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廖倡宇, 张鹏飞, 王印, 杨泽晓, 姚学萍, 姜睿姣, 邬旭龙, 张博, 周丽军, 宋勇. 猪源莫拉菌的分离鉴定与部分生物学特性分析[J]. 浙江农业学报, 2018,30(1): 36-42.
LIAO Changyu, ZHANG Pengfei, WANG Yin, YANG Zexiao, YAO Xueping, JIANG Ruijiao, WU Xulong, ZHANG Bo, ZHOU Lijun, SONG Yong. Identification and biological characteristics analysis of Moraxella from swine [J]. ACTA AGRICULTURAE ZHEJIANGENSIS, 2018,30(1): 36-42.
  
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猪源莫拉菌的分离鉴定与部分生物学特性分析
廖倡宇1,2, 张鹏飞1,2, 王印1,2,*, 杨泽晓1, 姚学萍1, 姜睿姣1, 邬旭龙1,2, 张博1,2, 周丽军1,2, 宋勇3
1.四川农业大学 动物医学院,四川 成都 611130
2.动物疫病与人类健康四川省重点实验室,四川 成都 611130
3.天津瑞普生物技术股份有限公司,天津 300300
*通信作者,王印,E-mail: yaanwangyin@tom.com

作者简介:廖倡宇(1991—),男,四川绵竹人,硕士研究生,主要从事动物传染病病原微生物研究。E-mail: 709817049@qq.com

收稿日期: 2017-05-28
基金资助: “十二五”国家科技支撑计划 (2013BAD12B04)
摘要

从病死仔猪心脏中分离到一株革兰阴性菌,对该细菌进行形态学观察、生化鉴定、16S rDNA序列测定,确认该菌为猪源莫拉菌属亚种,将该菌株命名为猪源莫拉菌-ZY20001。对菌株进行致病性试验、药敏试验和部分耐药基因的检测。结果显示,该菌引起小鼠胸腔积液,不致死,对红霉素、青霉素、多粘菌素等21种抗生素药物表现不同程度的敏感,对哌拉西林耐药。菌株ZY20001具有TEM型β-内酰胺酶耐药基因,表型与基因型不符。该实验可为深入研究莫拉菌的分类进化及药物治疗提供参考依据,同时对青霉素耐药表型与基因型关系所做的初步探讨也丰富了流行病学调查资料。

关键词: 莫拉菌属; 分离鉴定; 16S rDNA; 耐药性
中图分类号:S858.28;S855.1+1 文献标志码:A 文章编号:1004-1524(2018)01-0036-07 doi: 10.3969/j.issn.1004-1524.2018.01.05
Identification and biological characteristics analysis of Moraxella from swine
LIAO Changyu1, ZHANG Pengfei1,2, WANG Yin1,2,*, YANG Zexiao1, YAO Xueping1, JIANG Ruijiao1, WU Xulong1,2, ZHANG Bo1,2, ZHOU Lijun1,2, SONG Yong3
1. College of Veterinary Medicine, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China
2. Key Laboratory of Animal Disease and Human Health of Sichuan Province, Chengdu 611130, China
3. Ruipu Biological Co., Ltd, Tianjin 300300, China
Abstract

A gram-negative bacterium was isolated from the heart of dead piglets, and morphological observation, biochemical identification and 16S rDNA sequence were performed. The strain was identified as Moraxella porci sp., which was named as Moraxella porci-ZY20001. The pathogenicity test, drug susceptibility test and partial resistance gene were detected in strain ZY20001. The results showed that the bacteria caused the pleural effusion in mice and showed varying degrees of sensitivity to erythromycin, penicillin, polymyxin and other antibiotics (a total of 21 kinds), except piperacillin. The strain ZY20001 had a TEM-type β-lactamase-resistant gene, and the phenotype was not consistent with the genotype. This study provided scientific reference for the further study of the evolution and drug therapy of Moraxella, and the analysis of relationship between penicillin resistance phenotype and genotype would enrich the epidemiological survey data.

Keyword: Moraxella; isolation and identification; 16S rDNA; drug resistance

莫拉菌属(Moraxella. ap.)是一类成对状或短链状的革兰阴性菌, 短且宽, 接近球状。卡他莫拉菌属发现于1896年, 当时称卡他微球菌(Micrococcus Catarrhais), 是上呼吸道的正常菌群之一。过去人们一致认为无致病性, 但近年来研究表明, 该菌可寄生于人和其他温血动物黏膜, 是一种条件致病菌, 当机体免疫力下降时, 可单独或与其他细菌共同引起急性中耳炎、鼻窦炎、支气管肺部感染, 以及脑膜炎、心内膜炎和败血症等各种感染[1]。所导致的感染为多点散发, 偶可引起医院内暴发, 卡他莫拉菌是急性中耳炎、鼻窦炎、慢性气管炎急性发作和社区获得性肺炎最主要的致病菌之一, 也是小儿脑膜炎及菌血症的常见病因, 引起了广泛临床关注[2]。该菌可产生穿孔毒素, 引起黏膜和结膜病变, 具有传染性[3]。其中, 牛莫拉菌可引起牛传染角膜结膜炎, 亦称牛红眼病(IBK)[4]; 该病在美国常见的牛病中居第二位, 造成巨大的经济损失, 而且全球均有发生[5]。该菌已从兔[6]、骆驼[7]、犬[8]、山羊[9]、绵羊[10]、豚鼠[11]等多种动物分离得到。近年来从患有脑膜炎、心内膜炎的病猪中分离的莫拉菌数量呈上升趋势[12, 13, 14]。

2016年11月, 从四川某地送检2 头仔猪, 症状主要为发热, 食欲减低, 呼吸急促, 眼睑有轻微肿大; 病理剖检发现胸腔大量积液, 同时心脏上附着有少量伪膜。剖检主要表现为胸膜炎症, 与副猪嗜血杆菌病理症状相似, PCR检测圆环2型病毒核酸为阳性。故本研究采用常规的微生物实验技术, 通过纯化分离、生化试验、16S rDNA扩增测序、动物试验、药敏试验以及3种耐药基因的PCR扩增分析。对送检的病料进行检测, 为该病的临床诊断、药物治疗奠定基础。

1 材料与方法
1.1 病料和试验动物

临床样品采集自四川省某猪场2 头猪的病变心脏; SPF健康昆明鼠18~22 g(购自四川达硕生物科技公司)。

1.2 主要试剂

营养琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、绵羊鲜血平板、药敏纸片及微量生化反应管均购自杭州微生物试剂有限公司; 2× Taq PCR Master Mix、DNA分子量标准、凝胶回收试剂盒等均购自成都擎科生物科技有限公司; 其他试剂均为国产分析纯。

1.3 细菌分离

无菌采集病料样品接种于胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)培养基, 37 ℃恒温培养48~72 h后观察细菌生长状况, 挑菌后革兰染色镜检, 通过平板划线法进行细菌纯化, 并用鲜血平板鉴定其溶血性。

1.4 形态学观察与生化鉴定

挑取单菌落接种于已添加5 μ L生长因子NAD的微量生化管中, 37 ℃培养48~72 h, 参照《常见细菌系统鉴定手册》[15]和《伯杰细菌鉴定手册》[16]进行生化特性鉴定。

1.5 16S rDNA的扩增及序列测定

利用试剂盒提取细菌基因组DNA, 放置于-20 ℃备用, 作为PCR模板。PCR反应体系40 μ L: 2× Taq PCR Master Mix 20.0 μ L, ddH2O 10.0 μ L, 上、下游引物各3.0 μ L(表1), 模板DNA 4.0 μ L。反应条件:95 ℃预变性5 min; 94 ℃变性1 min, 55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸2 min, 34个循环; 72 ℃延伸10 min。将PCR产物纯化后, 送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

表1 试验用引物序列 Table 1 Primer sequences used in this experiment
1.6 系统发育树的构建

PCR扩增产物测序后获得菌株的16S rDNA序列, 将该序列在GenBank上采用BLAST进行比对, 确定种属范围。选取同属不同动物源性的部分菌株16S rDNA序列用DNAstar软件进行同源性分析, 使用MEGA 5.1软件对其运用邻近法(neigh-bour joining)构建进化树(phylogenetic tree)。

1.7 小鼠致病性试验

参照改良寇氏法, 分离菌株接种到胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)培养基中, 37 ℃培养48 h后, 将菌液浓度调整为1× 109 cfu· mL-1的细菌悬液。选择用无特定病原体小鼠(SPF小鼠)(每只18~22 g), 每组5 只, 设立5 组, 腹腔注射每只注射0.2 mL的菌液; 同时设立对照组, 注射等量的无菌生理盐水。

1.8 药敏试验

参照CLSI推荐的琼脂扩散法(K-B)进行分离株的药物敏感试验。

1.9 耐药基因PCR检测

选取了β -内酰胺酶类Tem-1、DHA-1两种耐药基因和耐受碳青霉烯类药物的耐药基因OXA-48, 并分别使用相关特异性引物(表1)进行耐药基因的PCR检测。反应体系40.0 μ L: 2× Taq PCR Master Mix 20.0 μ L, 模板4.0 μ L, 上下游引物各1.5 μ L。反应条件:95 ℃预变性5 min; 94 ℃变性1 min, 55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸2 min, 34个循环; 72 ℃延伸10 min。对PCR阳性扩增片段进行胶回收, 转化至DH5α 感受态细胞中, 将产物送成都擎科生物科技有限公司测序, 将测序结果进行BLAST分析。

2 结果与分析
2.1 菌体形态观察

菌株ZY20001在普通平板生长不良, 麦康凯平板不生长, TSA生长较好, 40 h以上方可见明显菌落。该菌的菌落圆润, 半透明, 光滑, 隆起, 菌落直径1~2 mm, 无溶血性。革兰染色镜检为革兰阴性菌, 短杆状, 一般成对状排列(图1)。

图1 革兰染色结果(10× 100)Fig.1 Result of Gram staining (10× 100)

2.2 PCR扩增结果和进化树分析

将挑取的ZY20001菌落进行PCR扩增, 大小约为1 400 bp(图2)。将其16S rDNA测序结果进行BLAST比对分析, 发现与莫拉菌(GenBank登录号GU226327.1)同源性高达99%。在NCBI上选取不同来源的莫拉菌(表2)16S rDNA序列, 通过DNAstar比对同源性, 发现ZY20001与Moraxella sp.(GenBank登录号:GU226327.1)和(GenBank登录号:NR_042666.1)同源性高达99.5%(图4)。通过MEGA 5.1进行序列比对, 发现该株莫拉菌与猪源分支莫拉菌同源性最高(图3), 该分支与其他动物源分支莫拉菌为并列关系。

图2 16S rDNA扩增结果Fig.2 16S rDNA amplification results

羊 Ovis瑞典 Sweden
199/55NR_028670.1羊 Ovis瑞典 Sweden
Sp346JN001947.1牛 Calf乌拉圭 Uruguay
SJ03BJN001946.1牛 Calf乌拉圭 Uruguay
Fs328JN001948.1牛 Calf乌拉圭 Uruguay
N7NR_028914.1犬 Canis美国 USA
LMG 11194TAJ269511.1犬 Canis比利时 Belgium
表2 菌株说明 Table 2 Strain description
2.3 细菌生化特性

分离菌经48~72 h生长后, 触酶阳性; V-P试验、MR试验、H2S试验、鸟氨酸脱氢酶、运动性、葡萄糖、乳糖、半乳糖、麦芽糖、七叶酸水解阿拉伯糖、D-葡萄糖产酸产气, 0%和1%的NaCl均为阴性。与《伯杰细菌鉴定手册》描述的莫拉菌属部分菌株的部分生化特性相同, 该菌生长需要的营养要求较高。普通的单一的营养成分基本无法适应其生长。

2.4 小鼠致病性试验

注射菌液12 h左右, 小鼠出现精神不振, 部分小鼠停止进食。24 h后, 随机选取部分精神状态不佳的小鼠剖检, 未发现典型的病变特征, 48 h剖检精神状态不佳小鼠, 发现小鼠心包少量积液(约0.03 mL), 无伪膜。无菌蘸取积液接种于TSA平板, 进行分离纯化, 经过细菌分离鉴定后再次分离到该菌。96 h后, 剩余的小鼠开始逐步进食, 饮水。1周内所有小鼠逐步恢复, 试验期间, 未见死亡。

2.5 细菌的药敏试验

通过对ZY20001菌株的药敏试验, 发现其对庆大霉素, 阿米卡星等16种抗生素敏感, 对奥复星, 多粘菌素B等5种抗生素中度敏感, 对哌拉西林耐药(表4)。