引用本文
李幽幽, 李小璟, 龚双燕, 敖英, 朱玲, 徐志文. 2013—2016年四川省猪繁殖与呼吸综合征病继发细菌感染的病原学分析[J]. 浙江农业学报, 2017,29(9): 1437-1444.
LI Youyou, LI Xiaojing, GONG Shuangyan, AO Ying, ZHU Ling, XU Zhiwen. Etiology analysis of the bacterial secondary infection of PRRSV in Sichuan Province from 2013 to 2016[J]. ACTA AGRICULTURAE ZHEJIANGENSIS, 2017,29(9): 1437-1444.  
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2013—2016年四川省猪繁殖与呼吸综合征病继发细菌感染的病原学分析
李幽幽1, 李小璟1, 龚双燕1, 敖英1, 朱玲1,2,*, 徐志文1,2
1.四川农业大学 动物医学院,四川 成都 611134
2.四川农业大学 四川省动物疫病与人类健康重点实验室,四川 成都 611134
*通信作者,朱玲,E-mail:abtcxzl72@126.com

作者简介:李幽幽(1992—),女,四川江油人,硕士研究生,从事动物传染病病原分子生物学方向的研究。E-mail:sclyy@hotmail.com

收稿日期: 2017-04-11
基金资助: 国家“十二五”科技支撑计划(2015BAD12B04-2.3); 四川省科技支撑计划 (2014NZ0043)
摘要

为给近几年临床控制和治疗PRRSV继发感染提供参考依据,对2013—2016年来自四川省各地感染PRRSV的112头病猪病料进行细菌分离,经形态学观察、选择培养、生化鉴定。分离得到葡萄球菌(MRS)、链球菌、多杀性巴氏杆菌(PM)、大肠埃希菌( Escherichia coli)、猪胸膜肺炎放线杆菌(App)。其中葡萄球菌的分离率最高(70%),其次为多杀性巴氏杆菌(50%),大肠埃希菌(40%),猪胸膜肺炎放线杆菌(40%),链球菌(30%);继发感染主要发生于肝脏和肺脏,其次是脾和心包积液。动物试验结果表明,多杀性巴氏杆菌、大肠埃希菌、链球菌、胸膜肺炎放线杆菌具有致病性。药敏试验结果表明: 多杀性巴氏杆菌对环丙沙星敏感,对庆大霉素中度敏感;大肠埃希菌对丁胺卡那敏感,对氨苄西林、庆大霉素、新霉素中度敏感;链球菌对卡那霉素中度敏感;猪胸膜肺炎放线菌对环丙沙星中度敏感。

关键词: 猪繁殖与呼吸综合征; 细菌; 继发感染; 病原学
中图分类号:S855.1 文献标志码:A 文章编号:1004-1524(2017)09-1437-08 doi: 10.3969/j.issn.1004-1524.2017.09.03
Etiology analysis of the bacterial secondary infection of PRRSV in Sichuan Province from 2013 to 2016
LI Youyou1, LI Xiaojing1, GONG Shuangyan1, AO Ying1, ZHU Ling1,2,*, XU Zhiwen1,2
1. College of Veterinary Medical, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611134, China
2. Key Laboratory of Animal Disease and Human Health of Sichuan Province, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611134, China
Abstract

This experiment was conducted to provide references for clinical management and treatment of PRRSV secondary infections. In this study, morphology observation, selective culture, biochemical identification were used to identify the secondary infective bacteria of PRRSV around 112 piglets from Sichuan province in 2013-2016. Staphylococcus aureus, Streptococcus, Pasteurella multocida, Escherichia coli and Actinobacillus pleuropeumoniae were isolated. Isolation rate of Staphylococcus aureus was the highest (70%), followed by Pasteurella(50%), Escherichia coli (40%), Actinobacillus pleuropneumoniae(40%), Streptococcus (30%). Secondary infection occurred mainly in the liver and lungs, followed by spleen and pericardial effusion. Animal experiments showed that Pasteurella multocida, Escherichia coli, Streptococcus, Actinobacillus pleuropneumoniae were pathogenic. Susceptibility testing showed that Pasteurella multocida was highly sensitive to ciprofloxacin, moderately sensitive to gentamicin; Escherichia coli was highly sensitive to amikacin, and moderately sensitive to ampicillin, gentamicin and neomycin; Streptococcus was moderately sensitive to kanamycin; Actinobacillus pleuropneumoniae was moderately sensitive to ciprofloxacin.

Keyword: PRRSV; bacteria; secondary infection; etiology

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS), 又称蓝耳病, 是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的怀孕母猪发热、厌食、早产、晚期流产、死胎、弱仔和木乃伊胎儿等繁殖障碍以及仔猪的呼吸系统症状和高死亡率的接触性传染病, 同时它能引起免疫抑制、继发感染等[1]。由于本病的复杂性, 尤其是感染PRRSV后, 感染猪对其他致病因子的易感性增加, 出现免疫抑制和亚临床感染等特点[2], 给PRRS的防制工作带来了很多不利因素。目前, PRRS几乎遍及世界各养猪国家, 给世界养猪业造成了巨大的经济损失。

PRRSV属动脉炎病毒科动脉炎病毒属, 是一种有囊膜的单股正链RNA病毒[3]。PRRSV 主要作用于巨噬细胞系, 这些细胞在免疫应答中起重要作用, 包括对细菌的破坏。机体感染PRRSV后, 免疫器官受到严重损害, 造成免疫抑制[4, 5], 从而引发多种病原的继发感染, 使疫病复杂化。研究表明, PRRSV与其他病原体, 如猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2, PCV-2)、链球菌(Streptococcus, GBS)、副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis, HPS)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida, PM)等的继发和混合感染[6]是引致猪“ 高热病” 发生的原因。已有报道PRRSV能增强机体对猪链球菌的易感性[7]。由于疫苗的应用或发病后大量抗菌药物的应用使细菌病较难显现出来。

本试验对近年来四川省感染PRRSV后发病仔猪病料进行继发感染细菌的分离和鉴定, 并用分离菌进行动物试验和药敏试验, 现报告如下。

1 材料与方法
1.1 主要试剂

LB培养基、普通琼脂平板、巧克力琼脂平板、鲜血琼脂平板、麦康凯平板、大豆酪蛋白琼脂(TSA)培养基及革兰氏染液等由实验室制备; 药敏纸片和微量生化鉴定管购自杭州微生物试剂公司。

1.2 供试动物

健康1月龄BALB/c小白鼠50只, 购自四川大学华西医学院。212头疑似PRRS发病猪来自2013-2016年间四川省成都、绵阳、乐山、雅安、眉山等地的规模化猪场。

1.3 细菌分离纯化及鉴定

采用常规PCR对疑似病猪进行检测, 对检测为PRRSV阳性并且其他病毒为阴性的发病猪进行无菌采集病料, 共计112份, 每份包括肺脏、肝脏、脾脏、心包积液。分别划线接种巧克力琼脂平板, 37 ℃培养24 h, 观察菌落形态特征 , 根据不同菌落的形态描述编号A、B、C、D、E, 挑取形态不同的单菌落再次接种巧克力琼脂平板, 37 ℃培养24 h进行纯培养。

1.3.1 菌落形态学检查

对纯化细菌进行革兰氏染色镜检, 观察染色情况, 并根据细菌形态初步确定分离菌的细菌种类。

1.3.2 鉴别培养

将分离的细菌分别划线接种普通琼脂平板, 鲜血琼脂平板, 麦康凯平板。置37 ℃培养24 h。观察菌落的生长状态及菌落特征。并进行革兰染色、镜检。从而得出各种菌的营养要求及培养特性。

1.3.3 生化鉴定

将分离出的细菌接种于10 mL LB液体培养基, 37 ℃振荡培养12 h后呈现浑浊即成供试细菌菌液。根据前期的初步鉴定, 将疑似菌根据其各自的生化反应特性, 选择相应的生化反应试剂。细菌接种微量生化鉴定管后, 置于37 ℃培养24 h, 观察并记录结果。结果评定参照参考文献[7]和[8]。

1.3.4 动物致病性试验

将菌液17 000 g离心5 min去掉上清, 用生理盐水重悬菌体, 用比浊法测定菌悬液浓度后注射小鼠, 菌悬液浓度分别为:葡萄球菌4.94× 108 个· mL-1、链球菌3.55× 108 个· mL-1、多杀性巴氏杆菌5.58× 108 个· mL-1、大肠杆菌1.99× 109 个· mL-1、猪胸膜肺炎放线杆菌4.83× 108 个· mL-1。随机将小鼠分为10个小组, 每组5只。每种菌设对照组和处理组。处理组:按照每只0.2 mL重悬菌液对试验用健康小白鼠进行腹腔注射; 对照组:每只注射0.2 mL生理盐水。同等条件下正常饲喂小白鼠3 d, 观察小白鼠的致死情况。从死亡小白鼠的脾脏再次提取分离出细菌, 判断是否为原分离菌。

1.3.5 药敏试验

取100 μ L经纯培养的菌液均匀涂布于普通琼脂平板, 待稍干后, 根据不同种类细菌选择相应耐药试验的药敏纸片, 每片药敏纸片的药物含量均为30 μ g。用无菌镊子将各种药敏纸片分别平贴在培养基表面, 4 ℃培养2 h使药物扩散, 然后置37 ℃培养24 h, 观察结果。按抑菌圈直径大小和各抗菌药的具体标准, 根据药敏纸片生产厂家的抑菌圈判断标准, 判断药物的敏感性。

2 结果与分析
2.1 分离菌的培养特性及形态特征

对检测为PRRSV阳性并且其他病毒病为阴性的112头发病猪无菌采集病料, 进行细菌分离, 共分离出5株未知菌, 其菌落形态特征见表1, 分离过程中我们发现继发感染细菌主要分布于肺脏和肝脏, 其次是脾和心包积液。在112份病料中, 菌种分离情况见表2。其中, E菌分离率最高(70%), 其次为A菌(50%)、B菌(40%)、D菌(40%)、C菌(30%)。

表1 菌落形态特征及培养特性 Table 1 The morphological and cultural characteristics of the bacteria
表2 PRRS病猪细菌分离情况 Table 2 The bacterial separation situation of 112 PRRS pigs
2.2 革兰氏镜检结果

对纯化细菌进行革兰氏染色镜检, 观察染色情况和细菌形态初步确定分离菌种类, 在分离的5株菌中, 有2株革兰氏阳性球菌(图1-A、C), 3株革兰氏阴性杆菌(图1-B、D、E)。

图1 革兰氏染色镜检结果
A, G+球菌(双球或短链状排列分布); B, G-球杆菌(典型的球杆菌形态); C, G+球菌(葡萄串状排列); D, G-杆菌(两端钝圆的短杆菌); E, G-杆菌(两端钝圆红色无芽孢的直杆菌); Fig.1 Results of gram staining microscopic examination
A, Gram-positive coccus (Double or short chain arrangement) (400× ); B, Gram-negative bacillus ball (Typical bacillus morphology) (400× ); C, Gram-positive coccus (Grapes arranged in a row) (400× ); D, Gram-negative Bacillus (Both ends of the blunt blight) (400× ); E, Gram-negative Bacillus (Rhizoctonia solani with both ends of blunt red) (400× )

2.3 生化鉴定

将分离得到的5株细菌经处理后接种于微量生化鉴定管, 置于37 ℃培养24 h, 具体结果见表 3。参考细菌鉴定手册, 标准菌株的生化反应特性可以初步鉴定所分离的细菌种类, 初步判定A 为多杀性巴氏杆菌(图1-B); B为大肠埃希菌(图1-E); C为链球菌(图1-A); D为胸膜肺炎放线杆菌(图1-D); E为葡萄球菌(图1-C)。

表3 细菌生化鉴定结果 Table 3 Biochemical identification of bacteria
2.4 动物致病性试验

用0.2 mL生理盐水注射对照组小鼠, 以每只0.2 mL的量注射实验组小鼠, 用比浊法测定菌悬液浓度分别为:葡萄球菌4.94× 108 个· mL-1、链球菌3.55× 108 个· mL-1、多杀性巴氏杆菌5.58× 108 个· mL-1、大肠埃希菌1.99× 109 个· mL-1、猪胸膜肺炎放线杆菌4.83× 108 个· mL-1。同等条件下正常饲喂小白鼠3 d, A、B、C、D细菌处理组小鼠均死亡, 表明从肝、肺、脾、心包积液等部位分离得到的多杀性巴氏杆菌、大肠埃希菌、链球菌、胸膜肺炎放线杆菌均具有致病能力; E细菌处理组小鼠均未死亡, 表明葡萄球菌没有致病能力; 注射生理盐水的对照组小鼠均未死亡。将处理组死亡小白鼠的脾脏用于分离细菌, 结果能够分离出原致病菌。

2.5 药敏试验

将分离得到的致病菌分别进行药敏试验, 观察抑菌圈直径大小, 根据CLSI药敏试验判断标准, 判断药物的敏感性。结果显示, 多杀性巴氏杆菌对环丙沙星、头孢唑啉敏感, 对庆大霉素、呋喃唑酮中度敏感; 大肠埃希菌对丁胺卡那敏感, 对氨苄西林、庆大霉素、新霉素中度敏感; 链球菌对头孢哌酮IV敏感, 对卡那霉素中度敏感; 猪胸膜肺炎放线菌对头孢哌酮、头孢哌酮IV敏感, 对环丙沙星中度敏感(表4)。

表4 致病菌的几种常用药物抑菌圈直径 Table 4 Inhibition zone diameter of several commonly used drug for pathogen mm/sensitivity
3 讨论

PRRSV是一种免疫抑制性病原, 有研究发现病猪的免疫器官和淋巴细胞遭受了严重损伤[8], 其中淋巴结、脾表现坏死性炎症变化, 细胞病变主要发生在单核巨噬细胞系统; 各种细胞器遭受普遍性的膜结构损伤, 其中以线粒体和粗面内质网变化较为严重。这应是产生免疫抑制的病理基础[9], 因此能引发多种病原(细菌、病毒、寄生虫等)的继发感染, 使疾病复杂化。

由PRRSV单独感染造成的临床病理变化, 多表现为间质性肺炎, 但试验病猪临床上引起的病理变化比PRRSV单独感染较严重, 证明PRRSV与其他病原体可能存在相互协同作用。当动物机体抵抗力低下时, 便趁机侵入体内, 致使动物发病。未死亡的猪经扑杀解剖后发现除肺脏有明显病变外, 其他器官无肉眼可见的病理变化。大量文献证明PRRSV感染的特征性病变出现在肺脏, 由于PRRSV损害和破坏肺部免疫细胞, 导致了肺部抵抗外来病原感染的能力下降, 从而致使其呼吸道和肺部容易遭受各种病原的混合感染或继发感染。从试验结果看, 在猪感染PRRSV后, 再由某些相关联的病原继发感染或协同作用导致机体免疫力严重下降[10]。造成机体免疫力下降是继发细菌感染的主要因素。继发感染在PRRSV的致病程度上起着重要作用, 这为临床控制继发感染提供了理论参考。

在112份病样中, 分离率由高到低为葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌, 其次为猪胸膜肺炎放线杆菌和猪链球菌。其中葡萄球菌易继发, 但大多为非致病菌。试验发现, PRRSV最易继发巴氏杆菌和大肠埃希菌感染, 大多数PRRSV感染猪的肺部继发感染了多杀性巴氏杆菌, 所以在临床用药时考虑致病菌的耐药性, 使用高敏感药物, 例如环丙沙星和先锋霉素V。本次试验发病猪采用四川省各市县不同地区的规模化猪场, 受遗传影响的猪的病毒易感性差异, 猪场之间的环境差异, 猪场间管理的差异, PRRSV免疫水平差异等因素的互作效应使PRRSV发病严重程度不同, 所以每份病料所分离出的细菌存在一定差异。本次试验主要分析112份病料总体的继发细菌感染情况, 现在养猪业主要问题集中在继发细菌感染对PRRSV发病的影响, 所以对病原分离率及分离部位的研究可以指导治疗药物研究、用药及预防, 具有很现实的临床意义。另外, 在PRRS的继发感染中, 继发感染副猪嗜血杆菌有很大概率, 并且此次试验的临床病变特征有极其相似的病例, 特别是肺脏的病变, 然而在试验中却没有分离出副猪嗜血杆菌。原因可能是其本身在病料中的分离率比较低, 一般患病猪死亡12 h后, 在病料中几乎分离不到副猪嗜血杆菌, 因此需在患猪剖杀或死亡12 h内及时进行病原分离。而且副猪嗜血杆菌对营养要求苛刻, 其在巧克力培养基上培养48 h生长也较差, 导致该菌不容易被分离[11]。此外, 目前各猪场在实际生产中广泛使用抗生素, 也是副猪嗜血杆菌分离率比较低的原因之一。可考虑提高培养基中的生长因子和血清的浓度以提高副猪嗜血杆菌分离率; 就分离部位而言, 肺组织内的小支气管更容易分离出该菌。

本试验采取不同PRRSV感染的病料, 进行继发菌的分离与鉴定, 从试验结果可以统计出, 在PRRSV感染的不同阶段, 其继发的病原存在差异。在采集的112份样品中, 50%以下猪感染PRRSV的规模化猪场, 分离到葡萄球菌、猪巴氏杆菌; 50%~60%的猪感染PRRSV的规模化猪场采集病料, 分离到葡萄球菌、胸膜肺炎放线杆菌、大肠埃希菌和巴氏杆菌; 60%以上的猪感染PRRSV的规模化猪场采集病料, 分离得到猪链球菌、巴氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、大肠埃希菌等。由此可以看出, 在PRRSV感染致病过程中, 随着病变历程的加重, 其继发感染越复杂, 病变也越严重, 两者是相互促进的。这可能是因为在PRRSV感染过程中, 病毒粒子的大量繁殖侵害猪体的免疫系统导致其免疫抑制效应和免疫干扰加强, 造成机体抵抗外界病原的抵抗力大大减弱, 更容易造成继发与混合感染, 同时使病情加重。

从发病猪的临床病变看, 病患猪有很明显的肺炎症状, 采集的肺脏可见肺水肿、肺部呈淡红色, 半透明状, 似“ 肉变” , 而在病变加重的患猪肺表现为“ 胰变” , 这些表现极有可能是支原体感染的加重造成的。有研究发现, 猪肺炎支原体能使PRRSV引起的肺炎加重, 证明猪肺炎支原体与PRRSV混合感染时, 猪肺炎支原体明显延长和增加PRRSV肺炎的严重性[12]。再次, 结合PRRSV感染的致病机理来看, PRRSV主要侵害肺泡及血液等组织的巨噬细胞和单核细胞, 使肺泡巨噬细胞及单核细胞的正常功能受到抑制, 从而导致病原体的入侵, 这也与支原体引起的肺部病变的机制相一致。因此, 可以推断, 猪肺炎支原体在增强PRRSV肺炎的稽留期和严重性方面起着重要作用。笔者将对PRRSV感染猪继发感染支原体的情况做进一步研究。

对继发细菌病的研究, 特别是分析其耐药性, 可以有效预防传染病的发生和发展, 本试验对分离菌的耐药性分析可以有效地指导临床疾病的预防、诊断及治疗。使用抗菌谱广的药物并增加使用量或配合多种抗生素, 这会逐渐增加细菌的耐药范围, 引起“ 二重感染” [13], 给以后的治疗带来极大的困难。药物治疗应根据药敏试验结果选择高敏药物, 需要正确合理地使用抗生素, 在药敏试验的基础上有针对性地使用首选药, 避免重复使用耐药水平高的抗生素。在本研究中, 鉴于致病菌对多种常用抗生素有耐药性, 药敏试验中选择了呋喃唑酮、头孢哌酮、头孢哌酮IV、头孢唑啉等人专用的抗生素, 结果显示致病菌对这些药物敏感, 使用该类药物会抑制细菌生长, 同时也会使致病菌产生更强的耐药性, 所以不建议使用人用的抗生素治疗相应继发感染。建议大规模猪场定期分离细菌进行药敏试验, 及时掌握耐药情况, 不再选用已有耐药性的药物治疗病猪, 避免治疗失败带来严重的损失。在兽医临床上应采取以预防为主, 治疗为辅的原则, 以减少经济损失。

The authors have declared that no competing interests exist.

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