不同水温下盐酸氯苯胍在斑点叉尾鮰血浆的药代动力学研究
余琳雪1,2, 刘永涛2,3, 苏志俊1,2, 丁浩1,2, 艾晓辉2,3,*
1.水产科学国家级实验教学示范中心(上海海洋大学),上海 201306
2.中国水产科学研究院 长江水产研究所,湖北 武汉430223
3.农业农村部水产品质量安全控制重点实验室,湖北 武汉430223
*通信作者,艾晓辉,E-mail:aixh@yfi.ac.cn

作者简介:余琳雪(1992—),女,湖北襄阳人,硕士研究生,主要从事水产动物药理学及药残控制技术研究。E-mail:yulx92@126.com

摘要

研究不同水温(18、28 ℃)条件下盐酸氯苯胍(robenidine hydrochloride,ROBH)在斑点叉尾鮰( Ictalurus punctatus)血浆的药代动力学特征。以20 mg·kg-1体质量剂量的盐酸氯苯胍单次口灌斑点叉尾鮰,采用高效液相色谱-串联质谱法测定血浆中盐酸氯苯胍的浓度,内标法定量,并采用3p97药代动力学软件计算药代动力学参数、开展模型分析。结果表明,在不同水温条件下盐酸氯苯胍在斑点叉尾鮰血浆的药时曲线均符合二室模型特征,动力学方程分别为 C18 ℃=4.17e-0.01t+2.48e-0.008 t-6.65e-0.05 t C28 ℃=7.69e-0.02t+0.13e-0.01t+-7.82e-0.27 t。血浆中盐酸氯苯胍达峰时间 Tpeak 分别为42.36和10.03 h,峰浓度值 Cmax分别为3.51和5.76 μg·mL-1,表观分布容积 V/F( c)分别为3.79和2.78 L·kg-1,分布相的一级速率常数 α分别为0.248和0.222 h-1,消除相的一级速率常数 β分别为0.006和0.007 h-1,吸收半衰期 T1/2( ka)分别为14.67和2.54 h,消除半衰期 T1/2( β) 分别为85.52和58.63 h,中央室向周边室转运的一级速率常数 K12分别为0.000 2和0.000 2 h-1,周边室向中央室转运的一级速率常数 K21分别为0.009和0.01 h-1,药-时曲线下面积分别为554.18和326.74 μg·mL-1·h-1。研究结果表明,盐酸氯苯胍在斑点叉尾鮰体血浆的吸收、分布和消除受水温的影响显著,高水温条件下盐酸氯苯胍的达峰时间短,峰浓度值约是低水温时的2倍,水温对血药曲线下面积的影响较大,对肾清除率影响不大。研究结果为盐酸氯苯胍在斑点叉尾鮰养殖过程中不同季节的合理使用提供一定理论依据。

关键词: 盐酸氯苯胍; 斑点叉尾鮰; 药代动力学; 水温
中图分类号:S948 文献标志码:A 文章编号:1004-1524(2018)10-1640-07
Pharmacokinetics of robenidine hydrochloride in plasma of channel catfish ( Ictalurus punctatus) at different water temperatures
YU Linxue1,2, LIU Yongtao2,3, SU Zhijun1,2, DING Hao1,2, AI Xiaohui2,3,*
1. National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education,Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China
2. Yangtze River Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Wuhan 430223, China
3. Key Labrotary of Control of Quality and Safety for Aquatic Products, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Wuhan 430223, China
Abstract

The pharmacokinetics of robenidine hydrochloride in the plasma of channel catfish ( Ictalurus punctatus) at different water temperatures (18, 28 ℃) were investigated in this study.The concentration of robenidine hydrochloride in the plasma of channel catfish was determined by HPLC-MS. Pharmacokinetic parameters were calculated by using the 3p97 Practical Pharmacokinetic Program software. The concentration-time data of robenidine hydrochloride in plasma were fitted to a two-compartment model at both 18 ℃ and 28 ℃ water temperature. The kinetic equations were C18 ℃=4.17e-0.01 t+2.48e-0.008 t-6.65e-0.05 t, C28 ℃=7.69e-0.02 t+0.13e-0.01 t-7.82e-0.27 t, respectively. The major pharmacokinetic parameters at water temperature 18 ℃ and 28 ℃ were as follows: The time point of maximum plasma concentration ( Tpeak) was 42.36 and 10.03 h, respectively, peak plasma concentration ( Cmax) was 3.51 and 5.76 μg·mL-1, respectively. Relatively apparent distributed volume V/F( c) was approached to 3.79 and 2.78 L·kg-1, respectively. The distribution rate constant α was 0.248 and 0.222 h-1, respectively. The elimination rate constant β was 0.006 and 0.007 h-1, respectively. The absorption half-time [ T1/2( ka)] was 14.67 and 2.54 h, respectively. The elimination half-time [ T1/2( β)] was 85.52 and 58.63 h, respectively. First-order rate constant for drug distributions from central compartment to peripheral compartment ( K12) was 0.000 2 and 0.000 2 h-1,respectively. First-order rate constant for drug distributions from peripheral compartment to central compartment ( K21) was 0.009 and 0.01 h-1, respectively. The areas under the curve was 554.18 and 326.74 μg·mL-1·h-1, respectively. The results showed that the temperature could significantly affect the absorption, distribution and elimination of robenidine hydrochloride in the plasma of channel catfish. Under high water temperature, the peak time of robenidine hydrochloride was short, the peak concentration value was about twice of that at low water temperature, and the water temperature had a greater influence on the areas under the curve, but had little influence on the renal clearance rate. It also provided a theoretical basis for the rational use of robenidine hydrochloride in channel catfish farming during different seasons.

Keyword: robenidine hydrochloride; channel catfish ( Ictalurus punctatus); pharmakokinetic; water temperature

盐酸氯苯胍(robenidine hydrochloride, ROBH), 作为一种抗原虫药, 主要用于防治畜禽球虫病, 添加于饲料中对治疗鸡、兔急性、慢性球虫病均有较好的效果[1]。在水产养殖中, 盐酸氯苯胍是我国允许使用的国标渔药, 主要用于治疗鱼类孢子虫病[2]。然而, 过量使用或者使用不当会在水产动物体内产生残留, 危害人体健康。所以, 建立动物体内盐酸氯苯胍检测方法, 合理使用盐酸氯苯胍来治疗疾病, 对于保障人体健康具有重要的作用。目前关于盐酸氯苯胍的报道多是检测方法相关研究[3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11], 吴仕辉等[9]和汤菊芬等[10]分别采用高效液相色谱法和高效液相色谱-串联质谱法测定了水产品中盐酸氯苯胍的残留量; 汤菊芬等[11]研究了盐酸氯苯胍在红笛鲷体内的药代动力学及残留消除规律, 在该试验条件下, 建议盐酸氯苯胍在红笛鲷体内的休药期至少为7 d。目前, 关于盐酸氯苯胍在斑点叉尾鮰中的药代动力学研究尚未见报道, 本试验根据我国盐酸氯苯胍在养殖过程中实际用药浓度, 拟研究不同水温条件下盐酸氯苯胍在斑点叉尾鮰体内的药代动力学特征, 为盐酸氯苯胍在斑点叉尾鮰养殖中不同季节的合理应用提供一定理论依据。

1 材料与方法
1.1 试验动物

斑点叉尾鮰, 购自中国水产科学研究院长江水产研究所基地, 平均体质量(200± 50)g, 试验前将其放置于已清洗并消毒水族箱(122 cm× 80 cm× 80 cm)中暂养1周, 试验用水为充分曝气的自来水。暂养结束后, 选择无病无伤、规格均匀的个体分为2组, 每组75尾, 试验期间用加热棒控制水温, 低温组水温为(18± 1)℃, 高温组为(28± 1)℃。自然光照, 连续24 h充气。每2 d换1次水, 每次换水量1/3。及时清除水体残饵和排泄物。

1.2 药品与试剂及配制方法

盐酸氯苯胍(纯度≥ 98%, 德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司), 氘代盐酸氯苯胍标准品(纯度≥ 98%, 德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司), 盐酸氯苯胍原料药(纯度98%, 寿光市华弛化工有限公司)。乙腈, 乙酸, 乙酸乙酯, 正己烷, 甲酸(色谱纯, 美国J.T. Baker公司)。无水乙醇(分析纯, 西陇化工股份有限公司), 蒸馏水, 可溶性淀粉(分析纯, 湘中化学试剂供应站), 无水硫酸镁(分析纯, 国药集团化学试剂有限公司), 肝素钠(生物级, 上海生化试剂有限公司)。

1.2.1 灌胃液的配制

称取0.5 g盐酸氯苯胍, 用10 mL乙醇溶解, 加2 g淀粉, 并用蒸馏水定容至100 mL, 制备成浓度为5 mg· mL-1的悬浊液。灌胃前用磁力搅拌器使悬浊液混匀。

1.2.2 标准储备液的配制

分别准确称取10 mg的盐酸氯苯胍标准品和氘代盐酸氯苯胍标准品, 置于100 mL容量瓶中, 分别加少量甲醇溶解并定容至100 mL, 配制成100 mg· L-1的盐酸氯苯胍和氘代盐酸氯苯胍标准储备液, -20 ℃保存备用。

1.2.3 肝素钠溶液的制备

称取0.5 g肝素钠溶解在50 mL蒸馏水中配成1%的肝素钠溶液。

1.3 仪器与色谱条件

自动高速冷冻离心机(日本HITACHI 20PR-520 型); Mettler-Toledo AE-240 型精密电子天平(梅特勒-托利多公司); 调速混匀器(上海康华生化仪器制造厂); 磁力搅拌器(MS-PA 美国SCILOGEX); 氮吹仪(AOSHENG, 杭州奥盛仪器有限公司); 高效液相色谱-串联质谱(SURYEYOR MS PUMP PLUS, SURYEYOR AUTOSAMPLER PLUS, Thermo TSQ QUANTUM ACESS MAX及Thermo LCquan 2. 6 数据采集处理软件)。

色谱柱:Symmetry® C18(100 mm× 2.1 mm× 3.5 μ m)色谱柱; 流速为250 μ L· min-1; 进样量20.0 μ L; 柱温30 ℃。梯度洗脱条件见表1, A相为0.1%甲酸水溶液, B相为甲醇。

表1 流动相梯度洗脱程序 Table 1 Mobile phase gradient elution program %
1.4 质谱分析条件

采用加热电喷雾离子源(HESI), 负离子模式; 检测方式采用选择反应监测(SRM)模式; 喷雾电压-3 000 V; 鞘气压力40 kPa; 辅助气压力5 kPa; 蒸发气温度350 ℃; 碰撞气氩气, 压力1.5 MPa; 离子传输毛细管温度350 ℃。母离子, 定性离子对, 定量离子对和碰撞能量见表2

表2 盐酸氯苯胍和氘代盐酸氯苯胍质谱条件 Table 2 Mass spectrometry parameters of ROBH and ROBH-D8
1.5 给药方式及样品采集

给药方式:盐酸氯苯胍灌胃液按20 mg· kg-1的剂量对斑点叉尾鮰进行灌胃。先将投胃管装好灌胃液, 然后慢慢将投胃管插入胃内, 将药液慢慢推到胃内, 给药后保定1 min再放入水箱中。试验前停喂24 h再进行给药操作。

样品采集:分别于给药后 0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、48、72、96、120、144、168 h自尾静脉采血样, 每个时间点采样5尾, 从尾静脉采集血液样品, 装于用肝素钠溶液润洗的离心管中, 1 776 g离心5 min, 取上清液-20 ℃冰箱保存备用。给药前采取同一批斑点叉尾鮰血浆作为空白样品。

1.6 样品处理

将血浆样品在室温下解冻后, 摇匀, 准确吸取1.0 mL于10 mL离心管中, 加入50 μ L 1 μ g· mL-1内标溶液氘代盐酸氯苯胍, 加入5 mL 1%甲酸乙酸乙酯溶液, 置调速混匀器上涡旋振荡30 s, 超声5 min, 再加入0.5 g无水硫酸镁, 涡旋振荡30 s, 7 104 g离心5 min, 将上清液转移到另一支10 mL离心管中, 再向溶液中加入3 mL 1%甲酸乙酸乙酯溶液, 涡旋振荡30 s, 7 104 g离心5 min, 合并两次上清液于10 mL离心管中, 置45 ℃氮吹仪上吹至干, 用1 mL定容溶液(A、B体积比30∶ 70)溶解残渣, 涡旋振荡30 s, 15 984 g离心5 min, 0.22 μ m微孔滤膜过滤后上机检测。

1.7 标准曲线制备及回收率与精密度测定

标准曲线制备:以标准储备液为基础, 配制含氘代盐酸氯苯胍内标50 ng· mL-1, 盐酸氯苯胍浓度为0.01、0.05、0.2、0.5、2, 5、10、20 μ g· mL-1的标准曲线, 作HPLC-MS分析。以测得的盐酸氯苯胍和氘代盐酸氯苯胍的峰面积比值为纵坐标, 盐酸氯苯胍的浓度为横坐标, 绘制标准曲线, 计算回归方程和相关系数。

回收率与精密度测定:在空白血浆中分别添加4个浓度水平的标准溶液, 使血浆中盐酸氯苯胍质量浓度分别为1、10、50、100 ng· mL-1, 氘代盐酸氯苯胍的质量浓度为50 ng· mL-1。每个浓度样品, 日内做5个重复, 一周内重复做5次, 计算日内及日间精密度。

1.8 数据处理

标准曲线, 药-时曲线图采用Microsoft Excel 2013软件绘制; 药物动力学模型拟合及参数计算采用中国药理学会数学专业委员会编制的3p97药代动力学程序软件处理。

2 结果与分析
2.1 色谱特征和标准曲线

在1~20 μ g· mL-1浓度范围内盐酸氯苯胍线性关系良好, 线性方程为y=0.010 7x+0.019 1, 决定系数R2=0.999 1。

在本试验建立的色谱条件下, 基线走动平稳, 盐酸氯苯胍峰形良好, 无明显杂质峰影响, 色谱图见图1。盐酸氯苯胍的出峰时间为5.69 min, 氘代盐酸氯苯胍的出峰时间为5.68 min, 样品的分析时间为9 min。

图1 50 ng· mL-1盐酸氯苯胍与盐酸氯苯胍-D8标准溶液溶液SRM色谱图(左)和空白血浆加标50 ng· mL-1盐酸氯苯胍与盐酸氯苯胍-D8 SRM色谱图(右)Fig.1 SRM chromatogram of 50 ng· mL-1 ROBH and ROBH-D8 standard solution (left) and SRM chromatogram of blank plasma adding 50 ng· mL-1 ROBH and ROBH-D8 (right)

2.2 回收率、准确度及精密度考查

以1、10、50和100 ng· mL-1 4个添加浓度测定血浆样品中盐酸氯苯胍的平均回收率, 分别为(89.43± 2.88)%、(88.07± 2.57)%、(116.45± 1.17)%和(95.22± 1.51)%, 日内变异系数为3.8%、7.19%、1.09%和4.49%, 日间变异系数4.19%、11.68%、5.88%和6.74%。按3倍信噪比计算血浆中盐酸氯苯胍检测限为0.5 ng· mL-1, 定量限为1 ng· mL-1

2.3 不同水温下盐酸氯苯胍在斑点叉尾鮰血浆中药物浓度的变化

在18、28 ℃水温条件下, 以斑点叉尾鮰为研究对象, 按20 mg· kg-1的剂量口灌盐酸氯苯胍, 计算其在不同水温条件下的血浆药物浓度, 药-时曲线见图2。通过对药-时曲线的对比分析可以看出, 盐酸氯苯胍在斑点叉尾鮰血浆中的吸收、分布和消除速率在温度升高时明显加快; 18 ℃水温时, 灌胃0.5 h后, 盐酸氯苯胍的血药浓度为(1.03± 0.31)μ g· mL-1, 随后药物浓度上下浮动变化, 直至12 h血药浓度达到第1个峰值(4.57± 1.04)μ g· mL-1, 24 h又迅速下降到(2.27± 0.23)μ g· mL-1, 48 h后血药浓度到达第2个峰值(3.87± 0.80)μ g· mL-1, 随后血药浓度逐渐下降, 168 h后仍能检测到, 浓度为(0.95± 0.35)μ g· mL-1; 28 ℃条件下, 给药0.5 h后, 血药浓度为(1.81± 0.23)μ g· mL-1, 随后药物浓度逐渐上升, 直至8 h血药浓度达到第1个峰值(10.78± 0.86)μ g· mL-1, 24 h后血药浓度到达第2个峰值(4.33± 1.98)μ g· mL-1, 随后血药浓度逐渐下降, 168 h后到达最低值(0.02± 0.01)μ g· mL-1

图2 18 ℃和28 ℃水温条件下盐酸氯苯胍在斑点叉尾鮰体内的药时曲线Fig.2 Concentration-time curve of ROBH in channel catfish plasma at 18 ℃ and 28 ℃

2.4 不同水温下盐酸氯苯胍在斑点叉尾鮰血浆中药代动力学特征

不同水温(18、28 ℃)条件下, 单剂量20 mg· kg-1口灌盐酸氯苯胍在斑点叉尾鮰体内药代动力学特征经3p97软件对血浆中药-时曲线的数据进行拟合和分析, 结果显示, 在2种温度下药动学均符合二室模型特征, 其在血浆中的药-时方程为C18 ℃=4.17e-0.01t+2.48e-0.008t-6.65e-0.05t, C28 ℃=7.69e-0.02t+0.13e-0.01t-7.82e-0.27t

2.5 不同水温下盐酸氯苯胍在斑点叉尾鮰血浆的药动学参数

采用3p97实用药代动力学软件对血浆中药物浓度-时间的数据进行拟合, 结果表明, 盐酸氯苯胍在血浆中的药动学符合二室模型, 其主要参数见表3。由表3可以看出, 当水温升高时, 吸收速率(ka)、分布速率(α )和消除速率(β )均较快, 吸收半衰期[T1/2(ka)]、分布半衰期[T1/2(α )]和消除半衰期[T1/2(β )]均缩短。而且28 ℃条件下其达峰时间(Tpeak)和药时曲线下面积(AUC)也低于18 ℃条件下。

表3 在18 ℃和28 ℃条件下单剂量口灌20 mg· kg-1盐酸氯苯胍在斑点叉尾鮰体内的药代动力学参数 Table 3 Pharmacokinetic parameters for ROBH following single oral administration of 20 mg· kg-1 at 18 ℃ and 28 ℃
3 讨论
3.1 盐酸氯苯胍在斑点叉尾鮰血浆中的药-时曲线特征

斑点叉尾鮰按20 mg· kg-1单剂量口灌盐酸氯苯胍后, 在18 ℃和28 ℃下, 由图2可以看出, 盐酸氯苯胍在血浆中的药-时曲线均出现了明显的双峰现象。目前, 关于口服药物药-时曲线双峰现象的报道较多[12, 13, 14, 15], 主要有以下几种解释:肝肠循环, 指药物经胆汁排入十二指肠后, 部分药物可再经小肠上皮细胞被重新吸收返回肝脏, 从而引起双峰现象; 双部位吸收, 指口服药物在胃肠两个部位吸收时, 有快有慢, 因而出现双峰; 胃排空, 由于胃在一定的时间会进行排空, 因而导致药物进入小肠的时间不同, 造成药物两次入血, 出现双峰。脂溶性药物口服吸收后, 迅速分布到组织中, 在血液中药物代谢到一定程度后, 也会出现二次释放入血, 出现双峰。此外, 双峰现象还可能与药物的分布、重吸收有关, 即当其他组织的药物浓度高于血浆药物浓度时, 药物可能会转移到血中, 引起血药浓度的再次升高[16]。本试验除以上的因素外, 灌胃液在配制过程中加入了淀粉, 淀粉的存在可能导致盐酸氯苯胍延迟吸收, 从而可能导致双峰现象的出现。

3.2 盐酸氯苯胍在斑点叉尾鮰体内的药动学特征

本研究在不同水温(18± 1) ℃、(28± 1) ℃条件下, 将盐酸氯苯胍按20 mg· kg-1的剂量单次口灌斑点叉尾鮰, 经过3p97软件进行房室模型分析, 结果显示符合二室模型特征。对比18 ℃和28 ℃下的药动学参数可知:低温时盐酸氯苯胍在斑点叉尾鮰血浆中吸收缓慢, 在血浆中保留时间较长; 高温时盐酸氯苯胍在斑点叉尾鮰血浆中消除的速率快, 说明温度能够影响盐酸氯苯胍在斑点叉尾鮰血浆的吸收、分布与消除。V/F(c)是相对表观分布容积, 它表示当药物在体内分布达到动态平衡时, 体内药量与血药浓度的比值称表观分布容积。V/F(c)值的大小与血药浓度有关, 血药浓度越高, V/F(c)越小; 反之, V/F(c)越大。由表3可知, 盐酸氯苯胍在斑点叉尾鮰体内分布广泛, 且药物的组织浓度高于血浆浓度。此外, 水温对达峰时间、最高血药浓度和血药曲线下面积的影响较大, 对肾清除率影响不大。该研究结果表明, 28 ℃时盐酸氯苯胍在斑点叉尾鮰血浆中吸收快、消除也快。李强等[17]采用高效液相色谱法研究盐酸氯苯胍在兔体内的药动学, 结果发现静脉注射给药时, 药物在兔组织中分布广泛, 并且消除也快; 而内服给药时, 药物的吸收和排泄非常缓慢, 而且吸收较差, Cmax仅为0.32 μ g· mL-1。说明盐酸氯苯胍的吸收快慢不仅与作用对象有关, 而且与给药方式也密切相关。汤菊芬等[11]研究了28 ℃时30 mg· kg-1口灌盐酸氯苯胍在红笛鲷体内的药代动力学, 其报道的药代动力学房室模型与本文一致。盐酸氯苯胍在红笛鲷血浆内1.5 h左右出现第1次峰值, Cmax为0.21 μ g· mL-1, 而本试验在28 ℃时血浆的Cmax为5.76 μ g· mL-1, 相差20多倍, 说明盐酸氯苯胍在斑点叉尾鮰中的吸收比红笛鲷好, 但考虑到其消除较缓慢, 在体内驻留时间长, 高水温时使用盐酸氯苯胍作用于斑点叉尾鮰, 在药物有效剂量范围内可适当降低药物使用浓度。为了进一步研究盐酸氯苯胍在斑点叉尾鮰体内的药代动力学情况, 还须对其肝、肾、肌肉、皮等组织进行测定分析, 并研究其残留消除规律, 以便制定盐酸氯苯胍在斑点叉尾鮰体内的休药期, 保证水产品的质量安全。

通过研究不同水温下盐酸氯苯胍在斑点叉尾鮰体内的药代动力学特征, 可为斑点叉尾鮰不同季节养殖过程中合理使用该药提供理论依据, 也可为斑点叉尾鮰体内盐酸氯苯胍的药代动力学研究、最高残留限量的制定及休药期的确定提供理论支持。

(责任编辑 卢福庄)

The authors have declared that no competing interests exist.

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