根腐病黄精植株采集于湖南省怀化洪江市黄精种植基地, 健壮的野生黄精植株采集于雪峰山区。

培养基:马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)、牛肉膏蛋白胨培养基(NA)和LB培养基^[9]。

1.2.1 黄精内生细菌的分离

用流水清洗健壮的黄精植株块茎表面的泥土残渍, 晾干水分。将黄精块茎放入75%乙醇中处理3 min, 无菌水冲去残留的乙醇; 再置于0.1%升汞溶液中浸泡1 min, 无菌水冲去残留的升汞溶液, 沥去水分。在无菌条件下, 将处理过的块茎磨成匀浆, 用无菌生理盐水稀释10倍后涂布于NA培养基上, 28 ℃培养2~5 d。待培养基上长出可见菌落时, 及时挑取菌落, 在LB培养基平板上多次划线分离, 获得纯培养物。

表面消毒效果的检查:取最后一遍冲洗黄精块茎的无菌水, 涂布于NA培养基上, 37 ℃下培养2 d后无菌落长出, 表明消毒彻底, 样品表面已无附生菌。

1.2.2 黄精根腐病菌株的分离

参考檀国印等^[7]报道的方法, 分离黄精根腐病菌株。

1.2.3 平板对峙检测

按宋光桃等^[4]的方法, 在PDA平板中央接种直径6 mm的黄精根腐病分离菌菌饼, 在距离菌饼2.5 cm处点种分离的内生细菌, 每皿接1株内生细菌, 重复3次, 以不接内生菌为对照。于25 ℃恒温箱中培养, 当对照中的根腐病分离菌长至培养皿边缘时, 测量内生菌的抑菌圈直径。

1.3.1 内生细菌和根腐菌的形态学鉴定

按照沈萍等^[9]的方法, 无菌条件下, 将根腐菌点接于PDA培养基平板上, 于25 ℃培养3~5 d。取一滴乳酸石碳酸棉兰染液滴于载玻片上, 用镊子取培养物少许, 在50%乙醇中浸一下以除去脱落的孢子, 然后将培养物置于载玻片上的染液中, 用大头针小心地将菌丝分开, 加盖玻片, 显微镜下观察根腐菌菌丝体及孢子形态。

将内生细菌培养物置于LB平板培养基上, 28 ℃培养24 h后进行革兰氏染色和芽胞染色, 在显微镜下观察菌体形态、大小、芽胞形状和着生部位; 将内生细菌培养物置于28 ℃培养48 h后观察菌落形态。参照何红等^[5]的方法进行菌株的生理生化试验。

1.3.2 根腐病分离菌株的分子生物学鉴定

按照文献[10]报道的方法收集黄精根腐病分离菌的菌丝体并提取其DNA。选用真菌rDNA内转录区(ITS)扩增的通用引物ITS5(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'), PCR扩增分离菌的ITS区段。反应体系如下: 1 μ L dNTP(2.5 mmol· L^-1), 0.2 μ L Taq 酶(5 U· μ L^-1), 2.5 μ L 10× PCR缓冲液, 0.5 μ L引物ITS4(10 μ mol· L^-1), 0.5 μ L引物ITS5(10 μ mol· L^-1), 0.5 μ L(约20 ng· μ L^-1)基因组DNA, 加ddH₂O至25 μ L。扩增程序为:94 ℃预变性3 min; 94 ℃变性30 s, 53 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 min, 30个循环; 72 ℃延伸6 min, 4 ℃保存。反应完成后, 取PCR产物进行凝胶电泳检测。切胶回收目标条带, 由擎科生物技术(长沙)有限公司完成测序工作。

翻译延伸因子EF-1a序列常用来鉴定镰刀菌属真菌^[11], 且EF-1a在物种鉴定方面有高分辨能力, 较以往的ITS序列有较多的种间变异, 适于作为系统进化研究的遗传标记^{[11, 12]}。选用镰刀菌EF-1a扩增的通用引物EF-1(5'-ATGGGTAAGGARGACAAGAC-3')和 EF-2(5'-GGARGTACCAGTSATCATGTT-3')对延伸因子EF-1a区进行扩增。所用引物反应在 25 μ L体系中进行, 各组分如下:1 μ L dNTP(2.5 mmol· L^-1), 0.2 μ L Taq酶(5 U· μ L^-1), 2.5 μ L 10× PCR缓冲液, 0.5 μ L引物EF-1(10 μ mol· L^-1), 0.5 μ L引物EF-2(10 μ mol· L^-1), 1.0 μ L(约20 ng· μ L^-1)基因组DNA, 加ddH₂O至25 μ L。扩增程序为:94 ℃预变性3 min; 94 ℃变性30 s, 51 ℃退火30 s, 72 ℃延伸1 min, 32个循环; 72 ℃延伸6 min, 4 ℃保存。反应完成后, 取PCR产物进行凝胶电泳检测。切胶回收目标条带, 由擎科生物技术(长沙)有限公司完成测序工作。利用Clustal X程序, 将黄精根腐病分离菌的EF-1a序列与GenBank EF-1a序列进行同源性比较, 确定该分离菌的分类地位。最后采用邻位加入法(neighbor-joining, NJ)构建基于EF-1a序列的黄精根腐病分离菌株和同属真菌的系统发育树, 选择Bootstrap method测试法, 1 000次重复, Kimura 2-parameter模型, 其他参数为默认设置。

1.3.3 内生细菌的分子生物学鉴定

对内生细菌的16S rRNA进行PCR扩增, 引物为27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1541R(5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3')。反应体系如下:基因组DNA模板1 μ L, 引物各1 μ L, Taq酶0.25 μ L, dNTP(2.5 mmol· L^-1)4 μ L, 10× PCR缓冲液2.5 μ L, MgCl₂ 4 μ L, 加ddH₂O至25 μ L。PCR反应条件:94 ℃预变性3 min; 94 ℃变性30 s, 52 ℃退火1 min, 72 ℃延伸1.5 min, 30个循环; 72 ℃延伸10 min; 4 ℃保存。取PCR产物进行凝胶电泳检测。切胶回收目标条带, 测序工作由擎科生物技术(长沙)有限公司完成。将测序结果与NCBI数据库中微生物16S rDNA序列进行BLAST比对, 以确定菌种分类。

将黄精根腐病菌株中获得的分离菌编号为HF2。HF2菌株在PDA上生长较快, 5 d可长满直径90 mm的培养皿。菌落圆形, 气生菌丝呈白色, 绒状, 茂密, 有分枝, 培养后期菌落背面产生色素, 培养皿背面呈紫黑色(图1-a、b); 分生孢子在气生菌丝分枝的梗上形成, 单孢有隔、卵形, 直或稍弯, 顶端稍尖, 基部钝, 大小(5.7~8.6) μ m× (1.3~1.9) μ m; 厚垣孢子球形, 插生于菌丝体间, 单顶生或串生, 大小(4.8~11.9) μ m× (5.7~12.4) μ m(图1-c、d)。

图1

Fig.1

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	图1 黄精根腐病菌株的菌落和分生孢子形态 a、b, PDA培养基上生长5 d的HF2菌丝; c, HF2菌株的菌丝和分生孢子(400× ); d, HF2菌株的菌丝和厚垣孢子(400× )。Fig.1 Colonies and conidiospores of strain HF2 isolated from Polygonatum sibiricum root rot a and b, The culture of strain HF2 grown on PDA medium for 5 days; c, Micrograph of mycelia and conidiospores of strain HF2 (400× ); d, Micrograph of mycelia and chlamydospores of strain HF2 (400× ).

用引物ITS4和ITS5对HF2的ITS区段进行PCR扩增, 获得长约为579 bp的DNA片段。将比较排列后的序列提交到GenBank中, 获得序列登录号(MH001545), 将该序列与核酸数据库BLAST比对, 显示该菌株与GenBank中已登录的尖孢镰刀菌(F. oxysporum)序列的同源性为99%, 从而在分子水平上证明分离获得的菌株为Fusarium sp.。为了进一步鉴定该分离菌, 对其EF-1a延伸因子的基因序列进行分析, 片段大小为685 bp, 提交到GenBank中, 获得序列登录号(MH006685), 其序列与GenBank数据库中其他F. oxysporum 的EF-1a延伸因子序列相似性为100%(图2)。

图2

Fig.2

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图2 NJ法构建的基于EF-1a序列的HF2菌株和其他镰刀菌的系统发育树Fig.2 Phylogenetic dendrogram of isolate HF2 and other isolates of Fusarium spp. constructed by using neighbor-joining (NJ) method based on EF-1a sequences

从系统进化树可以看出, 系统发育树可分为两个主要分支。第一支又分为两大类群, 其中一类由本种HF2菌株、Fusarium oxysporum、F. verticillioides、F. incarnatum构成; 另一类由F.globosum、F. proliferatum构成。第二支由F. equiseti、F. solani、F. subglutinans、F. gaditjirri、F. thapsinum构成。本种与已报道的F. oxysporum以99%的相似度聚类在一起, 而Fusarium属的F. equiseti、F. solani、F. subglutinans、F. gaditjirri、F. thapsinum则以较远的亲缘关系处于系统发育树的外围。

从健壮野生黄精中筛选获得了40株内生细菌, 以黄精根腐病分离菌HF2为目标菌, 用对峙生长法测试了这40株内生细菌对HF2的抑制作用。结果显示, A3、A6、A7、A8、A11、A12、A17、B8、C5和C8这10株内生细菌对HF2具有较强的抑制作用, 其中抑菌圈大于 10 mm的有 4株, 分别为A6、A8、A11、A17(表1)。这10株菌株多为乳白色, 菌落不透明, 边缘不整齐。不同菌株对HF2的抑菌效果不同, 除A12、B8、C8无显著差异外, 其他各菌株均存在显著差异, 其中菌株A8的抑菌效果最好。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 内生细菌在NA培养基上的菌落特征及抑菌效果 Table 1 Colony characteristics of antagonistic endophytic bacteria on the NA medium and their bacteriostatic effect 菌株 Strain 来源 Source 菌落特征 Colony characteristic 抑菌圈半径 Radius of inhibition zone/cm A3 块茎 Root-tuber 污白色, 表面粗糙, 不整齐, 不透明 Tan-white, rough surface, not neat, opaque 0.97 ± 0.06 A6 块茎 Root-tuber 污白色, 表面粗糙, 不整齐, 不透明 Tan-white, rough surface, not neat, opaque 1.17 ± 0.08 A7 块茎 Root-tuber 粉白色, 初期水泡样, 后期水泡塌陷, 褶皱凸起 Pinkish-white, initial blister-like, blisters collapse in late stage, pleats 0.93 ± 0.06 A8 块茎 Root-tuber 乳白色, 表面粗糙, 不整齐, 不透明 Milkiness, rough surface, not neat, opaque 1.30± 0.09 A11 块茎 Root-tuber 污白色, 表面粗糙, 不规则褶皱, 不整齐, 不透明 Tan-white, rough surface, pleats, not neat, opaque 1.20 ± 0.09 A12 块茎 Root-tuber 乳白色, 表面粗糙, 不整齐, 不透明 rough surface, not neat, opaque 0.87 ± 0.05 A17 块茎 Root-tuber 乳白色, 表面粗糙, 不整齐, 中央圆形褶皱凸起, 不透明 Milkiness, rough surface, not neat, Central round pleat bulge, opaque 1.03 ± 0.09 B8 茎 Stem 白色, 表面粗糙, 不整齐, 不透明 White, rough surface, not neat, opaque 0.90 ± 0.09 C5 叶 Leaf 乳白色, 表面粗糙, 不整齐, 不透明 Milkiness, rough surface, not neat, opaque 0.97 ± 0.07 C8 叶 Leaf 污白色, 表面粗糙, 不整齐, 不透明 Tan-white, rough surface, not neat, opaque 0.87 ± 0.08

表1 内生细菌在NA培养基上的菌落特征及抑菌效果 Table 1 Colony characteristics of antagonistic endophytic bacteria on the NA medium and their bacteriostatic effect

在LB琼脂平板上, A8菌落表面粗糙不规则, 边缘扩散状, 不透明, 污白色, 易挑起, 不分泌色素, 见图3-a。培养24 h的菌体呈柱状, 大小为1.1 μ m× 3.2 μ m, 革兰氏染色为阳性, 芽孢中生, 椭圆形, 见图3-b。淀粉水解试验、葡萄糖发酵试验、接触酶试验、明胶液化试验和油脂水解试验都为阳性, 甲基红反应和乙酰甲基甲醇试验(V.P.试验)为阴性, 初步鉴定该菌株为芽孢杆菌Bacillus sp.。

图3

Fig.3

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	图3 菌株A8的菌落形态、显微摄影图和对HF2的抑制作用 a, 菌株A8的菌落形态图; b, 菌株A8的显微摄影图(10× 100); c, HF2受A8抑制的菌落形态。Fig.3 Colonial morphology, microphotograph and inhibitory effect on HF2 of strain A8 a, The colonial morphology of strain A8; b, Microphotograph of strain A8; c, Colony of strain HF2 inhibited by strain A8 in culture plate.

平板对峙实验如图3-c所示, A8对黄精根腐分离菌(F. oxysporum)HF2的生长有明显抑制作用, 可以产生明显的抑菌带, A8菌落边缘的HF2菌丝生长缓慢, 正常生长的HF2菌丝呈圆形扩展。

对10株内生细菌(A3、A6、A7、A8、A11、A12、A17、B8、C5和C8)的16S rRNA序列进行PCR扩增, 序列经过Clustal X比较排列后, 提交到GenBank中, 获得序列登录号分别为MF509844、MF509831、MF509832、MF509847、MF509833、MF509834、MF509837、MF509839、MF509843、MF509845。将该序列与核酸数据库BLAST比对, 显示A6、A11、A12、A8、A7、C5、A17、A3、B8菌株与Bacillus sp.多个菌株的序列相似性均为99%, 确定这些菌株为Bacillus sp.。C8与Herbaspirillum sp.多个菌株的序列相似性为98%, 确定该菌为草螺菌属(Herbaspirillum sp.)。其中对黄精根腐病菌具有高抑菌活性的内生菌株A8, 综合其菌落形态特征、染色结果和16S rDNA序列比对分析结果, 确定该菌株为Bacillus subtilis。

图4

Fig.4

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	图4 NJ法构建的基于16S rDNA序列的内生细菌的系统发育树Fig.4 Phylogenetic dendrogram of endophytic bacteria constructed by using neighbor-joining (NJ) method based on 16S rDNA sequences