作者简介:段海明(1982—),男,山东蒙阴人,博士,副教授,主要从事农药毒理与应用技术研究。E-mail: duanhm@ahstu.edu.cn
为了明确菌株gfj-4对植物病原菌的拮抗作用及其在植物病害生物防治中的应用潜力。通过形态特征、生理生化及16S rDNA序列对菌株gfj-4进行鉴定,以玉米纹枯病菌( Rhizoctonia solani)为指示菌,采用菌丝生长速率法测定了不同稀释倍数发酵上清液、不同培养时间、接种量和pH值对抑菌活性的影响,以及从发酵上清液中提取的脂肽类物质的抑菌活性;采用牛津杯法测定了脂肽类物质对其他16种植物病原菌的抑菌效果。初步鉴定菌株gfj-4为解淀粉芽孢杆菌( Bacillus amyloliquefaciens);菌株gfj-4的发酵上清液对玉米纹枯病菌菌丝生长具有显著的抑制作用,稀释倍数从8倍增大到25倍时,其对病菌的抑制率为31.1%~92.4%,发酵上清液对玉米纹枯病菌的EC50为53.1 μL·mL-1;培养时间96 h,发酵上清液12倍稀释液对玉米纹枯病菌的抑制率最高,为82.0%;接种量为0.5%( V/V)时,对病菌的抑制率最高,为83.2%;pH为7时抑菌率达最高(82.6%)。脂肽类物质稀释60~180倍,对玉米纹枯病菌的抑制率为43.8%~92.0%,脂肽类物质对玉米纹枯病菌的EC50为5.90 μL·mL-1;与对照相比较,经脂肽类物质处理的玉米纹枯病菌菌丝生长量减少,生长稀疏,而且气生菌丝也受到明显抑制。脂肽类物质对其他16种植物病原菌也具有较高的抑菌活性,抑菌带宽为16.7~31.0 mm,对玉米小斑病菌( Bipolaris maydis)的抑制效应最强,对油菜菌核病菌( Sclerotinia sclerotiorum)的抑制活性最弱。
The study aimed to clarify the antagonistic effect of strain gfj-4 on plant pathogens and its potential in biological control of plant diseases. The traditional morphology, physiological-biochemical properties as well as 16S rDNA gene sequence analysis were applied to the bacteria classification. The pathogen of maize sheath blight worked as the indicator, the fermentation supernatant with different dilution times, and the culture time, inoculation amount and pH value on the antifungal activity of Rhizoctonia solani were determined by mycelial growth rate method. The inhibition of lipopeptides extracted from fermentation supernatant on the other 16 plant pathogens were determined by oxford cup method. It showed that the strain gfj-4 was identified as Bacillus amyloliquefaciens. The fermentation supernatant of strain gfj-4 had significant inhibitory activity on the mycelial growth, and the inhibition rate was from 31.1% to 92.4% within the dilution factor expanded from 8 to 25 times. The EC50 of fermentation supernatant to R. solani was 53.1 μL·mL-1. The highest inhibition rate of 12-fold dilution of fermentation supernatant was 82.0% when incubation time was 96 h, and the inhibition rate to R. solani was 83.2% when the inoculation amount was 0.5% ( V/V), the inhibitory rate reached 82.6% when the pH value was 7.0. The inhibition ratio of the crude lipopeptides diluted from 60 to 180 times extracted from the fermentation broth was from 43.8% to 92.0%. The EC50 of lipopeptides to R. solani was 5.90 μL·mL-1. Compared with the control group, it was found that the mycelia growth of R. solani was reduced and the growth of mycelium was sparse, and the aerial mycelium was also inhibited significantly. The inhibitory effects of lipopeptides on the other 16 plant pathogens were also investigated and the inhibition zones were from 16.7 to 31.0 mm, and the inhibitory effect on the Bipolaris maydis was the strongest, while it had the weakest inhibitory activity agains t Sclerotinia sclerotiorum.
玉米纹枯病是玉米产区普遍发生且危害较大的世界性病害[1]。近10 a来, 随着紧凑性玉米品种的大面积推广, 玉米种植密度逐渐加大, 加上氮肥施用量的增加和秸秆还田技术的普及, 致使越冬菌源量逐年累积, 导致玉米纹枯病的发生一直呈加重趋势, 通常病株率达22%~71%, 个别地块或品种甚至达100%, 已成为制约玉米高产稳产的顽疾[2]。因此, 针对玉米纹枯病开展防治技术研究具有重要意义。
由于缺乏高抗玉米品种, 玉米纹枯病主要通过在拔节期喷洒化学杀菌剂进行防治[3]。但是, 化学农药过量使用造成“ 3R” 问题层出不穷, 已严重威胁我国农产品质量安全和农业生态环境。因此, 需要加快改变农作物病害治理对化学农药过分依赖的传统方式, 亟需筛选杀菌机制新颖的生物源杀菌剂, 进而有效遏制玉米纹枯病的大面积蔓延势头[4]。丁婷等[5]从杜仲体内筛选到一株梭孢壳属(Thielavia sp.)真菌DZGS08, 其100 mg· L-1的发酵液粗提物对玉米纹枯病菌Rhizoctonia solani的抑制率达50.44%; 雍彬等[6]从华重楼块茎中分离纯化出一株较强抑菌活性的内生枯草芽孢杆菌Iun35, 并从其发酵上清液中纯化出一种抗菌蛋白UD35, 该蛋白对玉米纹枯病菌等多种病菌具有较强抑制作用; 辜运富等[7]从玉米川单13号中分离到1株枯草芽孢杆菌, 该菌株对玉米纹枯病菌的抑菌率为43.01%, 且能够促进玉米生长; 高增贵等[8]从成株期玉米根、茎中分离得到20株对玉米纹枯病菌具有拮抗作用的内生细菌, 其中, B20-006和B20-120对纹枯病的防治效果最好, 菌液浸种处理成株期防效分别为40.2%和39.1%。目前, 有关玉米纹枯病的生防菌主要从健康植物体内筛选获得, 从发病植物中筛选拮抗菌的研究还未见报道。本实验室从罹病番茄果实中分离纯化得到1株新型生防菌株gfj-4, 然后以玉米纹枯病菌为靶标菌, 系统开展了拮抗菌株的鉴定、发酵上清液抑菌活性、发酵条件优化以及发酵上清液中脂肽类物质的抑菌谱测定等研究, 旨在为利用该菌株开展玉米纹枯病的防控提供理论依据和技术支持。
1.1.1 供试菌株
玉米纹枯病菌(R. solani)、玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum)、玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)、玉米茎基腐病-禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)、小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cerealis)、稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)、棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum)、苹果轮纹病菌(Fusicoccum aesculi)、苹果树腐烂病菌(Cytospora sacculus)、葡萄白腐病菌(Coniella diplodiella)、黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum)、辣椒炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)、番茄早疫病菌(Alternaria solani)、番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、花生黑斑病菌(Cercosporidium personatum)于本实验室分离保存。
拮抗细菌gfj-4分离自罹病的番茄果实, 经分离纯化得纯培养, 保存于80%甘油生理盐水中, 置于-20 ℃冰箱中保存备用。
1.1.2 供试培养基
PDA培养基:马铃薯200.0 g, 葡萄糖18.0 g, 琼脂15.0 g, 去离子水1 L。
NA培养基:牛肉浸膏3.0 g, 酵母膏1.0 g, 蛋白胨5.0 g, 葡萄糖10.0 g, 琼脂15.0 g, pH 7.0(不加琼脂制成NB培养基)。
发酵培养基:马铃薯200.0 g, 葡萄糖18.0 g, 七水硫酸镁1.0 g, 硝酸铵1.0 g, 磷酸二氢钾0.6 g, 去离子水1.0 L。
1.2.1 拮抗细菌gfj-4的鉴定
拮抗细菌gfj-4经过划线培养48 h, 进行菌落形态观察, 革兰氏染色, 碳、氮化合物和大分子化合物的利用以及产酶等生理生化特性的测定。
菌株的分子鉴定采用16S rDNA序列分析方法。PCR扩增正向引物为27F: 5’ -GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ , 反向引物1492R: 5’ -ACGGCTACCTTG TTACGACTT-3’ 。经PCR扩增的16S rDNA凝胶回收纯化后与pMD18-T载体酶连过夜, 酶连产物转化感受态细胞大肠埃希菌(Escherichia coli)DH5α , 挑取白斑菌落扩大培养后委托生工生物工程(上海)股份有限公司测序。从Genbank中搜索类似细菌的16S rDNA序列, 并用DNAMAN 4.0和MEGA 3.1软件构建系统发育树。
1.2.2 解淀粉芽孢杆菌gfj-4产发酵上清液的制备
利用平板菌落生长速率法测定菌株gfj-4不同稀释倍数的发酵上清液对玉米纹枯病菌菌丝生长的抑制活性[9]。菌株gfj-4在NA培养基上划线培养48 h, 挑取单菌落菌苔接入NB液体培养基中, 33 ℃、120 r· min-1培养12 h, 然后以10%(V/V)的接种量接种到NB液体培养基, 33 ℃、120 r· min-1培养8 h; 获取的种子液以0.5%(V/V)的接种量接种到装有100 mL发酵培养基的250 mL三角瓶中, 然后置于33 ℃、140 r· min-1的恒温摇床中培养84 h, 然后将发酵液11 180 g、4 ℃离心20 min, 然后经0.22 μ m滤膜过滤后保存于4 ℃冰箱备用。
1.2.3 发酵上清液对玉米纹枯病菌的抑制活性测定
将不同稀释倍数的发酵上清液与冷却到55 ℃左右的PDA培养基充分混匀, 使发酵上清液的含量分别为40、50、66.7、100.0和125 μ L· mL-1, 然后在平板中央接种培养48 h的玉米纹枯病菌菌落边缘菌饼(Ф =7 mm)。每处理设3平皿, 重复3次, 置于27 ℃恒温恒湿培养箱中培养, 以加入相同体积的灭菌水为对照。培养48 h后采用十字交叉法测量菌落直径, 求出发酵上清液对玉米纹枯病菌的半最大效应浓度(concentration for 50% of maximal effect, EC50)。
1.2.4 培养时间对菌株gfj-4发酵上清液抑制玉米纹枯病菌的影响
按照1.2.2节的方法获取种子液后, 以0.5%(V/V)的接种量接入装有100 mL发酵培养基的250 mL三角瓶中, 分别摇培24、48、72、84、96和120 h, 然后11 180 g、4 ℃离心20 min, 获取发酵上清液, 经0.22 μ m滤膜过滤后保存于4 ℃冰箱备用。不同培养时间的发酵上清液与相同体积的PDA培养基混匀后倒平板, 充分冷却后接种玉米纹枯病菌菌饼, 以加入相同体积的灭菌水为对照。置于27 ℃恒温恒湿培养箱中培养, 每一浓度处理3平皿, 重复3次。培养48 h后采用十字交叉法测量菌落直径, 计算不同培养时间对发酵上清液抑菌活性的影响。
1.2.5 接种量对菌株gfj-4发酵上清液抑制玉米纹枯病菌的影响
按照1.2.2节的方法获取种子液, 分别按0.125%、0.25%、0.5%、1%和2%(V/V)的接种量, 接种到装有100 mL发酵培养基的250 mL三角瓶中, 于33 ℃、140 r· min-1培养96 h后离心得上清液备用。不同接种量制得的发酵上清液与相同体积的PDA培养基混匀后倒平板, 充分冷却后接种玉米纹枯病菌菌饼, 以加入相同体积的灭菌水为对照。置于27 ℃恒温恒湿培养箱中培养, 每一浓度处理3平皿, 重复3次。培养48 h后采用十字交叉法测量菌落直径, 计算不同接种量对发酵上清液抑菌活性的影响。
1.2.6 初始pH值对菌株gfj-4发酵上清液抑制玉米纹枯病菌的影响
按照1.2.2节的方法获取种子液后, 按0.5%(V/V)的接种量接入到初始pH值分别为3、5、6、7、8和10的发酵培养基中, 于33 ℃、140 r· min-1培养96 h后离心得上清液备用。不同pH值制得的发酵上清液与相同体积的PDA培养基混匀后倒平板, 冷却后接种玉米纹枯病菌菌饼, 以加入相同体积的灭菌水为对照。置于27 ℃恒温恒湿培养箱中培养, 每一浓度处理3平皿, 重复3次。培养48 h后采用十字交叉法测量菌落直径, 计算不同pH值对发酵上清液抑菌活性的影响。
1.2.7 不同稀释倍数的脂肽粗提液对玉米纹枯病菌的抑制率测定
按照1.2.2节的方法获取种子液后, 接入100 mL pH值为7的发酵培养基中, 振荡培养96 h, 然后经11 180 g、4 ℃离心20 min后得上清液, 采用酸沉醇提的方法从上清液中提取脂肽类物质粗提液。利用菌丝生长速率法测定不同稀释倍数的脂肽类物质对玉米纹枯病菌的抑制效果[10]。将不同稀释倍数的脂肽溶液与相同体积的PDA培养基混匀后倒平板, 得到脂肽类物质不同含量的平板, 充分冷却后接种玉米纹枯病菌菌饼, 以加入相同体积的灭菌水为对照。每一浓度处理3平皿, 重复3次, 置于27 ℃恒温恒湿培养箱中培养。培养48 h后采用十字交叉法测量菌落直径, 计算不同稀释倍数的脂肽粗提液对病菌的抑菌活性。
1.2.8 脂肽粗提液对其他植物病原菌的抑菌活性测定
将牛津杯置于PDA平板中央, 静置10 min后加入200 μ L 1.2.7节制备的脂肽粗提物, 然后在同一直线上牛津杯两侧距平板中央3 cm处, 接种16种植物病原菌的菌饼, 以加入相同体积
的甲醇为对照。置于病菌各自适宜温度的培养箱中培养, 重复3次。待对照长满平皿后, 测量接种的两菌饼之间抑菌带的宽度。
试验数据采用Excel 2007和SPSS 13.0软件进行分析。
2.1.1 菌株的形态特征及生理生化特性
菌株gfj-4在NA培养基上培养48 h后, 菌落近圆形、奶白色、无光泽、不透明, 表面粗糙干燥, 稍隆起, 边缘不整齐(图1-A)。在光学显微镜下观察发现, gfj-4菌体呈杆状, 革兰氏染色阳性(图1-B)。菌株gfj-4的生理生化特征见表1。
2.1.2 菌株gfj-4 16S rDNA的PCR扩增及分析
将所得菌株的16S rDNA序列结果通过Blast程序与Genbank中核酸数据进行比对分析构建系统发育树。结果(图2)表明, 菌株gfj-4的16S rDNA序列和解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株序列的相似性最高。结合菌株的生理生化特性和16S rDNA序列比对分析结果, 初步鉴定菌株gfj-4为解淀粉芽孢杆菌(B. amyloliquefaciens)。
由表2可知, 菌株gfj-4的发酵上清液对玉米纹枯病菌具有显著的抑制活性, 稀释倍数从8倍扩大到25倍时, 在27 ℃培养箱培养48 h, 对玉米纹枯病菌的抑制率从92.4%降低到31.1%。发酵上清液对玉米纹枯病菌的EC50为53.1 μ L· mL-1。与对照相比较可以发现, 经处理的玉米纹枯病菌菌丝扩展缓慢、生长稀疏, 高浓度发酵液对菌丝的生长抑制强烈(图3)。
由图4可见, 随着菌株培养时间的增长, 发酵液的12倍稀释液对玉米纹枯病菌的抑制率逐渐升高。当培养时间达96 h时, 其抑菌率达82.0%; 培养时间为120 h时, 抑菌效果和82 h无显著差异(P> 0.05)。为提高发酵效率, 后续研究发酵培养时间定为96 h。
由图5可见, 随着菌株种子液接入量的增大, 发酵上清液的12倍稀释液对玉米纹枯病菌的抑菌率逐渐升高。当接种量为0.5%(V/V)时, 其对玉米纹枯病菌的抑制率达到最高, 为83.2%; 然而随着接种量的继续增大, 发酵上清液对玉米纹枯病菌的抑菌效果逐渐下降。因此, 确定0.5%(V/V)的接种量为最适接种量。
由图6可见, 不同初始pH值发酵培养基中制得的发酵上清液的12倍稀释液对玉米纹枯病菌的抑菌率也有显著差异。随着培养基pH值的增大, 发酵上清液对玉米纹枯病菌的抑制率先升高后降低, pH=7时抑菌率达最高, 为82.6%; pH=8时抑菌率略有下降, 但与pH=7时无显著性差异(P> 0.05)。表明发酵培养基略偏碱性有利于菌株合成抑菌物质。
由表3和图7可见, 稀释倍数从60倍扩大到180倍时, 在27℃恒温恒湿培养箱培养48 h, 从发酵上清液中提取的脂肽粗提物对病菌的抑制率从92.0%下降到43.8%, 其对玉米纹枯病菌的EC50为5.90 μ L· mL-1。与对照组比较可以发现, 经处理的玉米纹枯病菌菌丝生长量减少、生长稀疏, 而且气生菌丝也受到明显抑制。
由表4可见, 菌株发酵上清液提取出的脂肽粗提物对其他16种植物病原真菌都有不同程度的抑制作用。脂肽粗提物对玉米小斑病菌和辣椒炭疽病菌的抑制效果最优, 对玉米小斑病菌的抑菌带宽达31.0 mm; 对玉米大斑病菌、花生黑斑病菌和小麦纹枯病菌也具有较好的抑制效果, 抑菌带宽分别达28.7、28.7和26.0 mm; 对黄瓜枯萎病菌、小麦赤霉病菌、花生褐斑病菌、葡萄白腐病菌和苹果树腐烂病菌的抑菌带宽为21.6~23.3 mm, 对番茄灰霉病菌、棉花枯萎病菌、苹果轮纹病菌和稻曲病菌的抑菌带宽为18.3~20.0 mm, 对油菜菌核病菌和番茄早疫病菌的抑菌效果较差, 对油菜菌核病菌的抑菌带宽为16.7 mm。
玉米纹枯病作为一种土传病害, 危害日益加大, 防治困难, 成为制约玉米优质高产的重要障碍[11]。我国农业部农药检定所农药登记数据库至今尚无专门登记用于玉米纹枯病防治的杀菌剂品种, 因此, 亟需筛选杀菌机制新颖、绿色环保的生物源杀菌剂供生产上使用, 以弥补玉米纹枯病防治的空缺。解淀粉芽孢杆菌(B. amyloliquefaciens)是一类重要的生物防治资源微生物, 其活体菌剂对核桃根腐病菌(Fusarium solani)、蔬菜枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)和油茶炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)等具有较好的抑菌效果[12, 13, 14, 15, 16], 但还未见解淀粉芽孢杆菌防治玉米纹枯病的相关报道。生防菌在植物根际土壤和体表的定殖受到外界环境因素的影响较大, 生防菌次级代谢产物的开发和利用研究在防治植物病害方面具有更大的利用价值[17]。
生防菌发挥作用的重要机制之一是能够产生抗菌活性物质, 通过发酵条件优化产生尽可能多的抑菌物质是菌株工业化生产的关键[18]。卢彩鸽等[19]从黑龙江省漠河永冻土层采集的样品中分离出解淀粉芽胞杆菌B. amyloliquefaciens MH71, 对多种植物病原真菌和细菌具有较强的拮抗作用, 其最适发酵条件为培养温度30 ℃, 摇床转速200 r· min-1, 起始pH值7, 接种量3%, 装液量100 mL· 500 mL-1, 培养时间72 h; 左冰等[20]研究表明, 解淀粉芽孢杆菌FS6对人参立枯病菌(Rhizoctonia solani)发挥最佳抑菌效果的发酵条件为培养温度28 ℃, 摇床转速160 r· min-1, 起始pH值6, 接种量6%, 装液量50 mL· 250 mL-1, 培养时间12 h。陈哲等[21]等报道, 从草莓灰霉病发病根部土壤中分离到1株解淀粉芽孢杆菌CM3, 最适发酵条件为培养温度31 ℃, 摇床转速200 r· min-1, 起始pH值7, 接种量5%, 摇瓶装液量50 mL· 150 mL-1, 培养时间48 h。本研究在培养温度33 ℃, 装液量100 mL· 250 mL-1和摇床转速140 r· min-1条件下得出, 初始pH值7、接种量0.5%和培养时间为96 h时, 对玉米纹枯病菌的抑制活性较高。这说明不同的生防菌株、靶标病原菌和发酵培养基配方等因素都会影响解淀粉芽孢杆菌的最适发酵培养条件, 发酵条件之间也会相互影响和制约。
解淀粉芽孢杆菌主要的生防机制为产生抗生素、抗菌蛋白、挥发性化合物以及诱导植物产生抗病性, 其产生的脂肽类抗生素能够广谱抑制植物病原生物, 在防治植物病害方面具有广泛的适应性和可操作性, 具有广阔的应用前景[22, 23, 24]。Hiradate等[25]报道了桑树炭疽病菌(Colletotrichum dematium)的拮抗菌解淀粉芽孢杆菌RC-2, 能够产生7种抗真菌化合物, 均为iturin类; Lee等[26]从农田土壤中分离到1株解淀粉芽孢杆菌LP03, 可以产生surfactin和1种bamylocin A的新颖脂肽类物质, 对灰葡萄孢菌(Botrytis cineria)、尖镰孢菌(Fusarium oxysporum)和立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)的拮抗活性较高; 牛力轩等[27]从中国南海深海的海泥样品中分离获得1株解淀粉芽孢杆菌SH-B74, 采用滤纸片法测定1 mg· mL-1的粗脂肽20 μ L对玉米纹纹病菌的抑菌圈达10.1 mm, 经分离纯化其产生的主要抗菌物质为脂肽类化合物bacillopeptin A; 田雪亮等[28]报道解淀粉芽孢杆菌对玉米大斑病菌(S. turcica)具有较强的抑制作用, 在其发酵液处理下, 病菌菌丝生长受到抑制, 变为“ 气球状” , 这种形态改变是菌株产生的环脂肽类物质对病菌作用的结果。本研究所筛选的解淀粉芽孢杆菌gfj-4菌株对包括玉米大斑病菌在内的17种常见植物病原真菌表现出了较强的离体抑制活性, 推测其主要的抑菌物质也为脂肽类抗生素。目前, 国内外文献报道的解淀粉芽孢杆菌菌株较多, 但由于其采集的生境和培养发酵条件不同, 其产生的有效抑菌成分的种类和含量也会随之发生变化。本研究所涉及的gfj-4菌株来源于安徽省凤阳县蔬菜大棚罹病的番茄果实中, 与其他菌株相比来源新颖, 其发酵代谢产物的组成和含量还有待于进一步探究。
The authors have declared that no competing interests exist.
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