引用本文
韩春杨, 杨明川, 杨孜生, 冯伉梨, 刘翠艳. 黄精多糖的提取及其对CCl4致大鼠肝损伤的保护作用 [J]. 浙江农业学报, 2018,30(4): 537-547.
HAN Chunyang, YANG Mingchuan, YANG Zisheng, FENG Kangli, LIU Cuiyan. Study on extraction of Polygonatum sibiricum polysaccharides and its protective effect on CCl4-induced acute liver injury in rats [J]. ACTA AGRICULTURAE ZHEJIANGENSIS, 2018,30(4): 537-547.  
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黄精多糖的提取及其对CCl4致大鼠肝损伤的保护作用
韩春杨, 杨明川, 杨孜生, 冯伉梨, 刘翠艳*
安徽农业大学 动物科技学院,安徽 合肥 230036
*通信作者,刘翠艳,E-mail:cyliu@ahau.edu.cn

作者简介:韩春杨(1972—),男,河北衡水人,博士,副教授,主要从事中药药理学及小动物疾病研究。E-mail:luckyhcy@ahau.edu.cn

收稿日期: 2017-08-14
基金资助: 国家自然科学基金(31772786); 2017年安徽农业大学大学生创新创业训练项目(XJDC2016068)
摘要

对黄精多糖(PSP)的最佳提取工艺及其对CCl4诱导的大鼠肝损伤的保护作用进行初步研究。首先,对影响PSP提取率的3个主要因素(液料比、时间和温度)进行单因素试验;然后,以PSP提取率为响应值,利用响应面分析法对其提取工艺进行优化;最后,将提取的PSP用于CCl4诱导的大鼠肝损伤保护实验。动物试验共分5组:对照组,模型组,PSP低、中、高剂量用药组(75、150、300 mg·kg-1),3个用药组大鼠灌胃不同剂量的PSP,对照组和模型组灌胃等量的蒸馏水,连续7 d。末次灌药1 h后,模型组和用药组大鼠按1 mL·kg-1的剂量腹腔注射50% CCl4油溶液,对照组注射等量油溶剂,注射24 h后处死大鼠,采集血液和肝脏,观察肝脏病理变化及组织学变化,检测血清中丙氨酸转氨酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)活性及直接胆红素(DBIL)、总胆红素(TBIL)含量。结果显示,PSP的最佳提取工艺条件为:液料比19.13:1,时间3.49 h,温度73.33 ℃。在此条件下,PSP的实际提取率为10.107%。动物实验中,与模型组相比,中、高剂量的PSP能显著降低( P<0.05)大鼠血清中ALT、AST、ALP活性及DBIL、TBIL含量,各剂量PSP均能不同程度地减轻大鼠肝脏病理学和组织学病变,以高剂量PSP效果最好。可见,黄精多糖对CCl4诱导的大鼠肝损伤有较好的保护作用。

关键词: 黄精多糖; 提取; 大鼠; 肝损伤
中图分类号:S853.74 文献标志码:A 文章编号:1004-1524(2018)04-0537-11 doi: 10.3969/j.issn.1004-1524.2018.04.03
Study on extraction of Polygonatum sibiricum polysaccharides and its protective effect on CCl4-induced acute liver injury in rats
HAN Chunyang, YANG Mingchuan, YANG Zisheng, FENG Kangli, LIU Cuiyan*
College of Animal Science and Technology, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China
Abstract

The present study was designed to investigate optimum extraction process of Polygonatum sibiricum polysaccharides (PSP) and explore its protective effect on carbon tetrachloride (CCl4) induced liver injury in rats. Firstly, single factor experiment was carried out on the three main factors, including the ratio of liquid to material, time and temperature. Then, taking PSP extraction rate as response value, the extraction process was optimized by response surface analysis. Finally, the PSP was used to protect against CCl4-induced liver injury in rats. The experiment rats were randomly divided into 5 groups: control group, model group, low dose, middle dose and high dose (75, 150, 300 mg·kg-1) of PSP groups. The rats of PSP groups were administered with different doses of PSP by gavage. Control group and model group were fed with the same amount of distilled water. All rats were fed for 7 d. One hour after the last administration, the rats in the model group and PSP groups were injected intraperitoneally with 50% CCl4 oil solution at the dose of 1 mL·kg-1,and rats in the control group were received the same amount of soybean oil. Blood and liver samples were collected 24 h later after the last administration to test the pathological and histological changes of liver, the activities of ALT (alanine aminotransferase), AST (aspartate aminotransferase), ALP (alkaline phosphatase;) and the content changes of DBIL (direct bilirubin), TBIL (total bilirubin). The results showed that the optimum extraction conditions of PSP were as follows: liquid material ratio was 19.13:1, extraction time was 3.49 h and temperature was 73.33 ℃. Under these conditions, the actual PSP extraction rate was 10.107%. Compared with the model group, the middle dose PSP group and high dose PSP group could significantly ( P<0.05) reduce the activities of ALT, AST, ALP and the contents of DBIL, TBIL in serum of rats. All doses of PSP could alleviate the pathological and histological changes of liver in different degrees, and the effect of high dose of PSP was the best. These results indicated that PSP had protective effect on CCl4-induced liver injury in rats.

Keyword: Polygonatum sibiricum polysaccharides; extraction; rat; liver injury

黄精(Polygonatum sibiricum)首载于《名医别录》, 是一味能补气养阴、健脾、润肺、益肾的传统中药材, 更具药食两用的特点[1]。黄精的主要化学成分为多糖、甾体皂苷、蒽醌类, 其中, 黄精多糖(Polygonatum sibiricum polysaccharides, PSP)是黄精的主要功能成分, 具有增强免疫、抗肿瘤、抗动脉硬化、抗氧化、调节造血、降血糖等广泛的药理学作用[2, 3]。近年来, 随着人们对黄精和PSP认识的不断深入, 市场对PSP提取分离技术的要求也逐步提高。目前, 国内外多采用热水提取工艺提取PSP, 但关于各项提取参数对提取效果影响的研究还不够细致和深入[4, 5, 6, 7]。本研究采用响应面分析法(response surface methodology, RSM)对PSP提取参数(液料比、时间和温度)进行优化, 以期获得最佳提取工艺; 再以所提取的PSP为试验药物进行CCl4诱导的大鼠肝损伤保护试验, 通过观察大鼠肝脏解剖病理变化、组织学变化, 检测肝功能指标等, 综合评价PSP的保肝作用, 为其用于动物和人临床肝损伤疾病的治疗提供试验依据。

1 材料与方法
1.1 试验材料

1.1.1 药材与试剂

黄精, 合肥乐家老铺中药饮片有限公司; 葡萄糖(分析纯), 天津市大茂化学仪器供应站; 蒽酮(分析纯), 美仑生物公司; 浓硫酸(98%), 上海市振企化学试剂有限公司; 乙醇(分析纯), 上海振兴98化工一厂; CCl4(分析纯), 汕头市西陇化工厂有限公司; 血清生化试剂, 库贝尔生物科技股份有限公司。

1.1.2 试验仪器

BSA124S-CW电子分析天平, 北京赛多利斯有限公司; HC-2062高速离心机, 安徽中科中佳科学仪器有限公司; BA210数码显微镜, 麦克奥迪实业集团有限公司; HH-2数显恒温水浴锅, 常州国华电器有限公司; RE-52CS旋转负压蒸发仪, 上海亚荣生化仪器厂; Alpha-1500紫外可见分光光度计, 上海谱元仪器有限公司; YXQ-LS-18SI高压灭菌锅, 上海博迅实业有限公司医疗设备厂; LS-2055半自动石蜡切片机, 沈阳市龙首电子仪器有限公司; iMagic-V7全自动生化分析仪, 库贝尔生物科技股份有限公司。

1.1.3 试验动物

雄性SD大鼠, 体重180 ~ 220 g, 5周龄。

1.2 实验方法

1.2.1 黄精多糖的提取

(1)标准曲线绘制[8]。取经105 ℃干燥至恒重的无水葡萄糖对照品33 mg, 精密称定, 置100 mL容量瓶中, 加水溶解并稀释至刻度, 摇匀即得对照品溶液。精密量取对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL, 分别置于10 mL具塞刻度试管中, 各加水至2.0 mL, 摇匀, 在冰水浴中缓缓滴加0.2%蒽酮-硫酸溶液至6 mL, 混匀, 放冷后置水浴中保温10 min, 取出, 立即置冰水浴中冷却10 min, 取出, 以相应试剂为空白。用紫外可见分光光度计, 在582 nm波长处测定吸光度。以吸光度为纵坐标, 浓度为横坐标, 绘制标准曲线。

(2)PSP提取工艺参数的单因素试验。称取干燥的黄精粉末3 g, 按药材:80%乙醇=1:3(质量体积比)的比例在80 ℃下进行回流提取6 h, 提取后的黄精粉末减压挥干。取处理过的黄精粉末, 按不同的液料比(10:1、15:1、20:1、25:1、30:1)、时间(1、2、3、4、5 h)、温度(50、60、70、80、90 ℃)进行单因素试验, 提取后的PSP溶液醇沉12 h, 过滤, 取沉淀减压挥干, 并用纯水移至250 mL容量瓶中, 加纯水至刻度。

(3)PSP含量的测定。精密量取PSP溶液0.1 mL, 置10 mL具塞干燥试管中, 照标准曲线制备项下的方法, 依法测定吸光度, 从标准曲线上读出供试品溶液中含无水葡萄糖的质量(mg), 计算即得。

(4)响应面法优化PSP提取工艺。综合单因素试验测定的水平范围, 应用Design-Expert 8.0软件, 设计3因素3水平的响应面试验, 基于试验结果, 确定PSP的最佳提取条件。

1.2.2 动物试验

(1)动物分组与处理。将30只雄性SD大鼠随机分为对照组(Ⅰ )、模型组(Ⅱ )、PSP低剂量组(Ⅲ , 75 mg· kg-1)、PSP中剂量组(Ⅳ , 150 mg· kg-1)、PSP高剂量组(Ⅴ , 300 mg· kg-1)。PSP用药组每天灌胃不同剂量的PSP溶液, 对照组、模型组每天灌胃等量蒸馏水, 连续7 d。在末次给药1 h后, 模型组与用药组按照1 mL· kg-1腹腔注射50% CCl4大豆油溶液, 对照组腹腔注射等量大豆油。

(2)样品采集与处理。CCl4注射24 h后, 大鼠腹腔注射10%水合氯醛(3.5 mL· kg-1)麻醉。心脏采血, 置于非抗凝管中, 离心(598 g, 10 min)吸取上清液, -20 ℃保存。取不同大鼠肝右侧叶(具最大横截面, 有门脉区和中央静脉区)的肝组织, 固定于4%多聚甲醛中。

1.2.3 肝脏组织病理学观察

取4%多聚甲醛中固定的肝脏组织, 经过洗涤、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片与粘片、脱蜡、HE染色、脱水、透明、封片等步骤制成石蜡切片, 于光学显微镜下进行组织学病变观察。

1.2.4 肝功能指标检测

取大鼠血清, 于全自动生化分析仪上检测丙氨酸转氨酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)的活性和直接胆红素(DBIL)、总胆红素(TBIL)的含量变化。

1.3 数据分析

所有数据以平均值± 标准差表示。响应面结果采用Design-Expert 8.0软件进行分析。所有试验数据应用SPASS 20.0进行单因素方差分析(one-way-ANOVA), 对有显著差异(P< 0.05)的处理采用Duncan多重比较。

2 结果与分析
2.1 标准曲线

如图1所示, 由紫外分光光度仪测得吸光度值, 以浓度为横坐标、吸光度值为纵坐标绘制标准曲线, 得线性回归方程:y=0.011 5x+0.029 7(R2=0.999 3)。PSP在5.5 ~ 33.0 μ g· mL-1范围内, 其进样浓度(x, μ g· mL-1)与吸光度值(y)之间呈现良好的线性关系。

图1 标准曲线Fig.1 Standard curve of PSP

2.2 单因素试验结果

2.2.1 液料比对PSP提取率的影响

控制反应条件为时间3 h, 温度80 ℃, 考查液料比分别为10:1、15:1、20:1、25:1、30:1时PSP的提取率。由图2可知, 随着液料比增大, PSP提取率也逐渐增大。当液料比达到25:1之后, PSP提取率基本不再增加。因此选择液料比20:1、25:1和30:1作为响应面试验液料比的水平。

图2 不同液料比对PSP提取率的影响Fig.2 Effects of liquid material ratio on extraction rate of PSP

2.2.2 时间对PSP提取率的影响

控制反应条件液料比20:1, 温度80 ℃, 考查提取时间分别为1、2、3、4、5 h时PSP的提取率。由图3可知, 随着时间延长, PSP提取率也逐渐增大。当时间达到3 h后, PSP提取率基本不再增加。因此选择提取时间2、3、4 h作为响应面试验时间的水平。

图3 不同时间对PSP提取率的影响Fig.3 Effects of time on extraction rate of PSP

2.2.3 温度对PSP提取率的影响

控制反应条件液料比20:1, 时间3 h, 考查温度分别为50、60、70、80、90 ℃时PSP的提取率。由图4可知, 随着温度的提高, PSP提取率也逐渐增大。当温度达到70 ℃后, PSP提取率基本不再增加。因此选择温度60、70、80 ℃作为响应面试验温度的水平。

图4 不同温度对PSP提取的影响Fig.4 Effects of temperature on extraction rate of PSP

2.3 响应面试验结果

2.3.1 因素水平表

综合单因素试验结果, 组合出响应面试验的3因素3水平条件(表1)。

表1 响应面试验因素水平 Table 1 Factors and levels of RSM for PSP extraction

2.3.2 响应面试验设计及结果

响应面法试验方案及结果见表2。

表2 响应面试验设计及结果 Table 2 Program and test results of RSM for PSP extraction

2.3.3 因素间的交互影响

比较图5~7中响应面的陡峭度和等高线的形状, 可以直观地看出各因素交互作用对响应值的影响。AB交互作用对PSP提取率的影响最为显著, 表现为响应面较陡峭, 等高线呈椭圆形, AC交互作用与BC交互作用次之, 相应表现为响应面较为平滑, 且随其数值的增加或减少, 响应值没有显著变化。

图5 液料比与时间的交互作用对PSP提取率的影响
A, 液料比; B, 时间; C, 温度; R, 多糖提取率。图6~7同。Fig.5 Interaction of liquid material ratio and time on extraction rate of PSP
A, Ratio of liquid to material; B, Time; C, Temperature; R, Extraction rate of PSP. The same as in Fig. 7, 8.

图6 液料比与温度的交互作用对PSP提取率的影响Fig.6 Interaction of temperature and liquid material ratio on extraction rate of PSP

图7 时间与温度的交互作用对PSP提取率的影响Fig.7 Interaction of temperature and time on extraction rate of PSP

2.3.4 响应面法方差分析

如表3所示, 对该模型进行方差分析, 并对模型系数进行显著性检验。以P< 0.05表示差异显著。可以看出, 模型达显著水平(P=0.000 4), 失拟项不显著(P=0.192 7), 表明未知因素对试验结果干扰很小, 该模型能真实且较好地反映自变量与响应值之间的关系。模型系数R2=0.961 1, 表明试验充分拟合试验数据, 可用该回归方程代替试验真实点进行分析, 预测PSP的提取率。观察各自变量看出, 一次项中自变量C的偏回归系数达到显著水平(P< 0.05), 说明温度对PSP的提取影响显著。交互项中AB的偏回归系数达到显著水平(P< 0.05), 说明液料比与时间的交互作用对PSP的提取有显著影响。3个因素对PSP提取的影响依次为温度> 时间> 液料比。以PSP提取率为响应值, 以3因素所对应的正交试验中的水平(即-1、0、1)为自变量, 经回归拟合后, 得到回归方程:

Y=10.09+0.024A+0.11B+0.26C+0.20AB+0.13AC+0.026BC-0.34A2-0.13B2-0.46C2。

表3 方差分析 Table 3 Analysis of variance

对回归方程进行偏导求解, 得出最佳提取PSP条件:液料比19.13:1, 时间3.49 h, 温度73.33 ℃。在此条件下, PSP理论提取率为10.107%。为检验结果的可靠性, 采用最佳提取条件重复3次, 结果得出PSP的实际提取率分别为9.967%、10.042%和9.985%, 平均值为9.998%。综上, 实际试验结果和回归模型的预测值基本吻合, 表明该回归模型可准确地模拟和预测PSP提取率。

2.4 PSP对肝损伤大鼠肝脏组织病理学的影响

如图8所示:对照组大鼠肝脏呈暗红色, 表面光滑, 边缘锐利; 模型组大鼠肝脏呈土黄色, 表面有坏死点; 各用药组大鼠肝脏均有不同程度的改善, 其中高剂量组恢复程度最好, 颜色较接近于对照组, 形态较好。

图8 不同组别大鼠肝脏病理学变化
A, 对照组; B, 模型组; C, 低剂量组; D, 中剂量组; E, 高剂量组。图9同。Fig.8 Pathological changes of liver in rats of different groups
A, Control group; B, Model group; C, Low dose group; D, Middle dose group; E, High dose group. The same as in Fig. 9.

2.5 PSP对肝损伤大鼠肝功能指标的影响

如图9显示:模型组ALP活性显著高于对照组(P< 0.05)、PSP低、中、高剂量组, 且对照、PSP低、中、高剂量组之间无显著差异(P> 0.05); 模型组ALT活性显著(P< 0.05)高于对照组、PSP低、中、高剂量组, 低、中剂量组ALT活性显著高于对照组、高剂量组(P< 0.05), 高剂量组ALT活性显著高于对照组(P< 0.05); 模型组AST活性显著高于对照组、中、高剂量组(P< 0.05), 低、中剂量组AST活性显著高于对照组、高剂量组(P< 0.05); 模型组DBIL含量显著高于对照组(P< 0.05)、PSP低、中、高剂量组, 低、中剂量组DBIL含量显著高于对照组(P< 0.05); 模型组TBIL含量显著高于对照组、PSP低、中、高剂量组(P< 0.05), 低剂量组TBIL含量显著高于对照组(P< 0.05)。

图9 不同组别的大鼠肝功能指标变化
柱上无相同小写字母的表示差异显著(P< 0.05)。Fig.9 Changes of liver function indexes in different groups of rats
Bars marked without the same letters indicated significant difference at P< 0.05.

综上, 模型组的5个肝功能指标与对照组相比均有显著差异(P< 0.05), PSP低、中、高剂量组相对于模型组均有改善作用, 且中、高剂量组改善效果较为明显。

如图10所示, 对照组大鼠肝小叶结构完整, 肝索呈放射状排列, 整齐而有规则, 肝细胞结构及形态正常, 细胞排列整齐, 大小均匀, 分界清楚, 细胞核大而圆, 核质分布均匀, 核仁清晰。与空白组相比, 模型组肝脏出现以中央静脉为中心的局灶性肝细胞空泡样坏死, 胞质溶解, 细胞核浓缩或消失, 细胞内存在脂滴, 炎性细胞浸润, 肝索排列紊乱。PSP用药组对CCl4导致的肝损伤均有改善作用, 其中高剂量组改善效果较为明显, 空泡样坏死明显减少, 炎性细胞数目明显少于模型组, 且存在损伤修复细胞, 肝脏结构较为完整。

图10 不同组别大鼠肝脏组织学的变化Fig.10 Histological changes of liver in rats of different groups

3 讨论

近年来, 随着我国集约化养殖业的发展, 药物中毒、饲料霉变、病原微生物感染, 以及环境因素引起的畜禽肝损伤越来越普遍。肝损伤会造成动物物质代谢障碍、胆汁的形成和排泄障碍、解毒能力降低等一系列病理变化和相应的综合征, 给畜禽养殖业带来严重危害; 因此, 研发有效保护和治疗动物肝损伤的低毒低残留药物具有重要的实际意义。中药是我国传统医学的瑰宝, 许多具有清热解毒、利湿退黄、活血化瘀、疏肝理气等功效的中药被用于肝病的传统治疗。本研究室前期研究结果表明, 中药黄精对镉引起的生殖损伤及肝损伤有较好的治疗作用, 但有效成分未知。故本研究首先采用响应面法优化PSP提取工艺, 再对PSP的保肝作用进行初步探讨。

目前PSP的提取分离方法主要包括热水提取、醇析分离、微波辅助提取[9, 10]、超声波提取[11, 12]等, 均存在耗能高、提取率低等缺点[13]。本研究采用水提醇沉法提取PSP, 以黄精水提液中PSP提取率为评价指标, 先根据相关资料选取合适的因素水平(液料比10:1、15:1、20:1、25:1、30:1; 时间1、2、3、4、5 h; 温度50、60、70、80、90 ℃)进行单因素试验, 再通过响应面法分析获得了PSP的最佳提取工艺条件:液料比19.13:1, 时间3.49 h, 温度73.33 ℃, 此时, PSP理论提取率为10.107%。与时晓娟等[14]、徐兵兵等[15]的研究相比, 该提取率处于较高水平。当然, 所测多糖含量还会受药材来源的影响。在统计方法方面, 与李丽等[16]、陈法才[17]]采用的正交方法比较, 本研究采用响应面法, 涉及的内容更具体, 考查了液料比、时间和温度这3个因素对多糖提取率的影响, 确定了黄精多糖提取的最大影响因素为温度, 同时分析了各因素之间的交互作用, 发现液料比与时间的交互作用对黄精多糖的提取有显著影响, 这与陈钢等[18]的研究结果一致。另外, 本研究比陈艳等[19]、粟敏等[20]报道的提取工艺耗能低、操作简单, 更适合于工业化批量生产。

CCl4是经典诱导肝损伤动物模型的化学物质[21, 22], 其成模率高、重复性好, 因而, 其急、慢性肝损伤模型在肝脏疾病研究中得到广泛应用。CCl4引起的肝损伤发病机制为, 在肝微粒体细胞色素P450激活下CCl4生成自由基CC l3·和CCl3 O2·, 这些自由基可与肝细胞内大分子发生共价结合, 也可以攻击膜下不饱和脂质, 引起脂质过氧化, 从而产生脂质过氧化物LPO, LPO及其降解产物可损伤各种生物膜, 使其稳定性和完整性降低、通透性增加, 从而导致细胞质内ALT、AST等酶溢出, 大量进入血液, 故血清ALT和AST被认为是肝损伤的敏感指标, 其活性增强可在一定程度上说明肝脏受损的程度[23, 24]。ALP存在于机体各组织, 其中以骨骼、肝脏和肾脏含量较多, 正常血清中的ALP主要来自于骨骼, 由成骨细胞产生, 经血液到肝脏, 从胆道系统排泄。肝脏受损或者发生障碍时, 肝细胞过度制造ALP, 经淋巴道和肝窦进入血液, 同时由于肝内胆道胆汁排泄障碍, 反流入血液而引起血清ALP升高[25, 26]。血清中的TBIL和DBIL大部分来源于衰老红细胞被破坏后释放出来的血红蛋白衍化而成, 当肝细胞发生病变时, 胆红素不能正常地转化成胆汁, 或者因肝细胞肿胀使肝内胆管受压, 排泄胆汁受阻, 使血液中的TBIL和DBIL升高[27, 28]。本试验中, 模型组大鼠在CCl4腹腔注射24 h后, 血清中AST、ALT水平显著上升, 肝脏病理学和组织学变化明显, 肝脏肿大, 发黄, 有多量坏死点, 肝细胞普遍变性, 坏死或细胞核固缩溶解, 大量炎细胞浸润。与模型组相比, PSP各剂量组血清生化水平显著降低, 大鼠肝细胞受损程度明显减少。表明PSP对CCl4诱导的肝损伤具有明显的保护作用, 其中, 以300 mg· kg-1的剂量效果最好。

本研究采用响应面法优化PSP提取工艺, 对黄精以及其他中药材资源的开发利用及建立植物多糖的共性关键技术具有一定的参考价值。通过对PSP对CCl4诱导的大鼠肝损伤的保护作用研究, 发现PSP在对抗肝损伤方面效果显著, 有望在动物和人肝损伤疾病方面发展成为新的治疗药物。

(责任编辑 卢福庄)

The authors have declared that no competing interests exist.

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