辣椒紫色酸性磷酸酶基因家族的鉴定与表达特征
庞欣1, 程远2, 郭勤卫3, 郑佳秋4, 万红建2,*
1.苏州农业职业技术学院,江苏 苏州 215008
2.浙江省植物有害生物防控重点实验室—省部共建国家重点实验室培育基地,浙江省农业科学院 蔬菜研究所,浙江 杭州 310021
3.衢州市农业科学研究院,浙江 衢州 324000
4.江苏沿海地区农业科学研究所,江苏 盐城 224002
*通信作者,万红建,E-mail:wanhongjian@sina.com

作者简介:庞欣(1985—),女,黑龙江哈尔滨人,博士,讲师,从事蔬菜遗传育种与分子生物学研究。E-mail:pxtracy916@163.com

摘要

紫色酸性磷酸酶(purple acid phosphatases,PAPs)属于金属磷酸酯酶家族,参与了植物大量的生理反应,特别是磷素的吸收与利用。本研究利用已经发表的辣椒基因组数据,采用同源比对方法对辣椒PAP基因家族进行鉴定与表达分析。通过鉴定发现辣椒基因组中至少含有25个PAP基因成员,氨基酸序列长度在264~639 aa,具有1~12个内含子,不均匀地分布在12条染色体上,仅发现1对基因以串联重复的形式存在。系统发育关系表明,辣椒、拟南芥和水稻PAP基因家族成员可以分为3个家族,8个亚家族,每个家族成员的数目是变异的,而且存在6对直系同源基因和20对旁系同源基因,这表明PAP基因家族的存在早于辣椒、拟南芥和水稻的分化。基于RNA-seq数据库和qRT-PCR方法,对辣椒PAP基因的组织表达及果实发育的不同时期进行分析,结果表明PAP家族基因具有组织表达特异性和发育时期表达特异性。

关键词: 辣椒; 紫色酸性磷酸酶; 基因家族; 生物信息学; 表达分析
中图分类号:S641.3 文献标志码:A 文章编号:1004-1524(2017)09-1498-08 doi: 10.3969/j.issn.1004-1524.2017.09.11
Genome-wide identification and expression analysis of purple acid phosphatases genes in pepper
PANG Xin1, CHENG Yuan2, GUO Qinwei3, ZHENG Jiaqiu4, WAN Hongjian2,*
1. Suzhou Polytechnic Institute of Agriculture, Suzhou 215008, China
2. State Key Laboratory Breeding Base for Zhejiang Sustainable Pest and Disease Control, Institute of Vegetables, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021, China
3. Quzhou Academy of Agricultural Sciences, Quzhou 324000, China
4. Jiangsu Coastal Area Institute of Agricultural Sciences, Yancheng 224002, China
Abstract

Purple acid phosphatases (PAPs) are members of the metallo-phosphoesterases involved in a variety of physiological functions, especially phosphate acquisition in plants. In this paper, genome-wide identification and analysis of PAP gene family members in pepper were performed with homologues alignment method. These results found that the whole pepper genome contains at least 25 PAP genes with protein sequence length varying from 264 to 639 aa. Number of introns ranged from 1 to 12. They are distributed unevenly on 12 chromosomes, only had one tandem duplication. Phylogenetic relationships showed that PAP genes from three plants species (pepper, Arabidopsis and rice) can be separated into 3 groups, 8 subgroups, and the number of each group is variable. Six and twenty pairs of orthologous and homologous genes were found, indicating that the diversity of PAP genes occurred before the split of pepper, Arabidopsis and rice. Based on the RNA-seq database and qRT-PCR method, the expression analysis of different tissues and fruit development stages indicated that these genes had tissue and development stages specificity.

Keyword: pepper; purple acid phosphatases; gene family; bioinformatics; expression analysis

紫色酸性磷酸酶(purple acid phosphatases, PAPs)是一种普遍存在于动、植物体内的金属磷脂酶蛋白, 能在酸性条件下催化磷酸酯或酸酐水解成无机磷酸根[1]。研究发现, 在PAPs 羧基端具有一个由5个基序组成的保守结构域, 且含有7个金属配对氨基酸残基(DXG/GDXXY/GNH(D/E)/VXXH/GHXH; 粗体代表金属配对残基), 此外还有一个金属离子的双核中心[2]。根据蛋白的分子量, 植物中的PAPs一般分为两类, 高分子量PAPs(约55 ku)和低分子量PAPs(约35 ku)。高分子量PAPs通常以同源二聚体的形式存在, 包括两个结构域(N端结构域和C端结构域), 与真菌和分枝杆菌中发现的PAPs同源性较高。低分子量蛋白以单体形式存在, 仅包括一个结构域(C端结构域), 与动物中发现的PAPs更相似[3]

目前, PAP已在许多植物中鉴定出来, 并具有多种功能, 如磷素的吸收与利用[4, 5, 6, 7]、氧化还原反应[8, 9, 10, 11]、花的发育[12]和细胞壁的合成[13, 14, 15]等。随着越来越多植物基因组测序的完成, 在模式植物拟南芥中发现了29个PAP基因, 并分析了低磷胁迫下7个基因的表达模式, 其中AtPAP11和AtPAP12被诱导上调表达[2]。随后, 相继在水稻、大豆和玉米全基因组水平上也鉴定出PAP基因, 其中部分基因也受低磷胁迫的诱导表达[16, 17, 18, 19]

辣椒是我国最重要的蔬菜植物之一, 然而辣椒基因组中的PAP基因家族未有报道。最近, 辣椒全基因组的测序已经完成[20], 为我们通过生物信息学方法鉴定PAP基因家族提供了机会。本研究利用辣椒基因组信息, 鉴定辣椒PAP 基因家族, 通过生物信息学等方法分析PAP基因家族成员序列结构特征、基因染色体定位、基因系统发育关系和组织特异性表达模式等, 为揭示辣椒PAP基因家族成员的功能奠定理论基础。

1 材料与方法
1.1 材料

本试验中, 三个物种(辣椒、拟南芥和水稻)的PAP基因家族成员被鉴定。辣椒(Capsicum annuum L.)PAP基因家族信息来自于已经公布的辣椒基因组数据库(http://peppersequence.genomics.cn/page/species/index.jsp); 拟南芥PAP基因序列和蛋白序列来源于TAIR(http://www.arabidopsis.org); 水稻PAP基因序列和蛋白序列来自水稻基因组注释项目网站(http://rice.plantbiology.msu.edu)。

1.2 辣椒PAP基因家族的鉴定

分别以拟南芥和水稻基因组中的PAP氨基酸序列为模板, 对辣椒全基因组数据库进行Blastp程序搜索, 将其结果进一步通过PFAM网站(http://pfam.janelia.org)进行鉴定是否含有保守基序(DXG/GDXXY/GNH(E/D)/VX2H/GHXH), 筛选出辣椒基因组中的CaPAPs候选基因序列。利用在线网站ExPASy Bioinformatics Resource Portal(http://web.expasy.org/compute_pi/)预测其分子量和等电点。

1.3 辣椒PAP基因家族成员的内含子-外显子结构及系统发育关系分析

采用网站GSDS2.0 (http://gsds.cbi.pku.edu.cn)在线工具预测PAP基因家族成员外显子-内含子结构特征[21]。然后, 通过Clustal X软件对拟南芥、水稻和辣椒PAP基因的氨基酸序列进行比对[22], 利用MEGA 5.0软件的邻接法对其进行系统进化树的构建, 各参数设定为:P-distance、pairwise deletion和Bootstrap值(1 000次重复)[23], 分析PAP基因家族的系统发育关系。

1.4 辣椒PAP基因的染色体定位及表达分析

利用MapDraw V2.1软件进行辣椒PAP基因染色体定位分析。在NCBI GEO数据库下载辣椒根、茎、叶、花、花蕾及果实发育不同时期的RNA-seq测序数据, 利用MeV软件分析PAP基因的表达模式。

以辣椒“ 0028” 为材料用于定量表达分析验证, 通过Trizol法提取根、茎、叶、花、嫩果、成熟绿果、转色期果实和红果不同组织的RNA, 用反转录试剂盒PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA第一链。利用Primer5.0软件设计PAP荧光定量引物(表1), 选取UBI-3为内参基因[24], qRT-PCR的反应体系为:10 μ L SYBR Green I, 1 μ L上游引物(5 μ mol· L-1), 1 μ L 下游引物(5 μ mol· L-1), 1 μ L cDNA, 7 μ L ddH2O。qRT-PCR循环程序为:95 ℃, 3 min; 94 ℃, 30 s, 58 ℃, 25 s; 72 ℃, 20 s, 共35个循环。设计3个生物学重复, 3次实验重复。

表1 辣椒PAP基因特异引物信息 Table 1 Specific primer for PAP gene in pepper
2 结果与分析
2.1 辣椒PAP基因家族的鉴定

以拟南芥和水稻已经公布的PAP基因家族成员为靶序列, 在辣椒基因组数据库中进行Blasp检索, 共鉴定了25个辣椒PAP基因家族成员(CaPAP01~CaPAP25)。经保守结构域分析发现, 其中23个CaPAPs序列的COOH羧基端具有5个基序组成的保守结构域, 只有CaPAP01和CaPAP03缺少1个基序(表2), 由于其与PAP的同源性较高, 依然归为CaPAP基因家族。由表2可以看出, 这些基因的氨基酸长度在264 aa(CaPAP15)~639 aa(CaPAP12); 分子量大小30.3~72.5 ku。辣椒PAP基因的等电点位于5.41~8.64, 大部分为酸性蛋白。

表2 辣椒PAP基因家族信息 Table 2 General information about the 25 CaPAPs genes
2.2 辣椒PAP基因聚类及内含子/外显子结构分析

利用MEGA5.0软件对辣椒25个PAP基因家族成员的氨基酸序列进行系统发育关系分析(图1)。辣椒全基因组PAP基因家族成员分为三大类(Ⅰ ~Ⅲ ), 第I类基于高的Bootstrap重复次数, 进一步分为2个亚类, Ia和Ib。每类里分别包括5~7个不等的PAP基因。我们进一步构建了辣椒PAP基因家族成员的结构模式图(图1)。发现辣椒CaPAP基因家族成员之间内含子数目变异大, CaPAP05含有最多的内含子(12个), CaPAP10含有最少的内含子(1个)。此外, 还可以看出, 所有的辣椒PAP基因都不含5'和3'非编码区(5'-UTR和3'-UTR)。

图1 辣椒PAP基因系统发育树构建和内含子-外显子结构Fig.1 Phylogenetic analysis and intron/exon configurations of PAP genes in pepper

2.3 辣椒、拟南芥和水稻PAP基因家族比较分析

为了分析辣椒PAP基因家族的进化关系, 将其与拟南芥和水稻进行系统发育关系分析。共有80个PAP基因参与系统发育树的构建(辣椒25个、拟南芥29个和水稻26个)(图2)。它们可分为3个家族(Ⅰ 、Ⅱ 和Ⅲ ), 借助于高的Bootstrap值, 可进一步分为8个亚家族(Ⅰ a-1、Ⅰ a-2、Ⅰ b-1、Ⅰ b-2、Ⅱ a、Ⅱ b、Ⅲ a和Ⅲ b), 除Ⅲ a外, 每个亚家族都包含有来自这3个物种的成员。基因数目最多的为Ⅱ b亚家族, 含有17个PAP基因, 最少的为Ⅰ a-1和Ⅱ a亚家族, 分别只含有4个PAP基因。

图2 辣椒、拟南芥和水稻PAP蛋白的系统发育关系Fig.2 Phylogenetic relationships of PAP protein with pepper, Arabidopsis and rice

此外, 我们从来自辣椒、拟南芥和水稻共80个PAP基因系统发育关系中, 分析发现52个PAP基因具有同源关系, 占基因总数目的65%(52/80)。物种间存在6对直系同源基因(CaPAP18和AtPAP18、CaPAP21和AtPAP23、AtPAP29和CaPAP19、CaPAP07和AtPAP12、AtPAP10和OsPAP10aAtPAP16和CaPAP08)。而物种内存在20对旁系同源基因, 8对来自辣椒(CaPAP17和CaPAP22、CaPAP02和CaPAP06、CaPAP16和CaPAP24、CaPAP13和CaPAP14、CaPAP23和CaPAP03、CaPAP12和CaPAP01、CaPAP05和CaPAP20、CaPAP11和CaPAP04), 6对来自拟南芥(AtPAP21和AtPAP22、AtPAP11和AtPAP19、AtPAP6和AtPAP25、AtPAP2和AtPAP9、AtPAP24和AtPAP27、AtPAP8和AtPAP3), 6对来自水稻(OsPAP20a和OsPAP20b、OsPAP21b和OsPAP21c、OsPAP10b和OsPAP10c、OsPAP27a和OsPAP27b、OsPAP1d和OsPAP1c、OsPAP3c和OsPAP3b)。

2.4 辣椒PAP基因的染色体定位

利用MapDrawV2.1软件进行辣椒PAP基因染色体定位, 发现除2号染色体外, 25个PAP基因定位于辣椒11条染色体(1、3、4、5、6、7、8、9、10、11及12号)上, 并且大多分布在染色体的两端(图3)。0号染色体含有4个PAP基因, 1、3、5和8号染色体上分布有3个PAP基因, 9号和11号染色体分别含有2个PAP基因, 剩下的染色体中, 每条染色体仅分布1个PAP基因。此外, 8号染色体上的CaPAP14和CaPAP15集中分布在染色体的末端, 以串联复制形成基因簇结构。

图3 辣椒PAP基因的染色体定位Fig.3 Chromosome mapping of CaPAPs in pepper

2.5 辣椒PAP基因的组织特异性表达分析

为了揭示辣椒PAP基因组织特异性表达模式, 我们利用已发表的辣椒转录组数据分析PAP基因的表达模式(图4)。结果表明, CaPAP11基因仅在花和花蕾中表达量较高, 在根、茎、叶和果实不同发育阶段几乎不表达; CaPAP16在花蕾中的表达量相对于根、茎、叶、花的组织中表达量要高; 而CaPAP09正好与其相反, 除在花蕾中表达量低外, 在其余组织中表达量均较高, 此外, CaPAP09在果实发育早期特异性表达, 表达量较高, 而在果实成熟之后表达量较低; CaPAP07在各组织器官中叶的表达量相对较高。CaPAP05、CaPAP10、CaPAP18、CaPAP19、CaPAP24和CaPAP25在5个不同组织和9个果实发育时期都有较高的表达量, 说明这些基因可能参与了辣椒生长发育过程中多种生理生化变化的转录调控。另外, CaPAP02未在转录组数据库中找到表达数据; 7个PAP基因家族(CaPAP06、CaPAP08、CaPAP13、CaPAP15、CaPAP17、CaPAP21和CaPAP22)的表达量较低或未表达。

图4 辣椒PAP基因表达图谱Fig.4 The expression profile of PAP genes in pepper

为了验证RNA-seq数据的可靠性, 我们利用Primer5.0软件设计CaPAP的25个成员引物, 对辣椒不同组织(根、茎、叶、花)和果实不同阶段(幼果、绿熟果、转色果、红果)的进行定量表达分析(图5)。结果表明, 25个基因在RNA-seq和qRT-PCR的表达结果基本相同。其中CaPAP02、CaPAP08、CaPAP13、CaPAP15、CaPAP17和CaPAP22这6个基因经定量分析不表达或表达量太低而无法检测。

图5 辣椒PAP基因的定量表达分析

Fig.5 qRT-PCR expression analysis of PAP genes in pepper

3 讨论

众所周知, 植物营养元素磷不仅是核酸等在生物细胞内的重要化合物分子, 而且还参与了植物许多重要的生理生化过程[24]。但植物所需的无机磷, 其在土壤中的含量却非常有限, 在将土壤富含的有机磷转化成无机磷的过程中, 酸性磷酸酶起到了重要的作用。而紫色酸性磷酸酶是酸性磷酸酶的一种, 按功能可将其分为细胞内和分泌型两种, 细胞内酸性磷酸酶(IAP)主要利用植物体内储存的有机磷, 分泌型酸性磷酸酶(SAP)主要降解体外的有机磷供植物吸收。除此之外, 研究还发现PAP在植物的抗逆境、抗衰老、细胞发育和代谢等过程中, 也扮演着重要的作用[15, 25, 26, 27]。因此, 挖掘和鉴定植物PAP基因, 对进一步揭示其在植物细胞组成以及各种生理生化活动中均具有重要意义。2014年, 辣椒全基因组序列的公布为我们鉴定PAP基因家族成员的数目、结构等信息奠定了基础。本研究从辣椒基因组数据库中共鉴定得到25个PAP基因, 分为3大类和4个亚类, 其家族成员数量与拟南芥(125 Mb)29个和水稻(466 Mb)26个相似。尽管辣椒的基因组较大(3.48 Gb), 但并未获得更多的PAP家族成员, 其数量与基因组大小并不成正比关系, 这说明植物中所含PAP基因可能具有较高保守性。

本研究以拟南芥、水稻和辣椒共80个PAP基因构建了系统进化树, 这些基因被分成了3个家族, 并且在每个家族中均存在AtPAPOsPAPCaPAP基因。这说明可能在单子叶和双子叶植物分化前, PAP基因家族成员的基本特征就已形成。此外, 我们还发现在辣椒、拟南芥和水稻中, 共存在6对直系同源基因和20对旁系同源基因, 其数目占基因总数的65%(52/80), 表明这些基因家族成员在单子叶和双子叶植物分化之后, 以物种特异的方式进行了扩展。目前, 这种现象在其他植物基因家族的研究中也已经被发现[28, 29, 30]。另外, 由于PAP基因的高度保守性, 具有相似功能的PAP可能被聚集到同一类, 这为预测辣椒该基因家族的功能提供了依据。以前研究表明, AtPAP10基因是拟南芥根表面主要的酸性磷酸酶, 超表达AtPAP10能增加植株的生长和磷吸收能力[31, 32]; AtPAP12和AtPAP26两个基因的单突变体植株中, 缺磷诱导的酸性磷酸酶活性下降, 在细胞和植株培养液中检测到AtPAP12和AtPAP26蛋白, 均受缺磷诱导[26, 33]; 水稻OsPAP10a基因在地上部分和根部的表达均受缺磷诱导, 而OsPAP10c只在根部受缺磷特异诱导表达[34], 以上基因都是缺磷条件下的分泌型酸性磷酸酶, 参与了磷代谢途径。而这些基因均被聚类到Ia家族, 故此基因家族的辣椒基因也可能具有相似的功能。

基于RNA-seq和qRT-PCR分析, 本研究探讨了辣椒PAP基因家族在不同组织和果实发育不同时期的表达情况, 结果显示有些基因的表达具有一定的组织特异性, 如CaPAP11在花和花蕾组织, CaPAP07在叶组织, 推测这些基因在组织发育过程中起到了重要的作用; CaPAP09和CaPAP14基因的表达量随着果实的发育成熟而降低, 这表明这两个基因可能参与果实发育的相关调控过程; CaPAP05、CaPAP10、CaPAP18、CaPAP19、CaPAP24和CaPAP25在不同组织和果实发育不同阶段都有较高的表达量, 这表明它们与辣椒植株正常生理生化活动联系紧密。

The authors have declared that no competing interests exist.

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