1.1.1 菌株和质粒

加纳链霉菌(Streptomyces ghanaensis)ATCC 14672、大肠埃希菌(Escherichia coli)DH5α 、E. coli ET12567(pUZ8002)均由本实验室保藏。质粒pMD-19购自TaKaRa公司。质粒pIJ8630由浙江大学李永泉教授惠赠。质粒pIJ8630-nsdA在pIJ8630的基础上构建。

1.1.2 酶和试剂

安普霉素(Apr)、硫链丝菌素(Tsr)、链霉素(Str)、卡那霉素(Km)、氯霉素(Cm)、氨苄西林(Amp)、萘啶酸(NA), 购自生工生物工程(上海)股份有限公司; rTaq、XbaⅠ 限制性内切酶、T4 DNA连接酶、DNA分子量标准物均购自TaKaRa公司; FastAP购自Thermo公司。

1.1.3 培养基

大肠埃希菌培养基为2× YT^[4]; 加纳链霉菌液体培养基为TSB, 固体培养基为YMS、2CMY、MM、AS-1、MS、改良高氏一号(简称RG)和TSB固体, 配方参见文献[5, 6]。接合转移培养基WL50(g· L^-1):可溶性淀粉5, 氯化钠2.5, 硫酸镁3.6, 氯化镁4.8, 酵母浸出粉1, 丙氨酸0.2, 精氨酸0.2, 天冬酰胺0.5, 琼脂20, pH值7.5(灭菌前), 115 ℃灭菌30 min。

1.2.1 基本遗传操作

加纳链霉菌ATCC 14672的培养方法参见文献[7]。大肠埃希菌培养方法、感受态的制备及DNA转化方法参照《分子克隆实验指南》^[4]。加纳链霉菌总DNA的提取方法和接合转移频率的计算方法参照《链霉菌遗传操作手册》^[5]。

1.2.2 重组质粒pIJ8630-nsdA构建

以加纳链霉菌ATCC 14672基因组为模板, 采用特异性引物nsdA-F: 5’ -GGGCTCTAGAGTGAGCGGCAACGGCGG-3’ 和nsdA-R: 5’ -CCAATCTAGATGGCATGGGGGAGCCGAG-3’ (下划线为Xba Ⅰ 酶切位点), PCR扩增长度1 590 bp的nsdA基因。进行TA克隆, 转化E. coli DH5α , 经测序验证后提取质粒, XbaⅠ 酶切回收nsdA基因片段。经XbaⅠ 单酶切、去磷酸化后的pIJ8630线性质粒用T4 DNA连接酶与nsdA基因片段连接, 转化E. coli DH5α , PCR验证Apr抗性平板上的阳性克隆。转化子送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。检测引物序列为:CK-F, 5’ -CGACTCGGCTCCCCCATGCC-3’ ; CK-R, 5’ -AACGCCAGCAAC GCGGCC-3’ 。

1.2.3 重组质粒pIJ8630-nsdA转化E. coli ET12567(pUZ8002)

将重组质粒pIJ8630-nsdA转化到E. coli ET12567(pUZ8002)感受态细胞中, 利用Apr、Cm、Km抗性平板筛选抗性菌落, 再以特异性引物PCR进行转化子的验证。转化子检测引物序列同1.2.2节。

1.2.4 E. coli ET12567(pUZ8002, pIJ8630-nsdA)与加纳链霉菌ATCC 14672的接合转移

挑取E. coli ET12567(pUZ8002、pIJ8630-nsdA)新鲜单菌落, 接种于5 mL 2× YT液体培养基(含50 μ g· mL^-1 Apr、25 μ g· mL^-1 Cm、25 μ g· mL^-1 Km)中, 37 ℃、200 r· min^-1培养过夜, 按1∶ 100的比例转接到含相同抗生素的50 mL 2× YT液体培养基中, 相同条件培养至对数生长期收集菌体, 洗涤2次后悬浮备用。

在加纳链霉菌平板上加入适量2× YT液体培养基, 制备孢子悬液, 振荡充分打散孢子, 过滤, 孢子悬浮液浓度控制在10⁸ cfu· mL^-1。50 ℃热激10 min, 37 ℃振荡预培养3 h, 备用。取500 μ L备用的E. coli ET12567菌悬液与500 μ L加纳链霉菌孢子滤液混合, 4 000 r· min^-1离心5 min, 弃去大部分上清, 用残留液悬浮菌体后涂布于含10 mmol· L^-1 MgCl₂的接合转移平板, 于30 ℃培养14 h后用抗生素水溶液(含50 μ g· mL^-1Apr、500 μ g· mL^-1 NA)洗去大肠埃希菌, 然后取1 mL抗生素水溶液覆盖平板, 30 ℃继续培养2~3 d长出接合子。用接合子数/初始孢子数表示接合转移频率^[5]。

1.2.5 接合子的PCR验证

取适量接合子菌丝体到含有50 μ g· mL^-1Apr的TSB液体培养基中培养24 h, 收集菌丝体, 提取链霉菌总DNA为模板。根据质粒pIJ8630-nsdA上的Apr抗性基因aac(3)IV来设计引物, 验证阳性接合子。PCR反应程序:95 ℃ 5 min; 95 ℃ 1 min, 58 ℃ 1 min, 72 ℃ 50 s, 30个循环; 72 ℃延伸10 min。引物序列:Apr-F, 5’ -TCTTCGCATCCCGCCTCTGG-3’ ; Apr-R, 5’ -GCAATACGAATGGCGAAAAG-3’ 。

nsdA基因保守存在于多种链霉菌中, 对链霉菌产孢、形态分化, 以及抗生素合成均有负调控作用^[8]。为研究接合转移条件, 构建nsdA基因过表达质粒pIJ8630-nsdA, 其图谱见图1。pIJ8630-nsdA的酶切鉴定结果如图2所示, 泳道1表明该质粒经Xba I单酶切, 得到7.9 kb大小的空载片段与1 590 bp的nsdA基因全长条带, 与预期相符。将pIJ8630-nsdA转化到E. coli ET12567(pUZ8002)中, 并利用特异性引物CK-F、CK-R进行PCR验证。将验证正确的转化子E. coli ET12567(pUZ8002, pIJ8630-nsdA)作为接合转移的供体菌。

图1

Fig.1

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	图1 质粒pIJ8630-nsdA图谱Fig.1 Map of plasmid pIJ8630-nsdA

图2

Fig.2

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	图2 重组质粒pIJ8630-nsdA的酶切鉴定 M, DL 1 5000 DNA marker(分子标记); 1, pIJ8630-nsdA/Xba I; 2, pIJ8630-nsdA。Fig.2 Restriction endonuclease identification of recombination plasmid pIJ8630-nsdA

在以链霉菌孢子为受体的接合转移中, 孢子的数量直接决定着接合频率。将浓度约为10⁸ cfu· mL^-1的加纳链霉菌孢子液等量分别均匀地涂布在YMS、2CMY、AS-1、MS、RG、TSB和MM培养基上, 30 ℃培养7 d。加纳链霉菌在YMS、2CMY、AS-1这3种培养基上菌苔厚实且孢子致密, 其中, 在2CMY培养基上孢子量最大; 在MM培养基上菌苔稀薄; 在MS、RG、TSB培养基上菌体生长速度快、菌苔厚实, 但产孢量少。综上, 选定2CMY培养基用于加纳链霉菌产生孢子。

为选择大肠埃希菌-加纳链霉菌接合转移系统的抗性标记、确定合适的抗生素筛选浓度, 考查加纳链霉菌对4种在链霉菌接合转移中常用抗生素的敏感性。结果表明, 该菌对安普霉素、硫链丝菌素、链霉素均非常敏感, 当浓度为12.5 μ g· mL^-1时即可完全抑制菌体生长, 而卡那霉素则需在25 μ g· mL^-1的浓度下才能抑制加纳链霉菌的生长。确定以安普霉素基因aac(3)IV为筛选标记。

2.4.1 加纳链霉菌接合转移培养基

一种适合接合转移的培养基应该同时满足大肠埃希菌和链霉菌生长, 并且使两者生长速度均衡又有利于观察接合子。本研究以加纳链霉菌孢子为受体菌、E. coli ET12567为供体菌, 依据加纳链霉菌在不同培养基上的生长速度, 同时参考其他链霉菌的最适接合培养基, 选择2CMY、MS、AS-1、RG、TSB的固体培养基进行接合转移效果比较。结果显示, 在AS-1、MS、TSB固体培养基上接合子生长良好, 且速度快, 其中, AS-1接合平板的接合频率最高(图3), 所以选择AS-1为大肠埃希菌-加纳链霉菌接合转移培养基。

图3

Fig.3

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	图3 不同基础培养基对接合转移频率的影响Fig.3 Effect of different basal media on conjugation frequency

Mg²⁺是众多蛋白酶的辅因子, 参与酶活性中心的形成。Choi等^[9]研究表明, 增加Mg²⁺浓度能显著提高接合转移频率。AS-1培养基中含有83 mmol· L^-1 MgSO₄。试验表明, 在30~150 mmol· L^-1范围内MgSO₄浓度的改变对接合转移频率没有显著影响。Mg²⁺除了来源于MgSO₄, 还来源于MgCl₂。在标准的链霉菌接合转移方法中, MgCl₂以10 mmol· L^-1的浓度加入接合转移培养基。本试验将AS-1培养基中MgSO₄浓度调整为30 mmol· L^-1后, 再向其中添加不同浓度的MgCl₂(0、10、20、40、50 mmol· L^-1)作为接合培养基。结果(图4)表明, 接合转移频率随着MgCl₂浓度的提高而提高。将接合转移频率最高的培养基配方命名为WL50。

图4

Fig.4

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	图4 接合转移培养基中MgCl2浓度对接合转移频率的影响Fig.4 Effect of MgCl2 concentration in conjugational transfer media on conjugation frequency

2.4.2 加纳链霉菌孢子预萌发条件

热激处理的目的是为了促进孢子萌发。过高的温度会使孢子存活率降低, 过低的温度又起不到促进孢子萌发的作用。常规的链霉菌接合转移过程中的热激条件为50 ℃、10 min。为了确定加纳链霉菌孢子萌发的最适热激温度和处理时间, 设定40、45、50、55 ℃共4个温度, 每个温度选择5、10、15、20 min 4个时间梯度进行接合试验。结果(图5)表明, 50 ℃、5 min为最佳的加纳链霉菌孢子热激条件。

图5

Fig.5

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	图5 不同孢子热激条件对接合转移频率的影响Fig.5 Effect of different spore heat treatment on conjugation frequency

热激后的预培养处理有助于提高孢子的萌发频率, 从而提高接合频率; 但预培养时间过长会造成芽管萌发过长, 受体聚集成团, 出现多核细胞, 难以获得单菌落, 造成接合转移假阳性率增高。为了研究不同预培养时间对接合转移的影响, 将孢子50 ℃热激10 min后, 进行37 ℃预培养, 以0.5 h为间隔取样镜检。从图6可以看出, 预培养1.5 h时, 由于孢子萌发, 部分孢子体积开始膨大, 细胞内氧化还原酶系开始活跃, 美兰着色变浅, 菌体呈空心圆形。随着预培养时间延长, 体积变大的孢子数占比增大。3.0 h以后, 大部分孢子美兰不着色, 呈现空心状。到3.5 h时, 有少量菌丝出现, 孢子容易被菌丝缠绕而聚集。

图6

Fig.6

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	图6 不同预培养时间下孢子形态观察Fig.6 Spore morphology at different pre-incubation times

取不同时间预培养的孢子为受体进行接合转移, 结果(图7)显示, 在孢子预培养1.5~3.5 h期间, 接合转移频率差别并不大, 预培养3.0 h频率相对较高。

图7

Fig.7

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	图7 孢子预培养时间对接合转移频率的影响Fig.7 Effect of pore pre-incubation time on conjugation frequency

2.4.3 接合转移体系中供体菌和受体菌的比例

不同链霉菌的生理特性不同, 因此, 在接合转移过程中所需的最适供体菌与受体菌比例存在差异。为了探索大肠埃希菌-加纳链霉菌接合转移体系的最佳供受体比例, 限定受体菌的数量为10⁸, 将供体菌与受体菌细胞数分别以1∶ 100、1∶ 10、1∶ 5、1∶ 1、5∶ 1、10∶ 1的比例混合, 进行接合转移试验。依据图8的结果, 选定10∶ 1作为最佳的供受体比例。

图8

Fig.8

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	图8 供受比对接合转移频率的影响Fig.8 Effect of ratio of donor to recipient on conjugation frequency

2.4.4 接合转移过程中安普霉素的添加时间

由于链霉菌在接合转移培养基上生长速度存在差异, 因此, 抗生素添加时间对接合转移频率及接合子的有效检出就会产生影响。对加纳链霉菌接合转移过程中安普霉素添加时间进行研究, 结果(图9)显示, 涂板后培养14 h时添加安普霉素效果最佳。

图9

Fig.9

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	图9 安普霉素添加时间对接合转移频率的影响Fig.9 Effect of apramycin addition time on conjugation frequency

基于单因素试验结果, 选取对大肠埃希菌-加纳链霉菌接合转移频率有较大影响的因素(A, MgCl₂浓度; B, 热激时间; C, 供受比), 进行大肠埃希菌-加纳链霉菌接合转移试验, 每因素分别设置3个水平:A1, 30 mmol· L^-1, A2, 50 mmol· L^-1, A3, 80 mmol· L^-1; B1, 5 min, B2, 10 min, B3, 15 min; C1, 5∶ 1, C2, 10∶ 1, C3, 15∶ 1。从正交试验结果(表1)看出, 各因素对接合转移频率的影响为供受比> MgCl₂浓度> 热激时间。理论最优水平组合为A₂B₃C₃, 实际最优水平组合为A₂B₂C₃。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 正交试验结果与数据分析 Table 1 Results and data analysis of orthogonal test 试验序号 Test No. A B C 接合转移频率 Conjugation frequency/10-6 1 1 1 1 4.99 2 1 2 2 4.90 3 1 3 3 9.71 4 2 1 2 9.99 5 2 2 3 11.2 6 2 3 1 6.03 7 3 1 3 8.49 8 3 2 1 4.39 9 3 3 2 7.78 K1 6.533× 10-6 7.823× 10-6 5.137× 10-6 K2 9.073× 10-6 6.830× 10-6 7.557× 10-6 K3 6.887× 10-6 7.840× 10-6 9.800× 10-6 R 2.540× 10-6 1.010× 10-6 4.663× 10-6

表1 正交试验结果与数据分析 Table 1 Results and data analysis of orthogonal test

对正交试验结果进行检验, 结果表明, 实际最优组合A₂B₂C₃与理论最优组合A₂B₃C₃的接合转移频率相近, 与未优化接合转移条件相比, 接合频率提高了20.3倍。

以E. coli ET12567为供体, 加纳链霉菌孢子为受体, 进行接合转移试验。质粒pIJ8630-nsdA含有安普霉素抗性基因aac(3)IV和attP位点, 属于整合型质粒, 可以整合到链霉菌基因组attB位点上, 并随基因组的复制而复制。经安普霉素平板筛选得到抗性菌落, 分离纯化后, 随机挑选9株接合子, 分别提取其总DNA, 使用特异性引物Apr-F、Apr-R扩增aac(3)IV内部744 bp序列。接合转移转化子的PCR验证结果如图10所示, 以pIJ8630-nsdA质粒DNA(阳性对照)和9株接合子DNA为模板, 均能扩增出预期片段(744 bp), 而以出发株加纳链霉菌ATCC 14672总DNA为模板(阴性对照)则没有条带, 说明质粒pIJ8630-nsdA成功接合转移进入加纳链霉菌。

图10

Fig.10

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	图10 S. ghanaensis (pIJ8630-nsdA)接合转移转化子PCR产物电泳检测图 M, DL 2 000 DNA分子标记; 1, 阳性对照; 2~10, 接合转移转化子; 11, 阴性对照。Fig.10 Electrophoresis analysis of PCR products of S. ghanaensis (pIJ8630-nsdA) exconjugants M, DL 2 000 DNA marker; 1, Positive control; 2-10, Exconjugants; 11, Negative control.