恶臭假单胞杆菌标准菌株Pseudomonas putida ATCC12633, 来自中国典型培养物保藏中心; 秀珍菇菌株为台秀57-FJLY, 来自福建省罗源县。

细菌分离纯化采用NA培养基(配方:酵母粉1 g、牛肉膏3 g、蛋白胨5 g、蔗糖10 g, 加ddH₂O补至1 000 mL, 并调整pH至7.0)。菌落培养采用King's B培养基(配方:蛋白胨20 g、磷酸氢二钾1.5 g、硫酸镁1.5 g、甘油10 mL、琼脂15 g, 加ddH₂O补至1 000 mL); MBT鉴定采用TSA培养基(配方:胰蛋白胨15 g、大豆蛋白胨5 g、氯化钠5 g、琼脂15 g, 加ddH₂O补至1 000 mL, 并调整pH至7.3± 0.2); FAME鉴定采用TSBA培养基(配方:胰蛋白胨大豆肉汤30 g、琼脂15 g, 加ddH₂O补至1 000 mL)。

2016年底, 从浙江省淳安县发病的秀珍菇菇房内采集新发病的菇包, 作为病害诊断和病原菌分离的样品。在NA培养基上划线分离培养, 每个菇包划2个培养皿, 每个培养皿上挑取1个单菌落纯化, 共获得10个菌株。革兰氏染色、菌落形态和部分细菌学特征测定参照Schaad等^[7]的方法。

用39%棉籽壳、39%木屑、20%麸皮及2%石灰组成培养料, 将含水量控制在60%左右, 搅拌均匀后装入18 cm× 38 cm的聚乙烯塑料袋中, 100 ℃常压灭菌10 h。然后接入秀珍菇菌株(台秀57-FJLY), 置于28 ℃人工气候箱中培养。待菌丝长至菇包口, 形成菌膜即将出菇时, 去除菌膜, 用一次性注射器接入1.2节分离的各菌株悬浮液(浓度为3× 10⁸ cfu· mL^-1) 10 mL, 每菌株重复3个菇包。另取3个菇包接入10 mL无菌水作为对照。在28 ℃、相对湿度85%的人工气候箱中继续培养, 从第3天开始每天观察记录病情发展情况, 并从发病菇包中重新分离病原菌进行验证, 病原菌分离方法同1.2节。

从1.3节鉴定的秀珍菇黄菇病菌中选取5个代表菌株进行全自动快速微生物质谱检测系统(MALDI Biotyper, MBT)鉴定。各菌株在TSA培养基上培养24 h, 挑取单菌落加入含300 μ L ddH₂0的1.5 mL EP管中, 混匀后加入900 μ L无水乙醇, 混匀后10 000 r· min^-1离心2 min, 弃去上清液。加入50 μ L 70%甲酸, 混匀后再加入50 μ L乙腈, 混匀后10 000 r· min^-1离心2 min, 吸取上清液到另一干净的1.5 mL EP管中。吸取1 μ L上清液置于MALDI样品靶上, 放干后取1 μ L基质溶液用于测定。鉴定结果用FAV 3.0 (flex analysis version)和MBV2.0 SR (MALDI BioTyper Version 2.0 SR 1)分析。将分析结果与数据库(Biotyper)中储存的标准菌种的质谱信息进行比对。

FAME鉴定采用美国Agilent 6890N气相色谱系统, 参照MIDI (microbial identification system)公司说明书进行。纯化的5个代表菌株在NA培养基上30 ℃培养24 h, 后转入含有3%胰蛋白酶的TSBA培养基上再培养24 h。然后用直径4 mm的无菌塑料接种环挑取一环培养菌放入干燥的有螺帽的试管底部, 提取脂肪酸。鉴定结果通过MIDI Sherlock 6.0微生物鉴定系统软件获得。将分析结果与数据库(TSBA6 6.00)中储存的标准菌种的脂肪酸信息进行比对。

采用细菌16S rRNA基因的通用引物对27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')^[8]和1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')^[8], 对分离的秀珍菇黄菇病病原菌进行PCR扩增。扩增反应体系为:Redmix E 25 μ L, 27F 1.25 μ L, 1492R 1.25 μ L, DNA 2 μ L, 加ddH₂O补足至50 μ L。反应条件为:94 ℃ 5 min; 94 ℃ 30 s, 53 ℃ 30 s, 72 ℃ 60 s, 35个循环; 72 ℃ 10 min。PCR反应在S1000 Thermal Cycler BIO-RAD型PCR仪上进行, 取3 μ L扩增产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳检测, 委托生工生物工程(上海)股份有限公司测序。获得的序列利用Chromas编辑校正, 用Clustal W程序进行rDNA序列联配比较, 用DNAstar和Mega 6.0软件进行系统进化分析。

秀珍菇菇包发病时, 菇包处于菌丝生长阶段, 表现为袋口附近出现零星黄色水珠, 水珠黏度不大。随着病害向下扩展(一般可扩展至菇包的1/2左右), 黄色水珠黏度加大(图1)。病害通常导致菌丝长满菇包的时间延长7 d左右。发病菇包在菌丝长满, 进入出菇环节后, 经过消毒仍可长出子实体; 但随着子实体的增大, 菇体会出现大量黄色黏稠状水珠, 使菇体腐烂, 并使与之相邻的健康菇体发病。

图1

Fig.1

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	图1 被污染的菌包样品Fig.1 Polluted mushroom package samples

5个菇包共分离纯化出10个菌株, 这些菌株革兰氏染色反应均呈阴性, 菌体杆状, 具1~2根极生鞭毛, 能游动, 好氧, 不产生芽孢。在NA培养基上30 ℃培养24 h, 菌落半透明, 淡黄色, 表面略隆起, 边缘光滑, 圆形。在King's B培养基上可产生荧光素。培养3 d后的培养基伴有明显的腥臭味。

致病性测定结果表明, 在接种后第5~6天, 菇包开始发病, 有少量不黏稠的黄色水珠产生, 并伴有恶臭味。接种无菌水的对照菇包无明显变化。从接种发病的菇包上可分离获得与接种菌株相同的病原菌。

图2

Fig.2

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	图2 平板上培养的菌株形态及革兰氏染色结果 A, NA培养基上的菌株形态; B和C, 革兰氏染色反应。Fig.2 Characteristics of strains cultured on NA plate and gram staining reaction A, characteristics of strains cultured on NA plate; B and C, gram staining reaction.

MBT鉴定结果通过Biotyper软件进行分析, 最终结果为数据库中与样品最为匹配的几个细菌种属, 并给出相应的分数。分数介于2.300~3.000, 能完全可靠地鉴定到种的水平; 介于2.000~2.299, 能可靠地鉴定到属的水平或有可能鉴定到种的水平; 介于1.700~1.999, 有可能鉴定到属的水平; 介于0~1.699, 表示没有可信的鉴定结果。标准菌株的MBT鉴定结果与原鉴定完全一致, 分值为2.083。5个秀珍菇黄菇病分离菌代表菌株的MBT鉴定结果显示, 它们均被鉴定为P. putida, MBT分值在2.003~2.115, 接近或高于标准菌株, 具有较高的可信度(表1)。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 秀珍菇黄菇病病原的MBT和脂肪酸鉴定结果 Table 1 MBT and FAME identity of the pathogens causing yellow rot disease in Pleurotus geesteranus 菌株代号 Strain code 原鉴定结果 Original identity MBT鉴定MBT identification FAME鉴定FAME identification 鉴定结果Identity 相似性Similarity 鉴定结果Identity 相似性Similarity ATCC12633 P. putida P. putida 2.083 P. putida 0.623 ZJ-01 — P. putida 2.115 P. putida 0.809 ZJ-02 — P. putida 2.067 P. putida 0.852 ZJ-03 — P. putida 2.111 P. putida 0.869 ZJ-04 — P. putida 2.062 P. putida 0.811 ZJ-05 — P. putida 2.003 P. putida 0.848

表1 秀珍菇黄菇病病原的MBT和脂肪酸鉴定结果 Table 1 MBT and FAME identity of the pathogens causing yellow rot disease in Pleurotus geesteranus

FAME鉴定结果匹配程度遵循Buyer等^[9]的原则:相似性系数< 0.2, 结果不可用; 相似性系数≥ 0.2, 可鉴定到属; 相似性系数≥ 0.5, 可鉴定到种。标准菌株的FAME鉴定结果与原鉴定完全一致, FAME相似性为0.623。5个代表菌株的FAME鉴定结果表明, 他们均属于P. putida, FAME的相似性介于0.809~0.869, 均高于标准菌株(表1), 且FAME鉴定结果与MBT鉴定结果完全一致。

分离获得的5个黄菇病菌代表菌株经PCR扩增均得到一条约1.5 kb条带(图3)。所得条带经序列测定后与GenBank中相近种进行blast比对并构建系统发育树, 结果(图4)显示:5个代表菌株ZJ-01、ZJ-02、ZJ-03、ZJ-04和ZJ-05与P. putida标准菌株在系统发育树中聚在同一分支上, 且与GenBank中已登录的P. putida序列亲缘关系最近, 在系统发育树中聚在同一分支上。

图3

Fig.3

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	图3 五个代表菌株16S rRNA电泳图 M, DL 2 000 DNA分子量标准; 1~5, 为5个代表菌株。Fig.3 Electrophoresis of 16S rRNA region PCR products of 5 typical strains M, DL 2 000 DNA marker; 1-5: 5 typical strains.

图4

Fig.4

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	图4 基于16S rRNA的5个代表菌株系统发育树 ●代表数据来自标准菌株; ★代表数据来自本研究; ◆代表数据来自GenBank。Fig.4 Neighbor-joining tree constructed from the 16S rRNA sequences of 5 typical strains of Pseudomonas putida ● shows data got from standard strain; ★ shows data got from this study; ◆ shows data got from GenBank.