津绿1号黄瓜(天津市绿丰园艺新技术开发有限公司)购自合肥先锋种业, 拟南芥、烟草种子、pCAMBIA1305载体与P19菌株由安徽农业大学生命科学学院作物生物学重点实验室提供。大肠埃希菌JM109感受态细胞、农杆菌感受态细胞、凝胶回收试剂盒、植物基因组DNA提取试剂盒及质粒提取试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司。限制性内切酶购自宝生物工程(大连)有限公司。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。其他试剂购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2.1 CsMADSs基因克隆

采用Trizol试剂法提取黄瓜叶片总RNA, 反转录成cDNA。用引物P1/P2和P3/P4(表1)分别扩增CsMADS08和CsMADS21序列, 回收目的片段。连接pMD19-T载体, 转化大肠埃希菌JM109感受态细胞, 提取质粒进行酶切验证, 取阳性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 CsMADSs、Gus及Hyg基因扩增的引物序列及其参数 Table 1 Primer sequences and parameters of CsMADSs, Gus and Hyg 引物 Primer 引物序列 Primer sequence 作用 Function P1 P2 P3 P4 Hyg-F Hyg-R GUS-F GUS-R MADS08-F MADS08-R MADS21-F MADS21-R Actin-F Actin-R CCA-GGATCC-ATGGGAAGAGGGAGAGTTCAG CCCCCC-GTCGAC-TTACCCAAATGATAAAGAAGGGA GGG-GGATCC-ATGGGAAGAGGTAGGGTTCAA GGCG-GTCGAC-TTACCCAATGTTTAGAGAGGGATG CTTCTGCGGGCGATTTGTG GGCGAAGAATCTCGTGCTTTC GCGAAGTCTTTATACCGAAAGGTTG GCCCTTCACTGCCACTGACC GAGAATAGGCAGCTAGCGAA G-AAAGAAGGGATTGGTGGTG GAGAACAATGTCCAACTGGC AGGAGGTGGTGGGAATAAGA GCACCAAGCAGCATGAAGA GAACCACCGATCCAGACACT 扩增CsMADS08基因 For CsMADS08 gene amplification 扩增CsMADS21基因 For CsMADS21 gene amplification 扩增Hyg基因特异片段 For Hyg fragment amplification 扩增Gus基因特异片段 For Gus gene fragment amplification CsMADS08基因荧光定量引物 Fluorescence quantitative primers for CsMADS08 CsMADS21基因片段荧光定量引物 Fluorescence quantitative primers for CsMADS21 Actin2基因荧光定量引物 Fluorescence quantitative primers for Actin2

表1 CsMADSs、Gus及Hyg基因扩增的引物序列及其参数 Table 1 Primer sequences and parameters of CsMADSs, Gus and Hyg

1.2.2 过表达载体构建及农杆菌遗传转化

利用BglⅡ 、SalⅠ 双酶切pCAMBIA1305-GFP载体^[28], 回收大片段; 利用BamHⅠ 、SalⅠ 双酶切质粒pMD19-T-CsMADSs, 回收小片段CsMADSs。采用T₄连接酶连接过夜, 连接液转化大肠埃希菌JM109, 经筛选获得重组质粒pCAMBIA1305-CsMADS08及pCAMBIA1305-CsMADS21。冻融法转化农杆菌EHA105。挑取农杆菌单克隆提取质粒, 并进行PCR验证。挑选阳性克隆摇菌, -70 ℃冰箱保存, 用于瞬时转化烟草和侵染拟南芥。

1.2.3 亚细胞定位

取pCAMBIA1305-CsMADSs农杆菌菌液及P19菌株分别摇菌, 并按比例混合菌液, 离心10 min, 收集菌体。加入2 mL处理液(0.5 mol· L^-1 MES 200 μ L, 1 mol· L^-1 MgCl₂ 100 μ L, 100 mmol· L^-1 乙酰丁酮10 μ L, 加水至10 mL), 吹打混匀, 然后注射6叶期的烟草叶片, 湿润避光环境下培养36~48 h。取烟草幼叶, 切割成0.5 cm × 0.5 cm, 平铺在载玻片上, 加几滴蒸馏水盖好盖玻片并轻压片, 置于共聚焦显微镜下扫描拍摄(激发光波长488 nm, 发射光波长520~550 nm), 观察GFP在烟草叶片细胞的分布。

1.2.4 拟南芥种植及侵染

营养土和蛭石按体积比1∶ 3混匀装盆, 播种拟南芥, 待其抽薹开花后进行侵染。

取100 μ L农杆菌菌液, 加入45 mL的YEP培养基, 培养至D值为0.8。4 ℃ 4 000 r· min^-1 离心10 min, 取菌体加入Buffer(MS 0.11 g, 蔗糖2.5 g, MES 0.025 g溶于50 mL纯水, 调节pH值至5.7, 加入15 μ L表面活化剂Silwet-77, 磁力搅拌30 min。)吹打混匀, 侵染拟南芥花序, 并套袋, 共侵染2~3次。待种子成熟进行采收(T₁代), 置于37 ℃烘干, 4 ℃保存。

1.2.5 转基因拟南芥的筛选及表型观测

称取30 mg T₁代种子, 75%乙醇消毒1 min, 再用灭菌水清洗3次, 然后用0.1%灭菌琼脂糖悬浮种子, 均匀平铺于含30 mg· L^-1潮霉素的MS培养基上。以野生型为对照。待植株长到6片叶时, 将长势强的抗性植株移栽到盆中。7 d后, 利用DNA提取试剂盒提取叶片基因组DNA, PCR扩增潮霉素抗性基因Hyg、Gus报告基因及目的基因CsMADS08和CsMADS21。经检测呈阳性的植株按单株收获种子(T₂代), 其余后代按同样方式筛选种植直至获得纯合植株, 观察和鉴定各世代植株的表型。

1.2.6 转基因拟南芥CsMADSs的表达分析

采用Trizol法提取T₃代转基因拟南芥及野生型拟南芥花期各器官(根、茎、叶、花)的总RNA, 用微量核酸测定仪(ND2000)及琼脂糖凝胶电泳检测RNA的纯度及浓度。用反转录试剂盒PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser除去基因组DNA, 并进行反转录反应。实时荧光定量PCR反应按照SYBR Premix Ex Taq Ⅱ (宝生物染料法荧光定量试剂盒)说明书进行。反应体系如下:SYBR Green Master mix 12.5 μ L, 上游引物(10 μ mol· L^-1)1.0 μ L, 下游引物(10 μ mol· L^-1)1.0 μ L, cDNA原液0.9 μ g, 加RNase free H₂O至25 μ L。以拟南芥Actin2(AT3G18780)基因为内参, 引物序列见表1。实时荧光定量PCR反应条件为:50 ℃ 2 min; 95 ℃ 10 min, 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 1 min, 40个循环。每个试样重复4次, 以非转化株为对照。qPCR结果采用2^{-Δ Δ Ct}法计算。

提取黄瓜叶片总RNA, 经反转录成cDNA, 分别以P1/P2和P3/P4为引物, 扩增得到约650 bp的片段, 回收目的片段, 连接pMD19-T载体, 经测序得到的CsMADS08和CsMADS21长度分别为633 bp和645 bp。利用BamHⅠ 、SalⅠ 双酶切质粒pMD19-T-CsMADSs, 连接到经BglⅡ 、SalⅠ 双酶切的pCAMBIA1305载体中, 转化农杆菌EHA105, 提取质粒进行PCR验证。结果(图1)表明, 目的基因已经成功连接到pCAMBIA1305载体中。

图1

Fig.1

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图1 重组质粒pCAMBIA1305-CsMADSs的PCR验证Fig.1 PCR amplification of recombinant plasmid pCAMBIA1305-CsMADSs M, DL 2 000 DNA marker; A, CsMADS08; B, CsMADS21.

利用激光共聚焦显微镜观测CsMADSs在烟草叶片细胞中的定位情况。结果(图2)显示, CsMADS08定位于细胞膜和细胞核上(图2-A), CsMADS21定位于细胞膜上(图2-B), 对照pCAMBIA1305空载体定位于细胞膜和细胞核上(图2-C)。

图2

Fig.2

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	图2 CsMADSs基因在烟草叶片的亚细胞定位 A, CsMADS08; B, CsMADS21; C, pCAMBIA1305载体; D~F, 烟草叶片明场对照图。Fig.2 Subcellular localization of CsMADSs in tobacco leaf A, CsMADS08; B, CsMADS21; C, pCAMBIA1305 vector; D-F, Contrast picture of tabacco leaves in open field.

取T₁代拟南芥种子, 经消毒后平铺于含30 mg· L^-1潮霉素的MS培养基中, 以野生型为对照。结果发现, 野生型植株均出现黄化直至死亡, 大部分T₁代植株表现出与野生型相似的表型, 只有少数植株生长正常。将生长健壮的植株移栽于营养钵中, 精细管理, 供后续检测。

提取潮霉素抗性植株的叶片DNA, PCR分别扩增潮霉素抗性基因和Gus基因。其中, 转CsMADS08基因的抗性植株, 利用潮霉素抗性基因及CsMADS08基因进行PCR检测, 结果显示有目的条带(图3-A, 3-C)。转CsMADS21的抗性植株, 利用潮霉素抗性基因、CsMADS21及Gus报告基因进行PCR检测, 分别得到相应的扩增条带(图3-B, 3-C, 3-D)。

图3

Fig.3

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图3 转基因拟南芥植株的PCR电泳图 A: 1~3, 转CsMADS08植株的潮霉素基因扩增; 4, 阴性对照(非转化株)。B: 1~4, 转CsMADS21植株的潮霉素基因扩增; 5, 阴性对照(非转化株)。C: 1, pCAMBIA1305-CsMADS08质粒的CsMADS08扩增; 2, 过表达拟南芥植株的CsMADS08扩增; 3, 阴性对照(非转化株); 4, pCAMBIA1305-CsMADS21质粒的CsMADS21扩增; 5, 过表达拟南芥植株的CsMADS21扩增。D: 1~4, 转CsMADS21植株的Gus基因扩增; 5, 阴性对照(非转化株)。Fig.3 Electrophoresis map of Arabidopsis transgenic plants A: 1-3, Hyg gene amplification of CsMADS08 transgenic plants; 4, Negative control (non-transgenic plants). B: 1-4, Hyg gene amplification of CsMADS21 transgenic plants; 5, Negative control (non-transgenic plants). C: 1, Amplification of CsMADS08 in pCAMBIA1305-CsMADS08 plasmids; 2, Amplification of CsMADS08 in CsMADS08 transgenic plants; 3, Negative control (non-transgenic plants); 4, Amplification of CsMADS21 in pCAMBIA1305-CsMADS21 plasmids; 5, Amplification of CsMADS21 in CsMADS21 transgenic plants. D: 1-4, Gus gene amplification of CsMADS21 transgenic plants; 5, Negative control (non-transgenic plants).

在T₂、T₃代转基因拟南芥植株中, 过表达CsMADS21的拟南芥植株, 主茎的花序发育比野生型早5~6 d(图4-A); 同时植株叶片颜色加深, 呈紫色(图4-B), 且侧枝数增加, 侧生花序及果荚数都较野生型多(图4-D)。而过表达CsMADS08的拟南芥植株, 幼苗期出现大量的莲座叶, 同时侧枝上出现大量莲座状丛生叶片(图4-C), 甚至果荚成熟后, 依然有新的莲座状的茎生叶抽出(图4-E), 侧枝数减少, 果荚数减少(图4-D); 植株也出现叶片颜色加深, 呈紫色。提取过表达转基因拟南芥及野生型拟南芥叶片的花青素, 结果显示, 过表达植株叶片的花青素含量均比野生型高, 达到显著差异(结果未列出)。

图4

Fig.4

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图4 转基因拟南芥植株的表型变化 A:野生型拟南芥(左), 转CsMADS21拟南芥(右); B:上为过表达拟南芥植株呈紫色, 下为野生型拟南芥; C:过表达CsMADS08拟南芥的莲座状茎生叶; D:左为野生型, 中为过表达CsMADS21拟南芥, 右为过表达CsMADS08拟南芥; E:左为野生型, 右为过表达CsMADS08拟南芥的茎生叶。Fig.4 Phenotypic variation of Arabidopsis transgenic plants A: Wild type in left, CsMADS21 transgenic plants in right; B: CsMADS21 transgenic plants on the top and wild type are below; C: Cauline leaves of CsMADS08 transgenic plants; D: Wild type in left, CsMADS21 transgenic plants in middle, CsMADS08 transgenic plants in right; E: Wild type in left, cauline leaves of CsMADS08 transgenic plants in right.

与野生型植株相比, T₄代转CsMAD08的拟南芥植株出现了表型分化。一种表现为株型矮化、分枝数多, 分枝细弱; 另一种则出现植株莲座叶增多, 茎上着生莲座状叶片, 叶片多而分枝少的现象(图5)。

图5

Fig.5

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	图5 T4代转CsMADS08拟南芥的表型分离 左:野生型拟南芥; 中和右:转CsMADS08拟南芥。Fig.5 Phenotypic segregation of T4CsMADS08 Arabidopsis transgenic plants Left, Wild type; Middle and right, CsMADS08 transgenic plants.

采用Trizol法提取T₃代植株各器官总RNA, 反转录成cDNA, 实时荧光定量PCR检测CsMADS08和CsMADS21的表达情况。结果表明:过表达CsMADS08的拟南芥植株, 目的基因在茎中表达量较高, 在其他器官中的表达量较低(图6-A); 过表达CsMADS21的拟南芥植株, 目的基因在花中表达量较高, 在根、茎、叶中表达量较低(图6-B)。

图6

Fig.6

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	图6 过表达拟南芥植株CsMADSs基因的表达Fig.6 Expression analysis of CsMADSs in Arabidopsis transgenic plants

过表达CsMADS08的拟南芥植株, 主茎刚抽出时, 其莲座叶数目增加, 茎生叶也呈现丛生状。花序抽生时, 侧枝数目少, 果荚较野生型瘦弱, 株型较矮。在生长后期, 侧枝上出现大量的莲座状叶片, 侧枝果荚数目少, 果荚较短, 较瘦瘪。在野生型植株完全成熟后, 同期过表达CsMADS08的拟南芥植株侧枝上还会有新的莲座叶出现。过表达CsMADS08的T₄代植株表型出现了分化, 一种株型矮化、分枝多, 枝条细弱, 而另一种则表现为莲座叶数目增多而分枝减少。说明CsMADS08基因可能参与调控植株腋芽的分化方向, 分化形成更多的叶片; 由于植株不断产生莲座状叶片, 致使营养流向新生的幼叶, 造成植株分枝数减少, 开花和结荚数也相应减少, 果实得不到足够的养分供应, 所以果实瘦弱干瘪。该研究结果与Guo等^[22]的结果相似, 其研究结果表明番茄MADS-box基因SLMBP11(AGL15亚家族的成员)能显著降低株高、叶面积、节间长度, 而叶腋的分枝数、节点和叶片数都增加, 推测该基因可能调控腋芽的生长。黄瓜CsMADS08基因如何调控腋芽的生长还有待进一步验证。相反, 过表达CsMADS21的拟南芥植株, 其主茎开花结果比野生型早5~6 d, 侧枝数目增加, 花序较多, 结荚率高, 果荚饱满。说明CsMADS21可能参与花芽的分化、形成及果实的发育, 相关的后续研究正在进行。前期研究结果表明, 黄瓜CsMADS08及CsMADS21属于AP1-FUL类的MADS-box基因, 而且与拟南芥的AtAGL7、AtAGL8及AtAGL79具有较高的同源性^[23]。有报道认为, AGL8在拟南芥的果实发育及叶片形状方面起调控作用^[29], 黄瓜CsMADS21的结果与此相似, 但CsMADS08的结果与此不同。AtAGL7及AtAGL79对拟南芥生长发育的影响尚未见报道。褚婷婷等^[30]研究了拟南芥AP1-FUL类基因的表达调控模式, 发现FUL启动子的上游存在2个抑制其表达的顺式作用元件, 且FUL基因的第1个内含子参与拟南芥心皮核雄蕊的发育调控。

MADS-box作为一类重要的转录调控因子, 参与植物许多重要的生物学过程, 尤其在花及果实的发育成熟过程中起重要作用。Yin等^[31]研究了SIMBP8基因在番茄各器官的表达情况, 发现其在番茄的老叶、萼片及后期的果实中高表达, 进一步研究发现, SIMBP8干涉转基因植株的果实能产生较高的乙烯, 其成熟时间比野生型提前2~4 d, 说明SIMBP8对番茄果实后熟软化起重要作用。本试验中, 过表达CsMADS08的拟南芥植株, 目的基因在茎中有较高的表达量, 在其他器官中表达量较低, 这可能与CsMADS08参与控制腋芽的分化以及莲座叶的形成相关, 这与Guo等^[22]的研究结果类似。CsMADS08对茎或侧枝的生长可能起着负调控作用, 促使腋芽分化形成更多的叶片, 导致植株的营养大多流向新生的叶片, 造成植株分枝少、结荚少。而过表达CsMADS21的拟南芥植株, 目的基因在花中有较高的表达量, 而在根、茎、叶中表达量较低, 该结果与之前各世代在表型上的特征相一致, 花期提前、花序多、结荚率高及果荚饱满等, 进一步说明CsMADS21可能参与花的分化及果实的发育。至于CsMADS08和CsMADS21在黄瓜生长发育过程中的调控作用还有待于进一步研究。

(责任编辑 侯春晓)