1.1.1 材料

产QNs抗体的杂交瘤细胞株(实验室自制), 株号5H1E9E8D7H12, 简称QH12, 中国典型培养物保藏中心保藏编号CCTCC No.C2015118, 专利申请号201510990139.X。水产样品来自浙江省内各个养殖场, 取鱼、虾、鳖等可食部分约100 g, 用组织捣碎机充分绞碎混匀, -18 ℃冷冻避光保存。

1.1.2 试剂

RPMI 1640培养基, GIBCO; 胎牛血清(FBS), GIBCO; 1307镀剂、氯金酸(纯度99.99%)、胶体金垫和NC膜, 上海捷宁公司。实验用水为超纯水。金标抗体保存液:0.02 mol· L^-1 Tris-HCl缓冲液(pH 8.7, 含0.2% PEG20000、1%BSA和3%海藻糖, 现配现用)。喹诺酮类药物标准物质:氟甲喹(flumequine, Flu), 诺氟沙星(norfloxacin, Nor), 依诺沙星(enoxacin, Eno), 环丙沙星(ciprofloxacin, Cip), 培氟沙星(pefloxacin, Pef), 洛美沙星(lomefloxacin, Lom), 达氟沙星(danofloxacin, Dan), 恩诺沙星(enrofloxacin, Enr), 氧氟沙星(ofloxacin, Ofl), 麻保沙星(marbofloxacin, Mar), 沙拉沙星(sarafloxacin, Sar), 二氟沙星(difloxacin, Dif), 均为德国Dr.Ehrenstorfer公司生产的纯品型有证标准品。乙腈、甲醇、正己烷均为色谱纯, 其他试剂均为分析纯。

1.1.3 仪器与设备

二氧化碳培养箱, Thermo 3111, 美国; 酶标仪, Tecan Infinite M1000, 瑞士; 紫外-可见分光光度计, 岛津UV3550, 日本; 三维喷点平台, BIODOT 3210, 美国; 空气吹干机, 定制; 高效液相色谱仪/HPLC, Waters e2695, 美国; 超高效液相串联质谱仪/UPLC-MS/MS, Waters TQ-S, 美国。

1.2.1 体外抗体制备

将QH12杂交瘤细胞株复苏, 加入适量RPMI 1640培养基(含10% FBS), 在37 ℃、5% CO₂条件下培养。更换培养基时, 收集旧培养基, 取少量用ELISA方法检测抗体灵敏度, 其余的培养基中立即加入等体积的饱和硫酸铵, 摇匀后, 4 ℃静置2~16 h。10 000 g离心30 min, 弃上清, 向沉淀中慢慢加入0.02 mol· L^-1(pH 7.2)的PBS, 并搅拌至沉淀完全溶解, 10 000 g离心30 min, 留上清液, 用40%饱和硫酸铵沉淀, 获初步纯化的抗体。再用PBS复溶, 用紫外-可见分光光度计测定280 nm处的吸光值, 并对照标准曲线计算蛋白质浓度, 分装后, -86 ℃冻存。取部分抗体用Protein G法进一步纯化, 冷冻干燥后, -20 ℃保存备用。

1.2.2 免疫胶体金试剂条研制

(1)胶体金制备。取6个250 mL三角瓶, 预先用硫酸-重铬酸钾洗液浸泡过夜, 冲洗干净后, 烘干, 备用。实验组(编号①~③)以2 mL 1307镀剂涂抹内壁, 倒出多余液体, 倒置, 60 ℃烘干; 对照组(编号④~⑥)未用1307镀剂处理。每个三角瓶各加100 mL水, 加入0.1%氯金酸水溶液1 mL, 在磁力搅拌器上加热至冒泡, 加入1 mL 1%柠檬酸三钠水溶液, 保持微沸15 min, 冷却后, 4 ℃保存过夜。取3 mL胶体金溶液, 在紫外-可见分光光度计上进行200~800 nm光谱扫描, 测定吸收峰波长和吸收值。

(2)胶体金标记。将冻干抗体用0.01 mol· L^-1的PB缓冲液(pH 7.4)配制成0.5 mg· mL^-1的溶液, 20 000 g离心60 min, 去除蛋白聚合物。将100 mL胶体金用0.1 mol· L^-1 Tris-HCl调节pH至8.7。在6支小试管中各加1 mL胶体金, 分别按表1所列的抗体量进行预标记, 每管加10 μ g BSA结合未标记的胶体金。将2 μ L金标抗体溶液滴在装空白胶体金垫的试剂条上, 分别测试加PBS或5 ng· mL^-1 Cip后T线(检测线)和C线(质控线)的显色情况和抑制效果。取60 mL胶体金, 以最佳抗体量进行标记, 15 000 g离心30 min, 弃上清液, 保留底部紫红色的金标抗体, 加入3 mL金标抗体保存液使其复溶, 4 ℃保存过夜。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 胶体金标记抗体预试验显色情况 Table 1 Color rendering of colloidal gold labelled antibody in preliminary experiment 抗体浓度 Antibody concentration/(μ g· mL-1) PBS Cip 抑制 Inhibition T线显色 Color of T line C线显色 Color of C line T线显色 Color of T line C线显色 Color of C line 0.5 * — — — S 1.0 * * — — * * S 2.0 * * * * * — * * * S 3.0 * * * * * * * * * * * W 4.0 * * * * * * * * * * * * — 5.0 * * * * * * * * * * * * — * , Light red; * * , Red; * * * , Purple red; S, Strong inhibition; W, Weak inhibition; — , Colorless or no inhibition. * , 浅红色; * * , 红色; * * * , 深红色; S, 强抑制作用; W, 弱抑制作用; — , 无色或无抑制作用。

表1 胶体金标记抗体预试验显色情况 Table 1 Color rendering of colloidal gold labelled antibody in preliminary experiment

(3)试剂条制备。用三维喷点平台将金标抗体喷在胶体金垫上, 37 ℃烘干, 与T线和C线分别喷有抗原(实验室人工合成的Cip-BSA)和二抗(羊抗鼠)的NC膜一起组装成免疫胶体金测向层析试剂条, 加塑料卡后, 称其为试剂板, 并以铝箔袋单个包装。

(4)检出限测试。以0.02 mol· L^-1(pH 7.2)的PBS分别配制0.5~100 ng· mL^-1的环丙沙星、洛美沙星、诺氟沙星、氧氟沙星和培氟沙星标准溶液。从铝箔袋中取出试剂板, 平放, 每个试剂条加3滴标准溶液(简称为“ 滴板” ), 3~5 min内观察显色结果。定性判定原则:T线比C线浅为阳性; T线比C线深或一样深浅为阴性。以肉眼可识别出色差的最少浓度为该药物的最低检出限(LOD)。以同样的方法测试恩诺沙星、沙拉沙星等其他喹诺酮类药物的检测限。

(5)交叉反应。分别以100 ng· mL^-1氯霉素和1 mg· L^-1链霉素、四环素或磺胺嘧啶进行交叉反应。

取一个经LC-MS/MS检测的阴性淡水鱼样, 每份称取2.00 g匀质样品于5 mL离心管中, 按以下4种样品预处理方法分别做添加回收试验, 每种方法的每个添加水平做6次平行试验。

A:加4 mL含1%甲酸的乙腈剧烈振荡5 min, 2 000 g离心5 min, 上清液移到另一支5 mL试管中, 用空气吹干机将溶剂吹至近干, 加0.5 mL PBS溶解残留物, 加0.5 mL正己烷, 用小滴反复吹打试管内壁, 静置5 min, 吸取下层溶液滴板。

B:按A法提取, 将溶剂吹至全干。

C:加入4 mL快速提取液(含1%甲酸的乙腈与乙酸乙酯以体积比1:8混合), 剧烈振荡5 min, 2 000 g离心5 min, 上清液移到另一支5 mL试管中, 用空气吹干机将溶剂吹至近干, 加0.5 mL PBS溶解残留物, 加0.5 mL正己烷, 用小滴反复吹打试管内壁, 静置5 min, 吸取下层溶液滴板。

D:加入4 mL PBS, 剧烈振荡后, 取其悬浊液直接滴板。

根据试验结果优选预处理方法, 并进一步完成虾、甲鱼及其他水产样品的添加回收试验。

1.4.1 与HPLC法对比

采集169个水产样品, 分别按以下部位取样:鱼、黄鳝和泥鳅去皮, 沿脊背取肌肉; 鳖取可食部分(肌肉和性腺); 对虾和小龙虾去头、皮和肠腺, 取整条虾肉; 青蛙, 去头, 去皮, 取肌肉。取好的样品分别绞碎后备用。参照农业部783号公告-2-2006, 以HPLC法定量检测Cip、Enr和Nor残留量, 同时以1.3节中的C方法进行样品预处理, 并用免疫胶体金试剂条定性检测喹诺酮类药物总残留量。

1.4.2 不同免疫胶体金方法对比

取HPLC检测结果为阳性的鳖样品, 分别用1.3节的C法和D法进行预处理, 同时用组织渗出液直接滴板, 对比检测结果。

1.4.3 LC-MS/MS方法确证检测

选取10个HPLC和GICT检测结果均为阳性的样品、10个HPLC检测结果为阴性而GICT为阳性的样品、3个HPLC检测结果为阳性而GICT为阴性的样品, 用LC-MS/MS法进行确证检测。

2.1.1 体外抗体制备结果

QH12杂交瘤细胞株经过体外培养获得4.4 g初步纯化的抗体, 经竞争ELISA测试, 对Cip的IC₅₀为0.4 ng· mL^-1。与传统的体内抗体制备方法比较, 体外抗体制备方法的优点是产量高, 对实验动物的依存度低, 缺点是细胞上清中抗体易被降解, 因此要及时用硫酸铵沉淀法分离抗体。

2.1.2 胶体金紫外-可见光200~800 nm扫描结果

以0.01 mol· L^-1 Tris-HCl作对照, 用紫外-可见光在波长200~800 nm范围内对胶体金进行扫描(图1), 3个平行试验的吸收曲线和吸收峰均高度一致:λ _①max=529.5 nm, λ _②max=λ _③max=529.0 nm, D_{①529.5 nm}=0.943, D_{②529.0 nm}=0.944, D_{③529.0 nm}=0.950。根据经验公式λ =0.427 1φ +514.56计算出胶体金粒径φ _①=35 nm, φ _③=φ _③=34 nm。对比实验组与对照组扫描图可知, 使用1307镀剂处理过的容器所制备的胶体金3次重复的波形几乎重合, 说明该镀剂处理使胶体金质量更稳定。

图1

Fig.1

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	图1 胶体金紫外-可见分光光度计扫描图Fig.1 Scanogram of colloidal gold by UV-visible spectrophotometer

2.1.3 胶体金标记抗体实验

胶体金标记抗体预试验显色情况见表1:当抗体浓度为0.5~2.0 μ g· mL^-1时, Cip对T线上抗原与抗体反应有强抑制作用; 当抗体浓度大于4.0 μ g· mL^-1时, 无抑制作用; 但抗体浓度小于1.0 μ g· mL^-1时, 显色偏浅。因此, 以1 mL胶体金中加2.0 μ g抗体进行正式标记。

2.1.4 免疫胶体金试剂板检出限

以2.5~100 ng· mL^-1的Pef、Ofl、Nor和Lom标准溶液测试新制备的免疫胶体金试剂板(图2), 可以看出, Pef的LOD为5.0 ng· mL^-1, Ofl和Nor的LOD为2.5 ng· mL^-1, Lom的LOD为2.0 ng· mL^-1。

图2

Fig.2

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	图2 4种喹诺酮药物免疫胶体金法检出限Fig.2 LOD of immune colloidal gold detection for 4 QNs

2.1.5 交叉反应结果

试剂条与100 ng· mL^-1氯霉素和1 mg· mL^-1链霉素、四环素或磺胺嘧啶交叉反应实验结果均呈阴性。

方法A吹干时间20~35 min, 尤其是从最后1 mL吹至近干特别慢。方法B其实是在方法A的基础上将溶剂吹至全干, 以测试喹诺酮类药物在吹干后是否能稳定; 方法C吹干较快, 只需5~8 min。4种样品预处理方法的比较结果见表2:A法检测结果不稳定; B法出现较多假阴性结果, 可能是因为吹干时间过长, 致使喹诺酮类药物损失较大; C法的检测灵敏度和结果精密度均最好; D法操作最方便, 但灵敏度低于C法和A法。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 不同样品预处理方法的检测结果 Table 2 Comparison of test results of four sample processing methods 标准品Sample SDC/(ng· g-1) A B C D NC 0 — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — Cip 2.0 + + + — — — + + + — — — + — + — — — + + + — — — 10.0 ++ ++ + — — + ++ ++ ++ + + + ++ ++ ++ — + — ++ ++ ++ + + + Nor 2.5 + + — — — — + + + — — — — + + — — — + + + — — — 15.0 + ++ + — + — ++ ++ ++ + + + ++ + ++ + — + ++ ++ ++ + + + NC, Negative control; SDC, Standard addition concentration; — , Negative or Non-detected; +, Weak positive; ++, Moderate positive; +++, Strongly positive. The same as below. NC, 阴性对照; SDC, 加标浓度; — , 阴性或未检出; +, 弱阳性; ++, 中等阳性; +++, 强阳性。下同。

表2 不同样品预处理方法的检测结果 Table 2 Comparison of test results of four sample processing methods

因此, C法和D法分别适用于高灵敏度检测和现场快速检测。

2.3.1 与HPLC对比结果

取10份HPLC检测有Nor、Cip或Enr残留的鳖、鱼、小龙虾和泥鳅样品, 免疫胶体金法检测结果呈阳性; 有3份小龙虾样品HPLC检出有环丙沙星残留, 免疫胶体金C法检测呈阳性; 有26份HPLC未检出Nor、Cip或Enr的样品, 免疫胶体金法呈阳性。

2.3.2 不同预处理方法对比结果

取经HPLC检测Cip和Nor总残留量为35 μ g· kg^-1的鳖样品进行不同预处理方法对比检测, 结果如图3所示, 从左到右分别为采用D法、组织渗出液直接滴板和C法进行预处理后的检测结果, 均为阳性, 中间试剂板上血液引起背景颜色较深, 均匀布满整个观察窗, 但结果仍可辨识, 说明抗体未与样品中杂质发生非特异性结合, 右侧试剂条显示的是经过有机试剂提取和净化的结果, 更清晰, 更干净, 检测灵敏度也相对更高。

图3

Fig.3

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	图3 不同预处理方法检出效果对比Fig.3 Detection effect comparison of different processing methods

2.3.3 LC-MS/MS验证结果

用LC-MS/MS方法对10个HPLC和GICT(C法)检测结果均为阳性的样品、3个HPLC为阳性而GICT为阴性的样品进行验证, 结果见表3。对于QNs残留量较高的样品, 3种方法的检测结果基本一致。HPLC检测结果中, 小龙虾中Cip易出现假阳性, 鳖中Nor也出现部分假阳性结果, 但GICT与LC-MS/MS检测结果一致。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 同一样品不同检测方法的结果对比 Table 3 Comparison of test results of different detection methods 方法 Method 药物 Reagent 残留量Residue/(μ g· kg-1) TS-1 TS-2 TS-3 TS-4 TS-5 TS-6 TS-7 CA-1 MiA PC-1 PC-2 PC-3 PC-4 HPLC Nor 84 20 18 24 24 13 27 — — — — — — Cip 57 15 34 21 16 22 — — 81 77 13 15 Enr — — — — — 13 — 105 118 — — — — 合计Total 141 35 18 58 45 42 49 105 118 81 77 13 15 LC-MS/MS Flu 1 — — — — — — — — — — — — Nor 30 7 — — — — — — — — — — — Eno 33 — — — — — — — — — — — — Cip 50 15 — 17 — 12 18 — — — — — — Pef 19 5 — — — — — — — — — — — Lom 24 6 — — — — — — — — — — — Dan 29 — — — — — — — — — — — — Enr 20 7 4 5 7 12 7 100 115 5 — — — Ofl 17 4 — — — — — — 4 — — — Mar 13 4 — — — — — — — — — — — Sar 27 6 — — — — — — — — — — — Dif 15 5 — — — — — — — — — — — 合计Total 280 60 4 22 7 24 25 100 115 9 — — — GICT QNs +++ ++ + ++ + ++ ++ +++ +++ + — — — TS, Trionyx sinensis; CA, Carassius auratus; MiA, Misgurnus anguillicaudatus; PC, Procambarus clarki. The same as below. TS, 鳖; CA, 鲫鱼; MiA, 泥鳅; PC, 小龙虾。下同。

表3 同一样品不同检测方法的结果对比 Table 3 Comparison of test results of different detection methods

选取10个HPLC为阴性而GICT(C法)为阳性的样品, LC-MS/MS法检测结果见表4, 其中:9个样品含多种QNs, 且均有Cip和Enr药物被检出(但含量均低于3 μ g· kg^-1, 即在LC-MS/MS最低定量限以下), 未检出Nor; 有1个样品未检出12种QNs中的任何1种, 但GICT法显示阳性, 其中可能含有这12种以外的QNs。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 HPLC阴性样品的LC-MS/MS和 GICT检测结果 Table 4 Test results of HPLC negative samples by LC-MS/MS and GICT 方法 Method 药物 Reagent 残留量Residue/(μ g· kg-1) TS-8 TS-9 TS-10 TS-11 MA CA-2 CC MP CI RN LC-MS/MS Flu 3 — 5 3 4 — — — 4 — Nor — — — — — — — — — — Eno — — < 10 — — — — — — < 10 Cip < 3 < 3 < 3 < 3 < 3 < 3 < 3 — < 3 < 3 Pef 14 — < 3 — 6 — — — — — Lom — — — < 3 — 15 — — < 3 — Dan — 2 — — — — — — < 3 — Enr < 3 < 3 < 3 < 3 < 3 < 3 < 3 — < 3 < 3 Ofl 4 — — 4 — — — — — — Mar — 4 — — — — — — — — Sar — — 6 < 6 — — — — < 6 — Dif — — < 3 < 3 < 3 — — — 3 — GICT QNs ++ + ++ ++ ++ ++ + + ++ + MA, Monopterus albus; CC, Cyprinus carpio; MP, Mylopharyngodon piceus; CI, Ctenopharyngodon idellus; RN, Rana nigromaculata. MA, 黄鳝; CC, 鲤鱼; MP, 青鱼; CI, 草鱼; RN, 青蛙。

表4 HPLC阴性样品的LC-MS/MS和 GICT检测结果 Table 4 Test results of HPLC negative samples by LC-MS/MS and GICT