作者简介:黄胜佳(1994—),女,四川成都人,硕士研究生,主要从事果树栽培理论与技术研究。E-mail: huangshengjia0206@163.com
以黄果柑为材料,用高效液相色谱(HPLC)结合灰色关联度分析法,研究有机肥、无机肥、有机无机复混肥对黄果柑酚类生物活性物质的影响。结果表明,不同施肥处理的黄果柑果肉中,除柚皮素外的其他8种酚类物质均能检出,但不同处理差异显著( P<0.05)。每棵果树施用低水平(3 kg)的有机肥对提高黄果柑果肉中酚类物质含量的效果最好,施用适量(6 kg)有机肥或低水平氮磷无机肥(N,0.41 kg;P,0.90 kg)的效果次之。在实际生产中,为提升果实的保健价值,提高果实的综合利用率,需增加黄果柑果肉中酚类物质的含量。为此,建议适当减少无机肥中氮磷的施用量,配合增施有机肥,或适当增加有机无机复混肥的施入量。
In the present study, Huangguogan was used as material to explore the effects of organic fertilizer, inorganic fertilizer and organic-inorganic compound fertilizer on phenolics of Huangguogan, with high performance liquid chromatography (HPLC) and grey relational analysis. It was shown that eight phenols were detected in Huangguogan fruit under all treatments except naringenin, but the contents of detected phenols varied significantly ( P<0.05). The increase of Huangguogan phenolic compounds contents was the highest with application of 3 kg·plant-1 organic fertilizer, and was followed by treatments with application of 6 kg·plant-1 organic fertilizer or low-N, P inorganic fertilizer (N,0.41 kg·plant-1; P, 0.90 kg·plant-1). In order to increase the value of fruit and improve the comprehensive utilization of fruit, the content of phenolics in Huangguogan should be increased. For this purpose, it was suggested to decrease the amount of nitrogen and phosphorus in inorganic fertilizer, and increase application of organic fertilizer or organic-inorganic compound fertilizer appropriately.
中国是柑橘果树的重要起源地之一, 具有丰富的柑橘种质资源。黄果柑是橘和橙的天然杂交柑[1], 具有特晚熟、极丰产、花果同树等优良性状[2]。柑橘果实富含能参与人体新陈代谢、调节有关生理活动、对人体保健和疾病防治有重要作用的生物活性物质— — 酚类物质[3, 4, 5]。研究表明, 酚类物质具有抗炎[6]、抗氧化[7]、抗过敏、抗癌、抗突变、抑菌等重要作用[8]。因此, 研究不同肥料对柑橘酚类物质含量的影响, 对提高柑橘综合利用价值具有积极意义。
国内外在测定不同柑橘品种、不同部位, 以及不同生长时期果实中酚类物质含量等方面已有大量研究, 但在环境因子, 如土壤营养对柑橘生物活性物质代谢的影响方面的研究还比较少。已有研究表明, 适量限制氮、磷肥的施用有利于黄酮类物质的积累[9]。氮素营养的缺乏会导致萜类、酚类等不含氮次生代谢产物的积累, 而增加氮素营养会加速含氮次生代谢产物如生物碱、氰苷等的合成[10]。氮肥能显著影响西红柿幼苗中酚的含量[11], 也能影响枸杞中黄酮和类胡萝卜素等生物活性物质的含量。目前, 关于肥料对植物酚类物质含量影响的研究大多注重于氮肥用量, 而有关有机肥等肥料对其影响的研究报道较少。
灰色关联度分析法是一种针对灰色系统来决定因素主次及其关联程度的评价方法。本研究结合灰色关联度分析法评价不同施肥处理对黄果柑果实酚类物质的影响, 以期为增加果实保健价值和提高柑橘的综合利用率提供参考。
试验于四川省雅安市石棉县小水村黄果柑示范园中进行。选取生长健壮、树势树形基本一致、株行距为3 m × 4 m、中等管理水平的9 a生黄果柑植株27株作为供试植株。
有机肥:发酵后的鸡粪, N+P+K≥ 8%, 有机质含量≥ 40%。
无机肥:尿素(N≥ 46.3%), 四川玖源农资化工有限公司生产; 过磷酸钙(P2O5≥ 12.0%), 四川广汉市蜀峰化工有限责任公司生产; 俄罗斯钾肥(K2O≥ 60%), 江西宜春市腾达化工有限责任公司生产。
有机无机复混肥:宝施灵黄果柑专用肥。具体配方为硫酸铵(10%), 尿素(19.6%), 磷酸一铵(15.9%), 硅钙钾肥(2.5%), 硝酸钾(1%), 硫酸钾(19%), 硫酸锌(2%), 钼酸铵(0.02%), 氨基酸(5%), 草炭(2%), 泥炭(2%), 堆肥(4%), 烟渣(2%), 青蒿(3%), 米皮(5%), 蘑菇渣(7%)。
标准品:柚皮素(naringenin), 柚皮苷(naringin), 新橙皮苷(neohesperidin), 咖啡酸(caffeic acid), 芥子酸(sinapic acid), 绿原酸(chlorogenic acid), 阿魏酸(ferulic acid), 没食子酸(gallic acid), 对羟基苯甲酸(p-hydroxybenzoic acid), 均购自Sigma公司, 纯度均在98%以上; 甲醇、甲酸和乙腈均为色谱纯, 购自麦克林公司; 水为实验室自制的超纯水。
本试验共选择无机肥(A)、有机肥(B)、有机无机复混肥(C)3类肥料, 每类肥料再分别设置低水平(1)、适量(2)、高水平(3)3种用量, 共计9个处理, 每处理重复3次, 以1棵黄果柑作为1个重复。分别于幼果期(5月1日)、果实快速膨大期(8月5日)、转色期(11月10日)各施肥1次。根据文献[12]并结合当地黄果柑园地土壤及施肥情况, 设计肥料施用量(表1), 其中, A2、B2、C2均为每种类型肥料中最适黄果柑生长发育的肥料用量。施肥时, 围绕树冠滴水线的施肥圈, 施肥圈要求深度和宽度达到20~30 cm, 以见根不伤根为宜, 在施肥圈内放入试验设计用量的肥料, 施有机肥时土肥混匀。
2016-04-15采收, 分株单独采摘, 每株按树冠外围的东西南北4个方位随机采取中等大小、成熟度相对一致、无病虫害且无霉烂的果实共12个, 采回后将果实皮肉分离, 置于-80 ℃冷冻保存备用。
1.5.1 样品前处理
从-80 ℃冰箱中取果肉至研钵中, 加入液氮研磨成粉末。准确称取0.5 g混合样放入2 mL离心管中, 避光条件下加入1.5 mL提取液(甲醇、水、甲酸体积比70%∶ 28%∶ 2%), 充分混匀。将离心管放入超声装置中辅助提取, 超声30 min后, 5 000 r· min-1离心15 min。取出离心管, 吸取上清液。用0.45 μ m微孔滤膜过滤, 贮存于-20 ℃, 用于酚酸及类黄酮分析。
1.5.2 标准曲线绘制
用色谱纯甲醇分别将每瓶定量的20 mg标准品溶解, 定容于10 mL棕色容量瓶中, 配制成2 g· L-1的标准品溶液。全程进行避光处理。将上述母液用甲醇分别配制成0.25、0.5、1、2、5、10、25、50、100 mg· L-1的浓度梯度, 再配制成混合标准溶液, 避光保存于-20 ℃以下环境中。
对不同质量浓度的混合标准溶液进行色谱分析, 以标样的质量浓度为横坐标, 峰面积为纵坐标, 绘制出9种酚类物质的标准曲线, 拟算回归方程和相关系数。
1.5.3 色谱条件
使用安捷伦1260液相色谱仪, C18色谱柱(5 μ m, 4.6 mm× 150 mm); 柱温30 ℃; 进样量20 μ L; 流动相A为10%甲酸溶液, 流动相B为乙腈; 梯度洗脱(洗脱程序如表2所示); 流速1 mL· min-1。
柚皮苷、新橙皮苷、柚皮素在283 nm波长下检测[13]; 咖啡酸、芥子酸、绿原酸、阿魏酸在320 nm波长下检测; 没食子酸、对羟基苯甲酸在260 nm波长下检测[14]。
试验数据用IBM SPSS 19.0软件进行方差分析。综合评价基于Critic和熵权2种客观赋权法进行灰色关联度分析。
图1为混合标准品55 min内分别在320、283、260 nm波长下的色谱图。根据保留时间长短, 峰依次为没食子酸、绿原酸、咖啡酸、阿魏酸、芥子酸、柚皮苷、新橙皮苷、柚皮素。由图1可知, 8种酚类物质出峰较好, 说明本研究所用方法可满足多种酚类物质的同时分离。图2为对羟基苯甲酸在260 nm波长下的色谱图。由于对羟基苯甲酸出峰时间与绿原酸出峰时间相近, 故分开测定。
根据色谱图拟合的回归方程及相关系数见表3。可以看出, 各标准品的浓度与峰面积呈良好的线性相关关系, 相关系数均超过0.999 1。
由表4可知, 不同施肥处理黄果柑酚酸含量组成差异较大。各处理条件下, 在黄果柑果肉中均检测到了绿原酸、咖啡酸、阿魏酸、芥子酸、没食子酸和对羟基苯甲酸。绿原酸含量以B2处理最高(4.765 μ g· g-1), 显著(P< 0.05)高于其他处理, 以A3处理最低(2.885 μ g· g-1)。咖啡酸含量以B1处理最高(3.529 μ g· g-1), 显著(P< 0.05)高于其他处理, 以C1处理最低(2.692 μ g· g-1)。阿魏酸含量以B1处理最高(1.101 μ g· g-1), 显著(P< 0.05)高于其他处理, 以C1处理最低(0.838 μ g· g-1)。芥子酸含量以B2处理最高(1.749 μ g· g-1), 显著(P< 0.05)高于其他处理, 以C1处理最低(1.205 μ g· g-1)。没食子酸含量以B1处理最高(3.507 μ g· g-1), 显著(P< 0.05)高于其他处理, 以B3处理最低(1.595 μ g· g-1)。对羟基苯甲酸含量以B2处理最高(6.261 μ g· g-1), 显著(P< 0.05)高于其他处理, 以C1处理最低(4.262 μ g· g-1)。总体来看, 酚酸类物质含量最高的主要出现在B1、B2处理。这说明, 低水平或适量的有机肥能显著提高果肉中酚酸物质含量。在施用无机肥的3个处理中, A1处理果肉中酚酸含量显著(P< 0.05)高于A2、A3处理, 且仅次于B1、B2处理。这说明, 施用低水平平氮磷的无机肥亦能取得较好效果。
由表5可知, 各处理果实中均检测到了柚皮苷和新橙皮苷, 但均未检测到柚皮素。各处理柚皮苷含量在2.026~4.356 μ g· g-1之间, 新橙皮苷含量在0.546~0.757 μ g· g-1之间。对比果肉中柚皮苷的含量可知, B3处理含量最高, 且显著(P< 0.05)高于其他处理。同时, 以B3、B2和A1处理的新橙皮苷含量较高。
2.4.1 熵权法分析
熵原本是热力学的概念, 主要用于形容指标信息的离散程度。一般地, 如果某个指标的信息熵(Ej)越小, 表明其指标值的变异程度越大, 提供的信息量越大, 在综合评价中所起的作用越大, 其权重也应越大; 反之, 某指标的信息熵越大, 表明其指标值的变异程度越小, 提供的信息量越小, 在综合评价中所起的作用越小, 其权重也应越小。
根据熵权法的计算步骤[15], 对不同酚类物质的信息熵和权重熵(ω j)进行测算(因柚皮素在所有处理下都未检测到, 故不予考虑)。由表6可知, 柚皮苷、没食子酸和绿原酸3个指标的熵值低, 差异性系数高, 差异梯度较大, 因此赋予高权重。柚皮苷权重值最大, 为0.296 0; 其次为没食子酸(0.292 7), 绿原酸(0.128 4), 阿魏酸权重值最小, 为0.034 5。所得指标权重排序为柚皮苷> 没食子酸> 绿原酸> 对羟基苯甲酸> 芥子酸> 咖啡酸> 新橙皮苷> 阿魏酸。
2.4.2 Critic法分析
Critic法是由Diakoulaki等[16]提出的另一种客观权重赋权的方法。该方法基于评价指标的对比强度和指标之间的冲突性来综合衡量指标的客观权重。对比强度, 是指同一个指标各个评价方案之间取值差距的大小, 以标准差的形式来表现; 指标之间的冲突性, 以指标之间的相关性为基础, 若2个评价指标之间具有较强的正相关性, 则这2个指标的冲突性较低。用Cj表示第个评价指标所包含的信息量, 值越大, 说明其所包含的信息量越大, 则其权重(ω j)亦越大。
由表7可知, 没食子酸权重值最大(0.252 2), 其次为柚皮苷(0.206 2)、绿原酸(0.195 8), 阿魏酸权重最小(0.025 1)。所得指标权重排序为没食子酸> 柚皮苷> 绿原酸> 对羟基苯甲酸> 咖啡酸> 芥子酸> 新橙皮苷> 阿魏酸。
2.4.3 Critic法与熵权法结合分析
Critic和熵权法计算指标权重都属于客观赋权的方法, 其中, 熵权法主要表现指标数据的离散性, Critic法则既兼顾到指标数据的相关性, 又考虑到数据之间的对比强度。如果将这2种方法相结合, 则可以充分考虑到数据的离散性、相关性和对比强度, 是一种更加完善的进行客观赋权的方法, 计算公式如下:
式(1)中:ω j是第j个指标权重; qij是指标i与j的相关系数; σ j是指标j的标准差; ej是指标j的熵。
基于Critic法与熵权法相结合的权重赋值结果如表8所示, 没食子酸权重值最大(0.195 2), 其次为新橙皮苷(0.178 3)、绿原酸(0.140 3), 芥子酸权重值最小(0.075 5)。所得指标权重排序依次为没食子酸> 新橙皮苷> 绿原酸> 阿魏酸> 对羟基苯甲酸> 柚皮苷> 咖啡酸> 芥子酸。
2.4.4 灰色关联度分析
将灰色关联分析与客观赋权法相结合, 可以克服采用专家赋权法等主观赋权的不确定性。对试验数据进行以下处理:根据实际情况, 确定黄果柑主要酚类物质的理想值为参试施肥处理的最高值, 组成参考数列X0。为便于分析, 采用初值化法对原始数据进行无量纲化处理。求关联系数, 进而分别计算求得关联度和关联序。对于不同酚类物质, 其相对重要程度不同, 采用基于Critic与熵权法的客观赋权法的结果赋予关联系数不同的权重值
本研究发现, 有机肥、无机肥、有机无机复混肥的施用量对黄果柑酚类物质含量的影响不仅与肥料中氮磷含量密切相关, 还与肥料种类相关。单施无机肥时, 低水平的氮磷施入量较有利于酚酸和类黄酮物质的积累, 这与Copley等[10]、Strissel等[22]的研究结果一致。单施有机肥时, 适量或低水平有机肥对增加果实中酚酸含量的效果较好, 但当施用高水平有机肥时效果不理想, 而适量或高水平有机肥对增加果实中类黄酮物质的效果较好, 施用低水平有机肥时效果不明显。有机无机复混肥的用量则以高水平较好, 能显著增加果肉中酚酸和类黄酮物质含量。本研究在黄果柑果肉中未检测到柚皮素, 与张元梅[14]结果一致。
为准确评价不同施肥处理对黄果柑果实酚类物质的影响, 本研究利用基于Critic与熵权法的客观赋权进行灰色关联度分析, 结果显示, 施用低水平的有机肥对黄果柑果肉中酚类物质含量的提高效果最好, 施用适量有机肥和低水平氮磷无机肥的效果次之。因此, 在生产实际中, 建议适当减少无机肥中氮磷施用量, 或适当增施有机肥和有机无机复混肥, 以增加黄果柑果肉中酚类物质含量。本研究未涉及不同施肥水平对黄果柑果实发育和果实品质的影响, 在今后的研究中, 应进一步结合不同施肥水平对酚类物质、果实生长发育及果实品质的影响, 全面分析, 以确定最适肥料种类和施肥量。
The authors have declared that no competing interests exist.
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