试验用的竹炭购自浙江遂昌县神龙谷炭业有限公司, 粒径3~5 mm, 比表面积330 g· m^-2, pH值8.15, 呈碱性, C、H、N、P、O含量分别为68.1%、2.8%、1.3%、0.3%和27.5%。竹炭于2015-05-12到货, 在试验前堆置于库房, 并于试验开始当日解封。

试验大田位于苏州市某农业公司温室大棚, 该大棚常年种植蔬菜, 以地表水灌溉为主, 一年内种植蔬菜3~4季, 施肥量较大。试验前土壤的基本性质为:pH值5.73, 有机质30.0 g· kg^-1, 全氮2.04 g· kg^-1, 有效磷22.5 mg· kg^-1。

试验所用复合肥购自湖北澳特尔化工有限公司, 登记号鄂农肥(2009)准字0081号, 总养分45%, 其中N、P₂O₅、K₂O分别为14%, 16%和15%。

设添加竹炭(BC)和空白对照(CK)2个处理, 其中, BC处理的竹炭添加量为1%(2.25 kg· m^-2), 每个处理均设置3个重复, 每个重复的试验田面积为30 m², 具体设置见图1。每个处理均施用23.5 g· m^-2复合肥和1.8 g· m^-2菜籽(品种为苏州青), 施入的N、P₂O₅和K₂O养分量分别为33.0、37.5、36.0 kg· hm^-2。

图1

Fig.1

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	图1 试验田设置示意图Fig.1 Diagram for equipment drawing of experiment field

试验周期为2015-05-19— 2015-06-22, 共计35 d。采用喷灌软管, 按照蔬菜种植的正常需水规律进行喷水, 各处理喷水时间和水量控制一致。在试验田四周设置集水沟渠, 并在沟渠一角设置集水井。30 min后在集水井中收集水样, 采样后及时送回实验室进行分析。试验周期内共喷水13次, 即采样13次。施入竹炭6个月后, 2015-11-20采集土壤样品用于测定微生物群落结构。

1.3.1 水质分析

总氮(TN)测定采用过硫酸钾氧化-紫外分光光度法, 总磷(TP)测定采用过硫酸钾消解法^[7]。以整个试验期内13次采样的TN和TP平均浓度作为各处理的沟渠水氮磷浓度。

1.3.2 土壤样本采集及DNA提取

对各处理土壤, 经多点混合采样作为该处理样品。样品总DNA的提取采用E.Z.N.A.^®试剂盒法(OMEGA Bio-tek, Norcross, GA, USA), 利用1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组总DNA, 核对基因组总DNA的完整性与浓度。

1.3.3 PCR扩增及测序样本制备

采用16S RNA基因V3-V4区通用引物^[8], 16S rRNA基因引物序列分别为:338F, 5'-ACTCCTRCGGGAGGCAGCAG-3'; 806R, 5'-GGACTACCAGGGTATCTAAT-3'。采用PCR仪(ABI GeneAmp^® 9700型)对细菌16S rRNA基因进行PCR扩增, 扩增反应体系20 μ L, 包括2 μ L dNTPs混合物(2.5 mmol· L^-1)、4 μ L 5× FastPfu缓冲溶液、上下游引物各0.8 μ L(5 μ mol· L^-1)、2 μ L DNA模板、0.2 μ L FastPfu DNA聚合酶, 加去离子水补足20 μ L。扩增步骤:95 ℃预变性3 min; 95 ℃变性30 s, 55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸45 s, 重复30次; 72 ℃延伸10 min。扩增产物10 ℃保存。

全部样本按照上述试验条件进行反应, 每个样本3个重复, 将同一样本的PCR产物混合后用2%琼脂糖凝胶电泳进行检测, 使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(Axygen公司)切胶回收PCR产物, Tris-HCl洗脱, 2%琼脂糖电泳检测。

参照电泳初步定量结果, 将PCR产物用QuantiFluor^TM-ST蓝色荧光定量系统(Promega公司)进行定量检测, 之后按照每个样品的测序量要求, 进行相应比例的混合。

1.3.4 Miseq文库构建及测序

根据Illumina公司Miseq平台操作说明构建2× 300 bp的PE文库, 质检合格后进行高通量测序。测序下机的reads首先采用Trimmomatic软件进行质控, 过滤reads尾部质量值20以下的碱基, 设置50 bp的窗口, 如果窗口内的平均质量值低于20, 从窗口开始截去后端碱基, 过滤质控后50 bp以下的reads, 去除含N碱基的reads。再利用FLASH根据PE reads之间的overlap关系, 将成对reads 拼接成一条序列, 最小overlap长度为10 bp, 拼接序列的overlap区允许的最大错配比率为0.2。筛选不符合序列。根据序列首尾两端的barcode 和引物区分样品, 并调整序列方向, barcode 允许的错配数为0, 最大引物错配数为2。利用Usearch(version 7.1)设置97%相似性, 对质控拼接后的有效序列进行操作分类单元(OUT)分类。Miseq测序、序列拼接及OTU聚类均由上海美吉生物医药科技有限公司完成。

利用SPSS 15.0软件, 对各处理的沟渠水TN、TP浓度, 蔬菜鲜重和微生物群落丰富度等进行单因素方差分析, 对有显著(P< 0.05)差异的处理基于LSD法进行多重比较。

与CK相比, 添加竹炭的BC处理条件下, TN浓度降低5.5%, 但差异不显著, TP浓度下降了48.3%, 且差异显著(P< 0.05)(图2)。这说明竹炭添加有助于提高氮磷肥料, 尤其是磷肥的利用率, 具有一定的持留作用。这可能是因为, 生物质炭施入农田后可以改善土壤的微观结构, 提高土壤pH值和土壤阳离子交换能力, 增强土壤对营养离子的持留作用, 从而减少营养流失^{[9, 10]}。

图2

Fig.2

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	图2 各处理沟渠水TN、TP浓度Fig.2 Total nitrogen and phosphorus concentration of runoff under different treatments

如图3所示, 与CK相比, 添加竹炭处理可显著(P< 0.05)提高蔬菜产量, 增幅为21.5%。这可能是因为竹炭添加为土壤提供了充足的微量元素, 并间接改变了土壤的理化性质, 减少了氮磷流失^[11]。

图3

Fig.3

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	图3 各处理蔬菜鲜重Fig.3 Fresh weight of vegetable under different treatments

从表1可以看出, CK和BC处理的土壤样品序列数和OTU数差异较大, 说明添加竹炭在一定程度上增加了土壤样品的序列数和OTU数, 但差异尚未达到显著水平。采用Chao、ACE、Shannon、Simpson指数表征土壤微生物丰富度, 其中:Chao和ACE指数在生态学中常用来估计物种总数, 物种总数越多其值越大^[12]; Shannon指数可以用来反映基于物种数量的群落种类多样性, 值越大, 表明群落的复杂程度越高^[13]; Simpson指数体现了优势物种生物量占群落生物总量的比重, 值越大, 表明优势菌群生物量占比越大^[11]。从上述指数的数值来看, 添加竹炭的处理, 上述指数的值均较CK增加, 但差异均未达显著水平。这说明添加竹炭有益于增加土壤细菌的群落多样性, 提高优势菌群生物量占比。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 各处理的土壤细菌丰度及多样性 Table 1 Richness and diversity estimators of microbial communities in soil under different treatment 处理 Treatment 序列数 Sequence No. OTU数 OUTs No. Chao指数 Chao index ACE指数 ACE index Shannon指数 Shannon index Simpson指数 Simpson index CK 33539 29438 899 879 5.11 0.018 BC 38118 31743 922 904 5.12 0.021

表1 各处理的土壤细菌丰度及多样性 Table 1 Richness and diversity estimators of microbial communities in soil under different treatment

本试验土壤中细菌种类较为丰富, 共检测出13门, 能鉴定出门的细菌占细菌总数的98.48%~99.26%。从门分类层面来看, CK与BC处理的细菌群落结构总体相似性较高(表2), 无明显改变, 主要包括变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、绿曲挠菌门(Chloroflexi)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)等。土壤中细菌种类分布与现有文献报道^{[14, 15]}基本一致, 但2处理下不同种类的占比存在较大差异, 特别是竹炭添加提升了变形菌门和放线菌门微生物的占比, 大幅降低酸杆菌门和绿曲挠菌门的占比。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 各处理土壤细菌门层面的群落组成 Table 2 Taxonomic classification of soil bacterial communities at phylum level % 类别Phylum CK BC 变形菌门Proteobacteria 35.83 45.59 酸杆菌门Acidobacteria 19.36 7.97 放线菌门Actinobacteria 10.60 14.71 绿曲挠菌门Chloroflexi 11.26 8.04 芽单胞菌门Gemmatimonadetes 5.39 6.45 厚壁菌门Firmicutes 5.33 5.22 拟杆菌门Bacteroidetes 3.28 5.53 Saccharibacteria 3.21 3.00 浮霉菌门Planctomycetes 1.21 0.75 疣微菌门Verrucomicrobia 0.71 0.98 硝化螺旋菌门Nitrospirae 0.71 0.41 WD272 0.93 0.17 Latescibacteria 0.41 0.16 其他Others 1.77 1.01

表2 各处理土壤细菌门层面的群落组成 Table 2 Taxonomic classification of soil bacterial communities at phylum level %

为进一步阐明竹炭添加过程中土壤细菌群落的演化, 在属的水平上对微生物群落结构进行分析。CK和BC处理的土壤中均有48属微生物, 检出比例占总细菌数的71.87%~83.18%。与门分类层面的结果相似, 生物质炭施入对土壤细菌群落组成影响较小。然而, 不同处理下微生物的分布占比存在差异, 以占比2%以上的主要微生物属为例, 共有12属, 竹炭添加进一步提高了在CK中占据优势的前4属微生物所占的比例(表3)。从优势种群的比例变化来看, 竹炭添加促进了土壤中优势种群的富集, 提升了优势种群的比例。

生物质炭添加能够改变土壤中养分的生物可利用性, 导致土壤中一些微生物群体迅速增殖成为竞争优势群落, 从而引起土壤微生物群落结构的变化^[16]。但在不同土壤环境中, 生物质炭对微生物群落结构的影响不同, 这些影响在代谢功能层面可能与土壤微环境的差异存在显著相关性^[14], 如:陈俊辉^[17]通过大田试验研究秸秆生物质炭对农田土壤微生物群落多样性的影响, 发现生物质炭施用下的细菌群落结构与对照之间总体相似性较高, 但不同程度地改变了部分细菌类群的相对丰度, 高通量测序表明, 酸杆菌门(Acidobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)等微生物是主导细菌类群, 且生物质炭添加增加了硝化螺旋菌门(Nitrospira)、绿曲挠菌门(Chloroflexi)和放线菌门(Actinobacteria)的丰度。潘逸凡^[4]采用454测序技术研究了生物质炭添加对稻田土壤中氨氧化古菌(AOA)和氨氧化细菌(AOB)的影响, 发现生物质炭添加对AOA多样性有一定促进作用, 但会降低AOA菌群丰度, 对AOB的种群数量影响不明显, 仅影响AOB的群落结构, 但影响作用随时间推移逐渐减弱。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 各处理土壤细菌属层面的群落组成比 Table 3 Taxonomic classification of soil bacterial communities at genus level % 类别Genus CK BC Mizugakiibacter 9.27 9.90 Gaiellales(uncultured) 5.36 7.06 Gammaproteobacteria(unclassified) 5.23 5.45 Gemmatimonadaceae(uncultured) 4.23 4.80 Sphingomonas 2.62 4.47 JG30-KF-AS9_norank 4.01 2.15 Saccharibacteria (norank) 3.21 3.00 Bacillus 2.84 2.32 Subgroup_2_norank 3.94 0.82 Acidobacteriaceae (Subgroup 1, uncultured) 3.99 0.68 Proteobacteria(unclassified) 2.80 1.97 Subgroup_13_norank 2.67 0.96

表3 各处理土壤细菌属层面的群落组成比 Table 3 Taxonomic classification of soil bacterial communities at genus level %