鳖源嗜水气单胞菌的耐药性研究
朱凝瑜, 郑晓叶, 曹飞飞, 李杨阳, 郑天伦*
浙江省水产技术推广总站, 浙江 杭州 310023
*通信作者,郑天伦,E-mail:nballan@163.com

作者简介:朱凝瑜(1984—),女,浙江长兴人,硕士,工程师,从事水产养殖病害研究。E-mail:zny1984@sina.com

摘要

对10株分离自患病中华鳖的嗜水气单胞菌进行了耐药性研究。药敏试验结果表明,这10株嗜水气单胞菌呈现相近的耐药谱,对阿米卡星、新霉素、头孢哌酮、氨曲南、多西环素、诺氟沙星、恩诺沙星等7种药物均敏感,对青霉素G、林可霉素、万古霉素、甲氧嘧啶等4种药物耐药,对氟苯尼考、四环素、复方新诺明产生了不同的耐药性。同时对 qnrA qnrB qepA等17种耐药基因进行检测,10株菌均检测到了2~11种耐药基因,检出率最高的耐药基因为 qnrA cat 1,达到了100%,而 qepA aph(3')、 sul Ⅱ sul Ⅲ OXA等5个基因未检出。同种细菌不同分离株表现出不同的耐药性,提示用药时有必要针对病原进行药敏试验,筛选敏感药物进行疾病防治。

关键词: 中华鳖; 嗜水气单胞菌; 药敏试验; 耐药基因
中图分类号:S941.42;S947.1+2 文献标志码:A 文章编号:1004-1524(2017)09-1445-06 doi: 10.3969/j.issn.1004-1524.2017.09.04
Antimicrobial resistance of Aeromonas hydrophila isolated from soft-shelled turtle Pelodiscus sinensis
ZHU Ningyu, ZHENG Xiaoye, CAO Feifei, LI Yangyang, ZHENG Tianlun*
Zhejiang Fisheries Technical Extension Center, Hangzhou 310023, China
Abstract

The antimicrobial resistance of 10 Aeromonas hydrophila strains collected from diseased soft-shelled turtle Pelodiscus sinensis was studied in this paper. Drug sensitive tests showed that all the 10 strains were sensitive to Amikacin, Neomycin, Cefoperazone, Aztreonam, Deoxytetracycline, Norfloxacin, Enrofloxacin and were risistent to Penicillin G, Lincomycin, Vancomycin, Sulfamethoxydiazine, but they showed different susceptibility to Florfenicol, Tetracycline, SMZ-TMP. At the same time, 17 antimicrobial resistant genes in the 10 strains were detected by PCR. The results showed that all these 10 strains carried 2-11 resistance genes. The highest detection rate of resistant gene qnrA and cat 1 reached 100% , while qepA, aph(3'), sul Ⅱ, sul Ⅲ, OXA were not detected. Different Aeromonas hydrophila strains showed different antimicrobial resistance, suggesting that it was necessary to carry out drug sensitivity tests before treating and preventing.

Keyword: Pelodiscus sinensis; Aeromonas hydrophila; drug sensitive tests; antimicrobial resistant gene

中华鳖(Pelodiscus sinensis)是浙江省最重要的水产养殖品种之一, 对全省渔业经济和渔民增收作出了重要贡献。据统计, 2015年浙江省中华鳖养殖产量达到13.3万t。随着养殖的快速发展和集约化程度的不断提高, 中华鳖在养殖过程中发病日趋增多, 给养殖业带来了巨大的经济损失[1]。细菌性疾病作为中华鳖养殖过程中的主要病害种类, 发病范围广, 持续时间长, 危害程度大。对细菌性疾病的防治主要依赖各种抗菌性药物, 但随着时间推移, 细菌逐渐对常见抗菌药物产生了耐药性[2], 因此近年来使用抗菌药物防治中华鳖细菌病的效果不尽如人意。为摸清浙江省中华鳖主要病原菌的耐药性现状, 正确指导用药, 减少药物残留风险, 以中华鳖最常见也最主要的病原菌— — 嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila, AH)为代表, 对其耐药性开展了初步研究。

1 材料与方法
1.1 试验材料

嗜水气单胞菌10株(后简称AH1~10), 由本实验室分离自浙江省内有关中华鳖养殖场, 其中AH1、AH2采自海宁某养殖场, AH3采自海盐, AH4~AH8采自杭州某2个养殖场, AH9采自德清, AH10采自兰溪。经VITEK2-Compact全自动细菌鉴定、药敏分析仪鉴定及16s rRNA测序确认为嗜水气单胞菌。

脑心浸液培养基(BHI)购自青岛海博微生物公司。阿米卡星、新霉素、青霉素G、头孢哌酮、氨曲南、氟苯尼考、四环素、多西环素、林可霉素、万古霉素、诺氟沙星、恩诺沙星、甲氧嘧啶和复方新诺明等14种药敏纸片购自杭州微生物有限公司。

PCR扩增引物由生工生物工程技术服务(上海)有限公司合成。Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒、PCR试剂(10× PCR 缓冲液, 10 mmol· L-1 dNTP, Taq 酶, 灭菌双蒸水, 25 mmol· L-1的MgCl2)、琼脂糖、50× TAE的电泳缓冲液、80 ng· μ L-1的DNA marker 2000、6× loading buffer、核酸染料等购自生工生物工程技术服务(上海)有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 药敏试验

采用常规纸片扩散(K-B)法[3], 在BHI培养基上进行8类14种常用抗菌药物的抗菌敏感性测定, 经28 ℃恒温培养24 h后, 测量抑菌圈大小。每种药物对每株细菌均设3个平行试验组, 根据其抑菌圈直径大小的平均值, 参照NCCLS的判断标准[4]判定各药物对细菌的药效。

1.2.2 耐药基因测定

用Ezup柱式细菌基因组抽提试剂盒对10株嗜水气单胞菌进行DNA提取, 再PCR检测17种耐药基因。耐药基因引物序列如表1所示。

表1 嗜水气单胞菌耐药性基因检测引物 Table 1 PCR primers used to amplify antimicrobial resistant genes of Aeromonas hydrophila

PCR反应总体积为25 μ L, 包括DNA模板2.0 μ L, 10× Buffer PCR 缓冲液2.5 μ L, 10 mmol· L-1 dNTP 2.0 μ L, 10 mol· L-1细菌各耐药基因引物各0.5 μ L, 5 U· μ L-1Taq 酶0.3 μ L, 然后用灭菌双蒸水ddH2O补充至25 μ L。PCR 反应参数:预变性94 ℃ 10 min, 然后94 ℃变性40 s, 56 ℃退火30 s, 72 ℃复性50 s, 30个循环; 最后72 ℃延伸10 min。

2 结果与分析
2.1 药敏试验

10株嗜水气单胞菌的药敏试验结果见表2。结果显示这10株菌呈现出明显的耐药性, 耐药率分别为青霉素G 100%、林可霉素100%、万古霉素100%、甲氧嘧啶100%、复方新诺明40%、氟苯尼考10%、四环素10%。

表2 十株嗜水气单胞菌的药物敏感性 Table 2 Antimicrobial susceptibility of 10 Aeromonas hydrophila strains

10株嗜水气单胞菌的耐药谱大致相近, 均对青霉素G、林可霉素、万古霉素、甲氧嘧啶等4种药物耐药, 而对阿米卡星、新霉素、头孢哌酮、氨曲南、多西环素、诺氟沙星、恩诺沙星等7种药物敏感。但在氟苯尼考、四环素、复方新诺明等3种药物上, 产生了不同的耐药性:菌株AH1~9对氟苯尼考、四环素敏感, 而AH 10耐药; 菌株AH3、5~9对复方新诺明敏感, 而AH1、2、4、10则耐药。

耐药频数分析表明, 嗜水气单胞菌分离株均对1种或多种抗生素耐药。其中6 株对4 种抗生素耐药, 占60%; 3 株对5 种抗生素耐药, 占30%; 1 株对7 种抗生素耐药, 占10%。

2.2 耐药基因检测

对10株嗜水气单胞菌的17个耐药基因进行了PCR扩增检测, 所有10株菌均检测到了耐药基因, 数量2~11个不等(表3), 其中菌株AH10含耐药基因最多达11种; 菌株AH1与AH2、AH4相同, 含耐药基因5个; 菌株AH5与AH6、7、8所含耐药基因相同, 为3个; 菌株AH10所含耐药基因与其他菌株差异性较大。

表3 十株嗜水气单胞菌的耐药基因检测结果 Table 3 Results of antimicrobial resistant genes detected in 10 Aeromonas hydrophila strains

耐药基因中, 检出率最高的为qnrAcat 1, 达到了100%, qnrS也较高为80%, sul Ⅰ 检出率为50%, qnrBfloRcml Acat Bant(3″)、aac(6')-Iaac(3)-ITEM检出率10%~30%, qepAaph(3')、sul Ⅱ sul Ⅲ OXA等5个基因未检出。

3 讨论

嗜水气单胞菌属弧菌科气单胞菌属, 广泛分布于自然界的各种水体, 属于条件致病菌, 是鱼类、两栖类、爬行类和哺乳类动物最主要的致病菌之一[5, 6]。对于中华鳖, 嗜水气单胞菌感染可引起红脖子病、红底板病、穿孔病、腐皮病、白底板病等多种疾病, 危害极大[7, 8, 9, 10, 11, 12]

抗菌药物治疗仍然是防治细菌性疾病的最主要手段之一。近年来, 随着广谱抗菌药物的广泛使用, 导致嗜水气单胞菌的耐药性呈增长趋势, 并产生了多重耐药性菌株[2], 给水生动物嗜水气单胞菌病的防治带来了新的难题和挑战, 同时严重影响水产动物源性食品的质量安全。

本次药敏试验表明, 浙江省内分离的这10株鳖源嗜水气单胞菌均呈多重耐药, 其中6株对4类抗生素中的4种药物产生耐药性, 占60%; 3株对4类抗生素中的5种药物耐药, 占30%; 1株对6类抗生素中的7种抗生素耐药, 占10%。10株细菌呈现相近的耐药谱:均对青霉素G、林可霉素、万古霉素、甲氧嘧啶等耐药; 对阿米卡星、新霉素、头孢哌酮、氨曲南、多西环素、诺氟沙星、恩诺沙星等7种药物敏感; 但在氟苯尼考、四环素、复方新诺明等3种药物上, 分离自兰溪的AH10与其他杭嘉湖菌株产生了较强的差异性, AH10对这3种药均耐药, 而其他几乎均为敏感, 呈现出一定的地域性, 这可能与菌株本身以及各地区用药习惯不同有关。同种细菌的不同分离株由于地域及所处环境不同, 对药物的敏感性也可能不同, 因此在生产过程中, “ 对症下药” 并不严谨, 有必要针对病原进行药敏试验, 筛选敏感药物进行疾病防治, 在提高治疗效果的同时, 也可避免因乱用、滥用药物造成的药物残留超标和环境污染等问题。

喹诺酮类耐药基因qnr能编码蛋白保护DNA螺旋酶上喹诺酮作用位点, 使其免受药物损伤, 减少药物敏感性[13]; qepA属于外排泵机制, 可将细胞质和细胞膜内的药物排出, 从而增加耐药性[14]。氯霉素类耐药基因 cat基因调控合成乙酰化转移酶使氯霉素类药物不能与细菌的核糖体结合从而缺乏抗菌活性; cmlA 基因与floR则与外排机制有关[15]。乙酰转移酶(aac)、核苷转移酶(ant)、磷酸转移酶(aph)均为修饰(钝化)酶, 经酶修饰的抗生素与细菌16S rRNA上位点的结合力下降从而导致药物抗菌活性的丧失[16]sulⅠ sulⅡ sul Ⅲ 编码对磺胺类药物亲和力更低的新二氢叶酸合成酶, 降低药物结合力[17] 。TEM、 OXA均为β 内酰胺酶, 可水解破坏进入菌体内的β -内酰胺类抗生素[18]。这17种耐药基因的检测结果表明, 所有菌株均含有2~11个数量不等的耐药基因, 其中检出率最高的为qnrAcat 1, 达到了100%, qnrS也有较高的检出率(80%), 而qepAaph(3')、sul Ⅱ sul Ⅲ OXA等5种基因未检出。携带耐药基因的现象普遍存在, 且多含有2种及以上耐药基因, 预示着可能存在出现超级耐药细菌的风险, 必须对病原菌的耐药性加以高度重视。

细菌耐药性与其本身特性、耐药基因、药物的常规使用情况等因素有关[19], 其中细菌耐药性的流行与耐药基因的存在有很大关系[20]。综合药敏试验、耐药基因的检测结果表明, 含耐药基因数量较多的菌株其耐药谱也相对较广; 氟苯尼考耐药基因floR阳性的菌株AH10相应的对氟苯尼考耐药; 磺胺类耐药基因sulⅠ 阳性的菌株与对复方新诺明的耐药性也几乎一致, 说明耐药基因的存在会使菌株产生相应的耐药性。但并未产生一一对应关系, 也存在对某种药物敏感的菌株却扩增出相应耐药基因的情况, 如喹诺酮类耐药基因qnrAqnrS均有较高的检出率, 但菌株却对喹诺酮类药物敏感; 或者存在同样扩增结果为阳性却表现出不同耐药性的菌株, 如sulⅠ 阳性的菌株AH 5在复方新诺明的耐药性上与其他该基因阳性菌株相反。这可能与耐药基因间的相互影响、基因的表达程度、不同药物的抗菌性能、表达蛋白酶的稳定性差异有关。后续将对耐药基因进行测序分析, 对阳性基因是否存在差异以及其与耐药性是否存在直接相关性进行研究, 并逐步开展耐药基因相互作用以及表达蛋白酶稳定性等研究, 为更好地阐明鳖源嗜水气单胞菌耐药性产生机制提供参考。

The authors have declared that no competing interests exist.

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