus type Ⅰ

在含有不同浓度6-BA(0.5、1.0 mg· L-1)与TDZ(0.01、0.1 mg· L-1)组合的培养基上, 致密的愈伤组织在培养10 d左右开始变得松散, 同时开始出现绿色芽点。培养30 d后该愈伤组织出现的芽点不能伸长, 只是疏松的愈伤组织出现了部分增殖。取含该绿色芽点的疏松愈伤组织于体视镜下观察发现, 在绿色芽点当中杂夹着少量的球形胚(图2-A)和心形胚(图2-B); 胚根伸长形成根, 但胚芽愈伤化并长出次级体细胞胚的“ 畸形成熟胚” , 无正常的成熟胚(图2-C), 同时还发现在部分球形胚上面也长出了次级体细胞胚(图2-D)。由此可知, 6-BA与TDZ的协同作用有助于体细胞胚的形成, 但是体细胞胚形成的质量较差。

图1 土党参愈伤组织诱导及植株再生Fig.1 Plant regeneration via callus from aseptic stems of C. javanica.

含有NAA的培养基上培养的愈伤组织均可再分化产生大量的根, 但芽分化率与出芽程度均较低, 仅在长满根的致密愈伤组织块上零星地分布一些芽, 该芽体叶片舒展, 芽长势正常(表2)。

综上所述, 最适的诱导愈伤组织分化出芽培养基为:MS+1.5 mg· L-1TDZ; 6-BA与NAA同时作用时有助于体细胞胚的形成, 含有NAA的培养基不适合愈伤组织再分化出芽。

图2 处于不同时期的体细胞胚(A, 球形胚; B, 心形胚; C, 畸形胚; D, 在球形胚上形成了次级体细胞胚, 如白色箭头所示。标尺代表的实际长度为0.5 mm)Fig.2 Somatic embryos at different stages(A, Globular embryos; B, Heart-shaped; C, Abnormal embryo; D, Secondary embryos formed on the surface of primary globular embryos (white arrow). Bars=0.5 mm)

2.3 芽的伸长与增殖

表3可知, GA3在簇生芽的伸长方面具有重要作用。虽然单一添加6-BA或KT的培养基中不定芽出现增殖且无褐化现象, 但不定芽块的芽点致密, 不能伸长; 6-BA与NAA配合使用时, 部分不定芽增殖, 但仅有少量的芽可以伸长, 大部分芽块出现了褐化现象。在GA3培养基上培养的不定芽均可以出现不同程度的伸长, 芽伸长率与平均芽伸长数最高分别可达90.55%与102个, 几乎整个不定芽块的芽体都得以伸长且叶片舒展, 长势旺盛(图1-D)。单独添加2.0 mg· L-1 GA3的培养基上芽长势旺盛, 但是没有新的芽形成; 当GA3与6-BA、NAA配合使用时不定芽块长势最好, 既有芽的伸长也有芽的增殖。由表3可知, 诱导不定芽块伸长的较好配方为:MS+0.5 mg· L-1 6-BA+0.1 mg· L-1 NAA+0.5 mg· L-1 GA3

在含有6-BA、NAA与TDZ的MS培养基上, 虽然芽块伸长率较低, 但将伸长的芽体从不定芽块上剥离并转接于相同培养基上, 在茎段的切口基部会产生绿色致密的愈伤组织, 同时在基部产生大量丛生芽, 可知该类培养基配比不适合诱导芽的分化与伸长, 而适合于丛生芽产生与扩繁。

表3 不同植物激素及其组合对土党参芽伸长与增殖的影响 Table 3 Effects of different phytohormone and their combination on shoots elongation and propagation of C. javanica
2.4 生根培养与炼苗移栽

健壮的枝条置于300 mg· L-1 IBA 溶液中浸泡处理15 min后, 转接至MS无激素培养基上, 7 d左右开始陆续生根, 30 d后生根率达到100%, 每株平均生根数为5.3条, 植株茎秆健壮, 叶片翠绿(图1-E)。自然光照下炼苗7 d后, 用自来水冲洗根部附着的琼脂后移栽于土壤中, 30 d后移栽成活率为73.3%, 小苗长势良好(图1-F)。

3 讨论

本研究以无菌苗的带芽茎段为材料, 以MS为基本培养基, 单独使用2, 4-D或与6-BA、TDZ进行配合, 分别获得了2种类型的愈伤组织。单独添加2, 4-D诱导获得的是米黄色疏松愈伤组织(类型Ⅱ ), 而米黄色致密状胚性愈伤(类型Ⅰ )的诱导需2, 4-D与6-BA或TDZ配合使用, 表明细胞分裂素对诱导出的愈伤组织类型至关重要。不同质地的愈伤组织有不同的用途, 疏松易分散的愈伤组织适于悬浮培养, 用于研究细胞结构以及相关药用成分的大规模生产; 致密的愈伤组织具有较高的繁殖效率, 可为多倍体育种、转基因和细胞突变育种提供基础, 因此, 可根据不同需求来诱导不同的愈伤组织。

米黄色致密状胚性愈伤(类型Ⅰ )在单独含有细胞分裂素(6-BA或TDZ)或与GA3相配合的培养基上均可再分化出数量不等的芽点, 而在添加NAA的培养基上可分化出大量根但没有芽, 因此, 在器官分化阶段不适宜添加NAA。分化出的芽点均不能伸长形成正常的嫩芽, 在相同培养基上继代培养30 d后不定芽块长大, 但芽体依然不能伸长形成常态芽。将不定芽块转移至GA3与6-BA、NAA配合的培养基, 芽既可以伸长又可维持一定的增殖; 仅采用6-BA与NAA配合可获得一定的芽增殖率, 但不能促使芽伸长, 表明GA3在芽的伸长中具有重要作用。本研究中, 实现土党参愈伤组织再分化出正常芽需要2步, 即先将愈伤组织诱导出含有密集芽点的不定芽块, 再将该芽块继代于含有GA3的芽伸长培养基上进行芽伸长诱导, 这与杜鹃花[19]、印度黄檀[20]以及菜花[21]等植物的植株再生过程相一致。

米黄色致密状胚性愈伤(类型Ⅰ )在含有不同浓度6-BA(0.5、1.0 mg· L-1)与TDZ(0.01、0.10 mg· L-1)组合的培养基上再分化出芽时, 还观察到了体细胞胚的形成, 但所占比例较小, 后续研究可尝试调整6-BA与TDZ的浓度, 提高此类愈伤组织分化成体细胞胚的比例。后续实验将进一步研究单独添加2, 4-D诱导获得的米黄色疏松愈伤组织(类型Ⅱ )。

The authors have declared that no competing interests exist.

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