致仔猪腹泻大肠埃希菌的分离及耐药性分析

引用本文

王婧, 刁小龙, 杨茂义, 王全方, 陈晓兰, 张龙. 致仔猪腹泻大肠埃希菌的分离及耐药性分析[J]. 浙江农业学报, 2018,30(4): 568-575.
WANG Jing, DIAO Xiaolong, YANG Maoyi, WANG Quanfang, CHEN Xiaolan, ZHANG Long. Isolation and susceptibility test of pathogens responsible for porcine postweaning diarrhea[J]. ACTA AGRICULTURAE ZHEJIANGENSIS, 2018,30(4): 568-575. 复制到剪切板

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致仔猪腹泻大肠埃希菌的分离及耐药性分析

王婧¹, 刁小龙², 杨茂义¹, 王全方¹, 陈晓兰¹, 张龙^1,^*

1.江苏农牧科技职业学院,江苏泰州 225300

2.中崇信诺生物科技泰州有限公司,江苏泰州 225300

*通信作者,张龙,E-mail:longz98@163.com

作者简介:王婧(1985—),女,四川绵阳人,博士,讲师,主要从事兽药药理研究。E-mail:kenhtsjj@163.com

收稿日期: 2017-07-31

基金资助: 江苏农牧科技职业学院院级项目(NSF201504-2); 江苏省2016大学生创新创业训练计划项目(201612806020X); 泰州市农业支持项目(TN201519)

摘要

为调查江苏省泰州地区引起仔猪腹泻的主要病原,采集腹泻仔猪的肛拭子样品共70份,利用MA琼脂平板共分离得到136株细菌。鉴定结果表明,其中含大肠埃希菌119株、沙门氏菌5株、志贺菌4株、阪崎肠杆菌8株。致病性试验确定其中有81株细菌为致病性大肠埃希菌,对其进行O抗原血清型鉴定,有36株分离菌被定型,分属于6种血清型,以O₇₈和O₁₀₁为优势血清型。进一步对分离得到的大肠埃希菌进行肠毒素基因检测,结果表明,这些大肠埃希菌中包含ST1+ST2型20株、LT1+ST2型44株、ST2型17株,共3种产肠毒素类型。药敏试验结果显示,超过75%的菌株对头孢他啶、阿米卡星和氧氟沙星表现为敏感,而对常用的四环素、头孢呋辛、卡那霉素、多西环素等呈现耐药性,且存在严重的多药耐药现象。研究结果可为泰州地区仔猪腹泻的预防和治疗提供参考依据。

关键词: O抗原; 药敏试验; 耐药性; 肠毒素基因

中图分类号:S856 文献标志码:A 文章编号:1004-1524(2018)04-0568-08 doi: 10.3969/j.issn.1004-1524.2018.04.07

Isolation and susceptibility test of pathogens responsible for porcine postweaning diarrhea

WANG Jing¹, DIAO Xiaolong², YANG Maoyi¹, WANG Quanfang¹, CHEN Xiaolan¹, ZHANG Long^1,^*

1. Jiangsu Agri-Animal Husbandry Vocational College, Taizhou 225300, China

2. Zhongchong Sino Biotech Taizhou Co., Ltd, Taizhou 225300, China

Abstract

In order to investigate the main causes of diarrhea of piglets in Taizhou, Jiangsu Province, 70 rectal swab samples were collected from the live diarrheic piglets, and 136 strains of bacteria were isolated by MA plates, in which 119 strains of Escherichia coli, 5 strains of Salmonella, 4 strains of Shigella, 8 strains of Cronobacter sakazakii were characterized by biochemical identification and 16S rDNA gene sequence analysis. 81 strains of pathogenic E. coli were confirmed according to the animal test. Among them, 36 strains of pathogenic E. coli were identified belonging to 6 serotypes by agglutination tests, and the predominant serotypes were O₇₈ and O₁₀₁. In addition, among 81 pathogenic E. coli, 20 isolates were ST1+ST2, 44 isolates were LT1+ST2,while others were ST2. The drug resistance of pathogenic isolates were tested by Kirby-Barer method, and the results showed that more than 75% pathogenicity isolates were sensitive to ceftazidime, amikacin and ofloxacin, but resistant to tetracycline, cefuroxime, kanamycin and doxycycline seriously,and there were serious multi-drug resistance. These results would provide scientific data for the prevention and control of porcine postweaning diarrhea disease in Taizhou area.

Keyword: O-antigen; susceptibility test; drug resistance; enterotoxin gene

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仔猪腹泻是养猪行业中常见的一类疾病, 且发病率居高不下, 给养猪业带来巨大的困扰。引起仔猪腹泻的原因较为复杂, 可分为传染性病原感染和非传染性因素两类, 其中非传染性腹泻主要由营养、环境应激等原因导致。由于断奶仔猪体温调节能力差、缺乏先天免疫力、消化器官不发达、消化腺功能不完整等, 使得病原微生物有机可乘。一旦仔猪发生腹泻, 将给养殖户造成巨大的经济损失。细菌、病毒、寄生虫等传染性病原感染是造成仔猪腹泻的另一类因素, 会诱发传染性胃肠炎、流行性腹泻、仔猪黄白痢等。其中, 致病性大肠埃希菌感染, 如产肠毒素大肠埃希菌(ETEC)和携带耶尔森氏菌强毒力岛(HPI)的大肠埃希菌等^{[1, 2, 3, 4, 5]}, 主要危害1月龄以内的仔猪, 引起仔猪黄痢、白痢, 是猪场中最常见的仔猪腹泻类型^[6], 发病率和死亡率均较高。

本研究以在江苏省泰州市所辖部分发病猪场采集的仔猪腹泻肛门拭子为研究对象, 进行致病性大肠埃希菌病原的分离和鉴定, 及常规药敏检测, 以明确当地的致病性大肠埃希菌药物敏感特性, 为该病的防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 病例来源

2016年11月— 2017年1月在江苏省泰州市所辖地市区、泰兴、姜堰等5个猪场共采集70份腹泻仔猪的肛拭子样本, 其中市郊猪场采样10份, 其他4个猪场每个采样15份。发病仔猪主要表现为精神不振、食欲不佳、拉稀等。以灭菌棉拭子采集发病仔猪肛拭样品置于灭菌离心管中, 保存于-70 ℃冰箱备用。

1.2 试剂

麦康凯琼脂培养基(MA)购于杭州百思生物技术有限公司; 酵母提取物、胰蛋白胨购自英国OXOID公司; 细菌微量生化反应鉴定管和药敏纸片均购于杭州滨河微生物试剂有限公司; PCR相关试剂均购自大连宝生物试剂公司; 大肠埃希菌单因子抗O血清购自中国兽药监察所, 包括O₂、O₅、O₈、O₁₁、O₂₀、O₄₀、O₄₅、O₅₄、O₆₄、O₇₈、O₁₀₁、O₁₃₈、O₁₃₉、O₁₄₁、O₁₄₇、0₁₄₉; 药敏纸片包括头孢呋辛、头孢吡肟、氧氟沙星、庆大霉素、红霉素、四环素、多西环素等17种。

1.3 病原菌的分离

将采集的棉拭子接种于5 mL营养肉汤中, 37 ℃振荡培养6 h, 然后取少量培养物均匀涂布于MA琼脂平板, 于37 ℃倒置培养18~24 h, 挑取单个疑似菌落至LB液体培养基进行增菌, 保存备用。另取少量纯培养的细菌涂片, 进行革兰氏染色, 镜检, 观察菌体形态和染色特性。

1.4 生化鉴定

根据细菌微量生化反应管检验方法操作指南对分离培养的菌株进行常规生化鉴定, 主要包括葡萄糖、果糖、乳糖、枸橼酸、鸟氨酸、赖氨酸、精氨酸等10项, 接种后将微量生化反应管置于35 ℃恒温培养18~24 h后观察并记录结果, 培养基呈黄色即为阳性反应, 反之则为阴性。

1.5 PCR鉴定

对生化鉴定结果不能确定的菌株进行PCR测序鉴定。取分离菌株500 μ L, 9 000 g离心5 min, 去除上清后重悬于100 μ L灭菌超纯水, 然后采用煮沸法制备各菌株的DNA模板备用。利用细菌16S rDNA通用引物(27F/1492R), 根据参考文献[1]配制25 μ L扩增体系并进行PCR反应。反应结束后, 取5 μ L PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳, 观察结果。预期电泳条带为1 465 bp, 将电泳结果中具有单一目的条带的PCR产物送上海生物工程有限公司进行测序, 并对测序结果进行分析。

1.6 动物试验

动物试验选择18~22 g的清洁级昆明小鼠, 以分离鉴定的菌株普通肉汤培养物作为接种液, 每株菌接种2只小鼠, 分别腹腔注射0.4 mL接种液(含菌量约为2.4× 10⁸ cfu), 同时以灭菌普通肉汤作为对照组。注射后对小鼠进行分笼隔离饲养, 并观察小鼠的临床表现, 记录小鼠死亡时间, 并对死亡小鼠进行剖检观察, 24 h内死亡者判定为致病性菌株。

1.7 大肠埃希菌O抗原血清型鉴定

根据中国兽药监察所大肠埃希菌O抗原血清型鉴定说明书进行操作。将动物试验结果为致病性的大肠埃希菌接种于MA平板上, 37 ℃培养24 h, 取光滑圆整的玫红色菌落1~2个接种至半固体培养基。取半固体培养物接种于普通琼脂斜面, 37 ℃培养24 h, 用2 mL苯酚生理盐水洗下培养物成浓稠悬液, 于121 ℃高压2 h破坏K抗原, 用高压后的抗原进行玻板凝集试验。

1.8 致病性大肠埃希菌肠毒素基因检测

检测不耐热肠毒素LT1, 耐热肠毒素ST1和ST2基因, 引物根据参考文献[7]由上海生物工程公司合成(表1), 检测方法同参考文献^[7]。DNA模板制备方法同1.5节, 利用上述引物配制25 μ L扩增反应体系进行PCR反应, 按照文献方法对所有动物试验结果为致病性大肠埃希菌的细菌进行肠毒素PCR检测。反应结束后, 取5 μ L PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳, 观察结果。

表1 致病性大肠埃希菌相关毒力基因引物序列 Table 1 Primers used for amplification of virulence genes

1.9 药敏试验

用纸片法对上述鉴定得到的致病性大肠埃希菌进行药敏试验, 根据美国临床实验室标准委员会公布的标准, 按抑菌圈直径大小依敏感、中介和耐药3种形式进行判断^[6], 为临床治疗选择敏感药物提供依据。

2 结果与分析

2.1 病原菌的分离及染色

将采集的70份仔猪腹泻肛拭子进行增菌后少量涂布于MA琼脂平板上, 37 ℃培养18~24 h, 培养后可见MA琼脂平板上生长的单个菌落形态主要为圆形, 表面光滑, 颜色为玫红色, 疑似大肠埃希菌。个别MA平板出现少量无色透明的圆形单个菌落, 疑似沙门氏菌。分别挑取2种特征的单个菌落接种于LB肉汤培养基中进行增菌, 随后取少量菌液进行革兰氏染色和镜检, 共分离得到136株细菌。镜检发现, 这些分离的细菌多呈革兰氏阴性, 中等大小, 单个存在, 系两端钝圆的杆菌。

2.2 生化鉴定结果

将分离得到的136株新鲜菌液接种于细菌生化鉴定微量反应试管, 置于35 ℃培养箱静置培养18~24 h, 读取结果。根据生化试验结果, 参照伯杰氏细菌鉴定手册, 分离得到的136株细菌中鉴定出大肠埃希菌108株、沙门氏菌3株、阪崎肠杆菌2株, 其他不确定的细菌23株。

2.3 PCR鉴定结果

对未定型的23株细菌的16S rDNA进行扩增测序, 扩增产物1 465 bp(图1)。对测序结果进行BlastN比对分析得出, 这23株细菌中包括大肠埃希菌11株、沙门氏菌2株、阪崎肠杆菌6株、志贺菌4株。

	Figure Option View Download New Window
	图1 细菌16S rDNA的PCR检测 M, DNA Marker DL2000; 1, 阴性对照; 2~6, 未定型菌株Fig.1 Detection of 16S rDNA M, DNA marker DL2000; 1, Negtive control; 2-6, Undefined strains

结合生化鉴定结果, 所分离得到的136株细菌分别系大肠埃希菌119株、沙门氏菌5株、志贺菌4株、阪崎肠杆菌8株。

2.4 动物试验结果

在致病性试验中, 136株受试菌中共有致病性菌株81株(均系大肠埃希菌), 55株无致病性。大部分致病性菌株接种2~3 h后, 小鼠开始出现精神萎顿、身体蜷缩、被毛凌乱等症状, 部分菌株试验动物可观察到腹泻症状, 少部分动物在接种6 h后开始出现死亡, 大部分于接种12 h以后死亡。对病死小鼠进行剖检, 主要病理变化包括:心包积液, 心冠脂肪瘀血肿大, 胸腔内有少量渗出物; 肺有出血点, 部分动物肺有坏死; 肝脏质地脆弱, 瘀血, 坏死; 脾脏肿大; 肠道黏膜薄且肠道内有气体等。试验结束时将对照组小鼠处死, 剖检后未见肉眼可见病变。对病死小鼠脏器进行细菌学检测, 分离到的细菌与接种细菌的革兰氏染色、生化检测结果一致。

试验过程中发现有2株沙门氏菌和1株志贺菌可引起小鼠腹泻, 但是并不引起小鼠死亡, 因此认为沙门氏菌和志贺菌不是引起动物腹泻的主要病原, 后续血清型鉴定和药敏试验只针对致病性的大肠埃希菌。

2.5 大肠埃希菌O抗原血清型鉴定

玻板凝集试验结果(表2)表明, 81株大肠埃希菌中有36株定型, 分属于6种血清型, 分别是O₂、O₈、O₆₄、0₇₈、O₁₀₁、O₁₄₉, 以O₇₈和O₁₀₁为主要流行血清型, 占本次定型菌株的63.9%。另外45株未能定型, 占致病菌株的55.6%。

表2 大肠埃希菌分离株O抗原血清型分布 Table 2 Distribution of O-serogroups among pathogenic E. coli isolates

2.6 致病性大肠埃希菌的检测

对分离得到的81株大肠埃希菌进行肠毒素类型的PCR检测。电泳结果表明, 分离得到的81株大肠埃希菌中共存在3种肠毒素类型(图2):ST1+ST2型20株, LT1+ST2型44株, ST2型17株。

	Figure Option View Download New Window
	图2 肠毒素基因检测 M, DNA marker DL2000; 1, ST1+ST2型; 2、3, LT1+ST2型; 4、5, ST2型; 6, 阴性对照Fig.2 Detection of enterotoxin genes M, DNA marker DL2000; 1, Type ST1+ST2; 2, 3, Type LT1+ST2; 4, 5, Type ST2; 6, Negative control

2.7 药敏试验

从表3可知, 头孢他啶对所有致病菌的敏感性最好, 敏感株占80.2%, 其次是阿米卡星、氧氟沙星, 敏感菌株占75%以上。不同猪场的敏感性药物各有不同, 其中1个猪场分离菌对氧氟沙星的敏感性最佳, 1个猪场分离菌对头孢他啶和头孢哌酮敏感性最佳, 另外2个猪场分别对头孢他啶、阿米卡星最为敏感, 还有1个猪场对头孢他啶和米诺环素敏感性较好。

药敏试验发现, 这些致病性大肠埃希菌对四环素的耐药性表现最为严重, 耐药菌株达到87.7%, 只有4.9%的致病菌对四环素表现为敏感。这些菌株对头孢呋辛、头孢曲松、卡那霉素、多西环素、环丙沙星等也表现出较为严重的耐药性, 超过50%以上的菌株对上述抗菌药表现为耐药。5个猪场分离的菌株耐药性最严重的均为四环素, 其他几种药物耐药性表现不一。同时, 这些致病菌也表现出严重的多重耐药现象, 且几乎所有菌株的多药耐药谱都不一样。本次试验共使用17种抗生素, 出现14耐和15耐的细菌各1株(表4), 大部分菌株表现出对6~12种抗菌药具有耐药性。各菌株具体的耐药表型见表5。

表3 致病性大肠埃希菌的药敏试验结果 Table 3 Drug sensitivity of pathogenic E. coli

表4 致病性大肠埃希菌的多重耐药性 Table 4 Multidrug resistance of pathogenic E. coli

表5 致病菌株的多药耐药谱型 Table 5 Drug resistant spectrum of all pathogenic isolates

耐药类型 Drug resistant type	株数 Strain No.	耐药谱型 Drug resistant spectrum	耐药类型 Drug resistant type	株数 Strain No.	耐药谱型 Drug resistant spectrum
2耐	1	KAN, NA	3耐	2	KAN, N, TE
Double	1	TE, DX	Three drug	1	CXM, CRO, KAN
resistance	1	KAN, CIP	resistance	1	CXM, CRO, E
4耐	2	KAN, TE, DX, NA		1	TE, DX, E
Four drug	1	KAN, N, TE, DX	5耐	1	CXM, CRO, KAN, TE, NOR
resistance	2	KAN, TE, DX, E	Five drug	1	CN, TE, DX, E, NA
	1	CXM, CRO, TE, NA	resistance	1	CXM, CRO, CN, KAN, TE
6耐	3	CRO, KAN, DX, CIP, ENR, NA		1	CAZ, KAN, TE, DX, NA
Six drug	1	CAZ, CRO, CN, TE, DX, NOR		1	KAN, TE, DX, CIP, NA
resistance	1	CRO, CN, KAN, TE, DX, MI	7耐	2	CXM, CRO, CN, KAN, N, TE, E
	1	CXM, CRO, KAN, TE, DX, E	Seven drug	1	CXM, CAZ, CRO, CFP, CN, TE, E
	1	CXM, CRO, KAN, N, DX, E	resistance	1	CXM, CRO, CN, KAN, TE, E, ENR
8耐	2	CXM, CRO, KAN, TE, CIP, ENR, NOR, NA		3	CXM, CRO, KAN, N, TE, E, NA
Eight drug	1	CXM, CRO, CN, KAN, TE, DX, MI, E		1	CXM, CRO, TE, DX, MI, E, OFX
resistance	2	CXM, CRO, TE, DX, CIP, ENR, NOR, NA		1	CXM, CRO, CN, KAN, TE, DX, E
	1	CXM, CRO, CFP, KAN, TE, E, ENR, NA		1	CAZ, CRO, CN, TE, DX, MI, E
	1	CRO, CFP, KAN, TE, E, ENR, NOR, NA		1	KAN, N, TE, DX, MI, ENR, NA
	1	CRO, KAN, N, TE, OFX, CIP, ENR, NA		1	KAN, N, TE, DX, CIP, ENR, NOR
	1	TE, DX, MI, E, CIP, ENR, NOR, NA	9耐	1	CXM, CRO, CFP, KAN, N, TE, ENR, NOR, NA
10耐	1	CXM, CRO, CFP, CN, KAN, N, TE, DX, ENR, NA	Nine drug	1	CXM, CRO, CFP, KAN, TE, CIP, ENR, NOR, NA
Ten drug	1	CAZ, KAN, TE, DX, MI, E, CIP, ENR, NOR, NA	resistance	1	AK, CN, KAN, N, TE, DX, E, NOR, NA
resistance	2	CXM, CRO, KAN, TE, DX, E, CIP, ENR, NOR, NA		1	CN, KAN, TE, DX, E, CIP, ENR, NOR, NA
	2	CXM, CRO, CN, KAN, N, TE, DX, E, CIP, NA		2	CRO, CN, KAN, TE, DX, CIP, ENR, NOR, NA
	2	CXM, AK, CN, KAN, N, E, CIP, ENR, NOR, NA	11耐 Eleven drug	2	CXM, CAZ, CRO, CFP, KAN, N, TE, DX, CIP, ENR, NA
	1	AK, CN, KAN, TE, DX, OFX, CIP, ENR, NOR, NA	resistance	1	CXM, CAZ, CRO, CFP, KAN, N, TE, DX, CIP, NOR, NA
12耐 Twelve drug	1	CXM, CRO, CFP, KAN, TE, DX, MI, OFX, CIP, ENR, NOR, NA		1	CXM, CRO, CFP, KAN, N, TE, DX, CIP, ENR, NOR, NA
resistance	2	CXM, CAZ, CRO, CFP, CN, KAN, N, TE, DX, CIP, NOR, NA		1	AK, CN, KAN, N, TE, DX, E, CIP, ENR, NOR, NA
	1	CXM, CRO, CFP, KAN, N, TE, DX, OFX, CIP, ENR, NOR, NA		1	CXM, CRO, CN, KAN, N, TE, DX, MI, E, ENR, NA
	1	CXM, CRO, KAN, TE, DX, MI, E, OFX, CIP, ENR, NOR, NA	13耐 Thirteen drug	1	CXM, CRO, CFP, CN, KAN, N, TE, DX, E, CIP, ENR, NOR, NA
	2	AK, CN, KAN, N, TE, DX, MI, E, CIP, ENR, NOR, NA	resistance	3	CXM, CAZ, CRO, CFP, CN, KAN, N, TE, DX, E, CIP, NOR, NA
14耐 Fourteen drug resistance	1	CXM, CRO, CFP, KAN, N, TE, DX, MI, E, OFX, CIP, ENR, NOR, NA	15耐 Fifteen drug resistance	1	CXM, CRO, CFP, CN, KAN, N, TE, DX, MI, E, OFX, CIP, ENR, NOR, NA

表5 致病菌株的多药耐药谱型 Table 5 Drug resistant spectrum of all pathogenic isolates

3 讨论

临床上引起仔猪腹泻的病原较为复杂, 其中由产肠毒素大肠埃希菌(ETEC)引起的仔猪腹泻尤其常见, 也是导致仔猪腹泻的重要病原之一。大肠埃希菌O抗原血清型众多, 目前资料报道已确定的有100多种, 优势血清型主要是O₈、O₇₈、O₁₃₈、O₁₃₉、O₁₄₁、O₁₄₇、O₁₅₇等^{[8, 9, 10]}, 常规多价苗免疫效果不理想^[11], 较难预防, 给养猪业造成了巨大经济损失, 因此对ETEC的早期诊断对临床治疗具有重要意义。

本试验对引起江苏省泰州市辖区内5个猪场仔猪腹泻的细菌性病原进行了分离、鉴定和药敏试验。70份样本共分离到136株细菌, 致病性试验证明, 共81株致病性大肠埃希菌, 部分样本分离到2株以上致病菌。分析发现, 分离到2株以上致病菌的样本多数为混合感染, 主要表现为这些菌株的耐药谱或血清型有所不同, 也有少量样本可能分离到了相同菌株。分离到的其他菌株通过试验证实, 并不是引起仔猪腹泻的主要原因。本试验分离到少量阪崎肠杆菌, 这是一类广泛存在于自然界的条件性致病菌, 而动物试验时未发现这类细菌引起动物产生临床症状, 这可能是由于有一个采样的猪场卫生情况较差, 圈舍内蝇虫较多, 地面排泄物清理不及时所引起的。

本次试验致病性大肠埃希菌O抗原优势血清型为O₇₈和O₁₀₁, 且5个猪场的血清型分布各有不同, 所有猪场存在至少2种血清型, 甚至有一个猪场同时检测出4种血清型。总的来说, 5个猪场中有2个猪场同时检测出O₇₈和O₁₀₁的存在, 2个猪场以O₇₈为主要流行血清型, 1个猪场以O₁₀₁和O₁₄₉为主。而袁玉国等^[12]对江苏中部地区的猪大肠埃希菌血清型研究结果显示, 优势血清型为O₉和O₁₀₇。还有研究表明, 江苏部分地区仔猪腹泻大肠埃希菌以O₆、O₉、O₂₀、O₁₀₁等为优势血清型^[13]。与前述研究的优势血清型略有不同, 可能是由于本试验对致病性大肠埃希菌的O抗原检测使用的是单因子血清, 所选择使用的单因子血清种类不同, 且未使用O抗原多价血清进行初步检测, 导致多数菌株未能定型, 而使最终统计出的优势血清型有所差异。

进一步对其毒力基因进行鉴定表明, 引起此次仔猪腹泻的ETEC包含ST1+ST2、LT1+ST2、ST2三种肠毒素类型。袁玉国等^[12]对苏中地区的猪大肠埃希菌病原的毒力基因调查结果显示, 30.3%的菌株携带肠毒素LT基因, 39.2%携带ST1基因, 64.8%携带ST2基因; 而本次检测所有的分离菌株均携带ST2基因。王景^[14]的研究结果显示, 江苏地区初生仔猪腹泻大肠埃希菌的肠毒素类型以ST1和LT为主要类型, 而携带ST2肠毒素基因的大肠埃希菌大约只占8%。但也有研究表明, 在江苏地区引起仔猪腹泻的大肠埃希菌的肠毒素基因携带类型以LT和ST2为主^[13], 但这些研究的调查地区并不明确, 也有可能是由于近年来ST2的肠毒素基因分布逐步变广所致。

近年来, 养殖业为了预防细菌感染和降低动物患病风险, 常在饲料或饮水中添加大量的抗菌药物, 致使细菌耐药性问题日趋严重, 这也使得同种细菌在不同地区甚至不同养殖场对同种药物表现出较大的敏感性差异; 因此, 在临床上治疗细菌性疾病应先进行药敏测试, 选择敏感药物进行临床治疗^[15]。有研究表明, 在江苏徐州地区, 猪大肠埃希菌耐药性强, 且耐药谱广, 对四环素、多种青霉素、环丙沙星、头孢曲松等常用药物均表现出具有较高的耐药性^[16]。本试验结果表明, 引起泰州市区仔猪腹泻的病原菌对四环素耐药最为严重, 对头孢呋辛、头孢曲松、卡那霉素、多西环素、萘啶酸、环丙沙星也表现出较严重的耐药性, 与徐州地区的猪大肠埃希菌耐药谱较相似, 同时还检测到有对14、15种抗菌药呈现耐药性的菌株, 超过75%的菌株对头孢他啶、阿米卡星和氧氟沙星的敏感性较高。研究结果可为临床用药提供参考。

(责任编辑卢福庄)

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献

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[6]	樊国燕, 臧金灿, 边传周. 规模化猪场大肠杆菌的分离鉴定及耐药性监测[J]. 河南农业科学, 2008, 37(3): 110-112. FAN G Y, ZANG J C, BIAN C Z. *Isolation and identification of Escherichia coli* and monitoring of drug resistance in large-scale pig farms*[J]. Journal of Henan Agricultural Sciences*, 2008, 37(3): 110-112. (in Chinese with English abstract) [本文引用:2]
[7]	CHENG D, SUN H, XU J, et al. *PCR detection of virulence factor genes in Escherichia coli* isolates from weaned piglets with edema disease and /or diarrhea in China*[J]. Veterinary Microbiology*, 2005, 110(1/2): 35-39. [本文引用:2]
[8]	何明清, 刘广惠, 李家银, 等. 四川部分地区哺乳仔猪病原性大肠杆菌血清学鉴定研究[J]. 中国人兽共患病杂志, 1988, 4(1): 18-21. HE M Q, LIU G X, LI J Y, et al. *A study on the identification of pathogenic Escherichia coli* in some parts of Sichuan province*[J]. Chinese Journal of Zoonoses*, 1988, 4(1): 18-21. (in Chinese with English abstract) [本文引用:1]
[9]	张永红, 崔德凤, 沈咏舟, 等. 北京地区猪致病性大肠埃希氏菌的分离鉴定[J]. 中国兽医科技, 1999, 29(4): 17-19. ZHANG Y H, CUI D F, SHEN Y Z, et al. *Isolation and identification of pathogenic Escherichia coli* bacteria in Beijing area*[J]. Chinese Journal of Veterinary Science and Technology*, 1999, 29(4): 17-19. [本文引用:1]
[10]	贾俊元, 周应志, 何虎成, 等. 猪源性大肠埃希氏菌血清型及热敏肠毒素的研究[J]. 中国兽医科技, 1998, 28(11): 25-26. JIA J Y, ZHOU Y Z, HE H C, et al. Studies on serotype and thermal-enterotoxins in pig-derived Escherichia coli[J]. Chinese Journal of Veterinary Science and Technology, 1998, 28(11): 25-26. (in Chinese) [本文引用:1]
[11]	张俊丰, 陈琳, 魏冬霞, 等. 92株猪腹泻大肠杆菌的耐药性分析[J]. 中国畜牧兽医, 2010, 37(11): 153-156. ZHANG J F, CHEN L, WEI D X, et al. *Analysis of resistance for 92 diarrheic Escherichia coli* isolates from pig farms*[J]. China Animal Husband ry & Veterinary Medicine*, 2010, 37(11): 153-156. (in Chinese with English abstract) [本文引用:1]
[12]	袁玉国, 彭秋玲, 陈思, 等. 江苏中部地区猪大肠杆菌病血清型鉴定及毒力基因的调查[J]. 黑龙江畜牧兽医, 2013(22): 83-84. YUAN Y G, PENG Q L, CHEN S, et al. Investigation of the bacterial and serum identification and virulence genes in pigs in central Jiangsu province[J]. Heilongjiang Animal Science and Veterinary Medicine, 2013(22): 83-84. (in Chinese) [本文引用:2]
[13]	唐树霄. 江苏部分地区致初生、断奶仔猪腹泻/水肿病大肠杆菌的O血清型、毒素型和黏附素型的流行病学调查[D]. 扬州: 扬州大学, 2014. TANG S X. *Investigation of O-serogroups, enterotoxins and fimbriae of Escherichia coli* from piglets with neonatal, postweaning diarrhea and /or edema disease in part of Jiangsu Province*[J]. Yangzhou: Yangzhou University*, 2014. (in Chinese with English abstract) [本文引用:2]
[14]	王景. 江苏部分地区致初生仔猪腹泻大肠杆菌的分离鉴定及O₂₄ ETEC分离株人工感染试验[D]. 扬州: 扬州大学, 2014. WANG J. *Isolation and characterization of Escherichia coli* from piglets with neonatal diarrhea in part of Jiangsu Province and challenge of commercial pigs with O₂₄ ETEC isolates[D]*. Yangzhou: Yangzhou University*, 2014. (in Chinese with English abstract) [本文引用:1]
[15]	刁有祥, 李久芹, 陈庆普. 山东省鸡大肠杆菌的分离鉴定[J]. 中国预防兽医学报, 2002, 24(1): 21-23. DIAO Y X, LI J Q, CHEN Q P. *Isolation and identification of avian Escherichia coli* in Shand ong Province*[J]. Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine*, 2002, 24(1): 21-23. (in Chinese with English abstract) [本文引用:1]
[16]	李心海, 王兵, 张林吉, 等. 猪大肠杆菌病病原的鉴定及药敏试验研究[J]. 黑龙江畜牧兽医, 2014(8): 75-76. LI X H, WANG B, ZHANG L J, et al. *Identification and drug sensitivity test of Escherichia coli* pathogen of pig*[J]. Heilongjiang Animal Science and Veterinary Medicine*, 2014(8): 75-76. (in Chinese) [本文引用:1]

2014

0.0

王振玲. 北京地区仔猪腹泻相关病原调查及大肠埃希菌和轮状病毒特性的研究[D]. 北京: 中国农业大学, 2014.

WANG Z

. The survey research of the related pathogen of the piglet diarrhea and the characteristics of Escherichia coli and rotavirus isolated from the porcine farms of Beijing[D]. Beijing: China Agricultural University, 2014. (in Chinese with English abstract)

仔猪腹泻是养猪生产的一类常见疾病,严重阻碍养猪业发展。引起仔猪腹泻的病因复杂多样,如非传染性病因和传染性病原感染等,其中以细菌和病毒感染较为常见,而且病原种类多,病情复杂,发病率高。为深入了解北京地区规模化猪场仔猪腹泻病原流行状况,本研究对2010年8月至2013年12月期间采集的400份腹泻样本进行病毒和细菌检测,并进一步对本实验分离的大肠杆菌和轮状病毒的生物学特性进行研究：从采集的400份仔猪腹泻样本中成功分离到132株细菌,经生化特性检测和16S rRNA基因序列分析,分属于16个细菌种。相关病毒抗原PCR检测结果显示：猪流行性腹泻病毒(PEDV)阳性样本23份,猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)6份,猪轮状病毒(RV)58份,总计87份。其中,RV阳性率最高,为66.7%。采用胶体金法对部分时段的轮状病毒抗原调查结果显示,仔猪RV感染阳性率为17.7%,且每年的12月和次年1月份感染率最高,可达40%。0～7日龄仔猪易感,感染率为30.6%。用轮状病毒抗原阳性病料接种Marc-145细胞,成功分离到一株轮状病毒。在细胞培养中可引起细胞病变。采用抗轮状病毒特异性血清进行间接免疫荧光染色,显示感染细胞质中存在特异性荧光。感染细胞超薄切片电镜观察可见有典型的轮状病毒粒子。利用RT-PCR扩增病毒部分基因和测序,结果显示分离株为A群G亚型轮状病毒。对初生仔猪进行致病性试验结果显示,仔猪感染后表现为典型轮状病毒感染临床症状及病理组织学变化。对分离到的64株大肠杆菌进行O抗原血清型分型,结果定型42株菌,22株未定型。定型菌株主要为8种血清型,分别为O101(18.8%)、O8(11.0%)、O20(11.0%)、O64(12.5%)、O45(4.6%)、 O149(4.6%)、O2(1.5%)、O89(1.5%)、对64株大肠杆菌携带的毒力因子进行PCR鉴定,研究结果显示主要携带的毒力因子为sta, stx2e, astA和eaeA等,50%菌株携带astA和eaeA因子,而30%以上的菌株携带sta和stx2e因子。选取携带多个毒力因子的两株大肠杆菌进行全基因组测序分析,结果显示菌株A基因组约为5.5Mb,菌株B基因组约为5.6Mb,两株菌分别含有5743和5829个开放阅读框(Open reading frame)。对其进行蛋白注释发现两株菌膜转运蛋白的基因差异较大,菌种A为241个,菌种B为342个。进一步分析发现两株细菌膜蛋白基因差异主要体现在Ⅳ型结合转运系统(1ncl1型)。在Ⅳ型转运系统中,菌株B携带的VirB3蛋白编码基因,可参与细菌纤毛侵袭宿主细胞膜的过程,与菌种A存在一定差异。综上所述,本研究通过对北京地区仔猪腹泻的病原学及流行病学调查,较全面的了解了北京地区仔猪腹泻性疾病的流行情况及相关致病病原,并通过对主要病原体的分离和鉴定,进一步明确了主要病原体的生物学特性。本研究的结果将为北京地区仔猪腹泻性疾病的预防和控制提供数据参考,同时为进一步的仔猪腹泻性疾病疫苗的研发提供数据支持。

... 其中,致病性大肠埃希菌感染,如产肠毒素大肠埃希菌(ETEC)和携带耶尔森氏菌强毒力岛(HPI)的大肠埃希菌等^[1,2,3,4,5],主要危害1月龄以内的仔猪,引起仔猪黄痢、白痢,是猪场中最常见的仔猪腹泻类型^[6],发病率和死亡率均较高 ...

... 利用细菌16S rDNA通用引物(27F/1492R),根据参考文献[1]配制25 #cod#x003bc ...

2009

0.0

朱善元, 成大荣, 丁文卫, 等. 断奶仔猪腹泻病原PCR鉴定及其药敏试验[J]. 扬州大学学报, 2009, 30(4): 15-19.

ZHU S

, CHENG D

, DING W

, et al. PCR detection and antibiotic sensitive test of the pathogen responsible for porcine postweaning diarrhea[J]. Journal of Yangzhou University, 2009, 30(4): 15-19. (in Chinese with English abstract)

江苏某养殖场断奶仔猪发生水样腹泻,使用庆大霉素治疗无效.通过采集其中3例腹泻病猪的肛拭子样品,接种LB肉汤培养6 h后,用PCR方法检测,结果发现仔猪腹泻由产肠毒素大肠杆菌(ETEC)引起.通过细菌分离获得60株细菌,PCR检测结果表明:其中2株为LT1+ST2型ETEC、1株为ST1型ETEC,且其菌毛型均为F18ac;药敏试验结果表明:这3株细菌均对呋喃妥因高度敏感,对多黏菌素中度敏感,对环丙沙星、新霉素低度敏感,对四环素、庆大霉素耐药,对左氟沙星、头孢唑林因不同菌株也有差异.另外,在肛拭子样品中还发现大量小袋纤毛虫,选用呋喃妥因和甲硝唑治疗,所有腹泻病猪均于5 d后康复. Abstract： Some postweaning piglets were suffered from watery diarrhea in a wild boar farm in Jiangsu provice, China, and it was no effect after using gentamicin. The rectal swab samples were obtained from three live diarrheic piglets, and were diagnosed being infected with enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) by rapid detected PCR method described pre-viously. In addition, 60 bacteria isolates were picked from all the 3 samples, and three F18ac-positive ETEC isolates were picked out and determined by PCR examination, thereinto, 2 isolates were LT1~+ and ST2~+ , while another one was ST2~+. Nine kinds of antibiotics were tested and all the three isolates were highly sensitive to nitrofurantoin, moderate sensitive to polymyxin, low sensitive to ciprofloxacin and neomycin, and resistant to tetracycline and gentamicin, while the sensitivity to levofloxacin and cephazolin were different in different isolates. In addition, Balantidium coil were also observed in all the 3 rectal swab samples. A series of treatments were performed, such as intramuscular injection of nitro-furantoin and oral administration of metronidazole pellets, and the animal was recovered its health in the following 5 days.

2010

0.0

成大荣, 高小攀, 朱善元, 等. 仔猪大肠杆菌型腹泻的病原检测与免疫防制[J]. 甘肃农业大学学报, 2010, 45(2): 30-33.

CHENG D

, GAO X

, ZHU S

, et al. Pathogen detection and immune prevention of diarrhea caused by E. coli in piglets[J]. Journal of Gansu Agricultural University, 2010, 45(2): 30-33. (in Chinese with English abstract)

2009

0.0

周华林, 熊江林, 王长义, 等. 猪致病性大肠杆菌的分离鉴定及耐药性分析[J]. 中国畜牧兽医, 2009, 36(1): 109-111.

ZHOU H

, XIONG J

, WANG C

, et al. Identification and drug sensitivity test of swine pathogenic Escherichia coli[J]. China Animal Husband ry & Veterinary Medicine, 2009, 36(1): 109-111. (in Chinese with English abstract)

2013

0.0

郭旋, 陈静, 刘欢, 等. 广西仔猪腹泻病毒病原流行病学调查[J]. 南方农业学报, 2013, 44(1): 155-160.

GUO

, CHEN

, LIU

, et al. Investigation on epidemiology of piglets diarrhea virus disease in Guangxi[J]. Journal of Southern Agriculture, 2013, 44(1): 155-160. (in Chinese with English abstract)

[目的]了解引起广西仔猪腹泻的主要病毒病原及其分子流行病学特点,为其防控提供理论依据.[方法]采用RT-PCR对2011年至2012年7月从广西11个城市的养猪场采集的232份病料进行猪流行性腹泻病毒 (PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PoRV)检测和流行病学调查；对部分PEDV阳性病料的M基因进行克隆,并与国内部分省 (市)及国外的一些M基因序列进行比对和遗传进化分析.[结果]广西11个城市采集的232份病料中PEDV、PoRV的阳性率分别为37.50％和 0.03％,而TGEV均为阴性.对部分PEDV阳性病料进行M基因扩增,获得14条M基因,其核苷酸同源性及推导氨基酸序列同源性分别为 97.4％～100.0％和96.0％～100.0％.将扩增获得的14条PEDV M基因与GenBank上发表的40条国内外PEDV M基因进行比对分析,发现有13条同位于一大支上(G1),其中9条与我国2011年分离获得的广东、四川、江苏参考株及泰国2008年分离获得的5条参考株、韩国2007年分离获得的两条参考株同位于G1-1上,4条与我国2011年分离获得的江西、江苏、广东、福建毒株及江苏2004年分离株JS- 2004-2同位于G1-2上.另外一条PEDVM基因(NNA-11)却与其余13条相距较远,位于G2上.[结论]从2011年至今致使广西仔猪腹泻的病毒主要是PEDV,各市均有不同程度感染,且感染全年存在；大部分广西流行毒株与2011年以来我国广东、福建、江苏、江西四省流行毒株的亲缘性较高,与2007年以来泰国、韩国的流行毒株亲缘关系也非常密切,但与我国2006年前分离获得的北方毒株、经典疫苗株、韩国疫苗株相距较远.

2008

0.0

樊国燕, 臧金灿, 边传周. 规模化猪场大肠杆菌的分离鉴定及耐药性监测[J]. 河南农业科学, 2008, 37(3): 110-112.

FAN G

, ZANG J

, BIAN C

. Isolation and identification of Escherichia coli and monitoring of drug resistance in large-scale pig farms[J]. Journal of Henan Agricultural Sciences, 2008, 37(3): 110-112. (in Chinese with English abstract)

... 9 药敏试验用纸片法对上述鉴定得到的致病性大肠埃希菌进行药敏试验,根据美国临床实验室标准委员会公布的标准,按抑菌圈直径大小依敏感、中介和耐药3种形式进行判断^[6],为临床治疗选择敏感药物提供依据 ...

2005

0.0

... 8 致病性大肠埃希菌肠毒素基因检测检测不耐热肠毒素LT1,耐热肠毒素ST1和ST2基因,引物根据参考文献[7]由上海生物工程公司合成(表1),检测方法同参考文献^[7] ...

1988

0.0

何明清, 刘广惠, 李家银, 等. 四川部分地区哺乳仔猪病原性大肠杆菌血清学鉴定研究[J]. 中国人兽共患病杂志, 1988, 4(1): 18-21.

HE M

, LIU G

, LI J

, et al. A study on the identification of pathogenic Escherichia coli in some parts of Sichuan province[J]. Chinese Journal of Zoonoses, 1988, 4(1): 18-21. (in Chinese with English abstract)

... 大肠埃希菌O抗原血清型众多,目前资料报道已确定的有100多种,优势血清型主要是O₈、O₇₈、O₁₃₈、O₁₃₉、O₁₄₁、O₁₄₇、O₁₅₇等^[8,9,10],常规多价苗免疫效果不理想^[11],较难预防,给养猪业造成了巨大经济损失,因此对ETEC的早期诊断对临床治疗具有重要意义 ...

1999

0.0

张永红, 崔德凤, 沈咏舟, 等. 北京地区猪致病性大肠埃希氏菌的分离鉴定[J]. 中国兽医科技, 1999, 29(4): 17-19.

ZHANG Y

, CUI D

, SHEN Y

, et al. Isolation and identification of pathogenic Escherichia coli bacteria in Beijing area[J]. Chinese Journal of Veterinary Science and Technology, 1999, 29(4): 17-19.

1998

0.0

贾俊元, 周应志, 何虎成, 等. 猪源性大肠埃希氏菌血清型及热敏肠毒素的研究[J]. 中国兽医科技, 1998, 28(11): 25-26.

JIA J

, ZHOU Y

, HE H

, et al. Studies on serotype and thermal-enterotoxins in pig-derived Escherichia coli[J]. Chinese Journal of Veterinary Science and Technology, 1998, 28(11): 25-26. (in Chinese)

2010

0.0

张俊丰, 陈琳, 魏冬霞, 等. 92株猪腹泻大肠杆菌的耐药性分析[J]. 中国畜牧兽医, 2010, 37(11): 153-156.

ZHANG J

, CHEN

, WEI D

, et al. Analysis of resistance for 92 diarrheic Escherichia coli isolates from pig farms[J]. China Animal Husband ry & Veterinary Medicine, 2010, 37(11): 153-156. (in Chinese with English abstract)

The resistance Escherichia coli isolates from 92 diarrheic pig rectal swab samples were analyzed to 17 antibacterial agents for the rational using principle. Total of 92 diarrheic pig rectal swab samples were collected to isolate and identify Escherichia coli.Then all isolates were tested for susceptibility to 17 antimicrobial agents by the broth microdilution method. 92 Escherichia coli isolates recovered from diarrheic pigs were identified. And their resistant ratio were orderd as sulfamethoxazole（100%）,trimethoprim（100%）, kanamycin（89%）,gentamicin（80%）, chloramphenicol（78%）, streptomycin（76%）,neomycin（76%）, tetracycline（73%）, spectinomycin（72%）, enrofloxacin（66%）, ampicillin（50%）, amikacin（45%）, florfenicol（32%）, apramycin（27%）, rifampicin（23%）, cefazolin（22%）, ceftiofur（0%）. All isolates were multiple resistant isolates and 81 types of resistant spectrum were presented in 92 Escherichia coli isolates. These Escherichia coli isolates were resistant against 14 antibacterial agents at most, and 3 antibacterial agents at least. Therefore wide resistant spectrum and high resistant ratio were presented in the 92 diarrheic pig Escherichia coli isolates.

分析92株猪腹泻大肠杆菌的耐药性，为临床合理用药提供理论依据。采集腹泻病猪直肠拭子，分离、鉴定大肠杆菌，采用微量稀释法测定分离菌对17种抗菌药物的敏感性。结果表明，从92份腹泻直肠拭子样品中共分离鉴定出92株大肠杆菌，对17种抗菌药物的耐药率从高到低依次为磺胺甲噁唑（100%）、甲氧苄啶（100%）、卡那霉素（89%）、庆大霉素（80%）、氯霉素（78%）、链霉素（76%）、新霉素（76%）、四环素（73%）、大观霉素（72%）、恩诺沙星（66%）、氨苄西林（50%）、阿米卡星（45%）、氟苯尼考（32%）、安普霉素（27%）、利福平（23%）、头孢唑啉（22%）、头孢噻呋（0%）；所有菌株均为多重耐药菌株，92株菌的耐药谱型为81种，菌株最多对14种药物耐药，最少对3种药物耐药。研究结果表明，92株猪腹泻大肠杆菌耐药谱广，耐药率高。

2013

0.0

... 而袁玉国等^[12]对江苏中部地区的猪大肠埃希菌血清型研究结果显示,优势血清型为O₉和O₁₀₇ ...

... 袁玉国等^[12]对苏中地区的猪大肠埃希菌病原的毒力基因调查结果显示,30 ...

2014

0.0

唐树霄. 江苏部分地区致初生、断奶仔猪腹泻/水肿病大肠杆菌的O血清型、毒素型和黏附素型的流行病学调查[D]. 扬州: 扬州大学, 2014.

TANG S

. Investigation of O-serogroups, enterotoxins and fimbriae of Escherichia coli from piglets with neonatal, postweaning diarrhea and /or edema disease in part of Jiangsu Province[J]. Yangzhou: Yangzhou University, 2014. (in Chinese with English abstract)

致病性大肠杆菌是引起仔猪腹泻的重要病原,给养猪业带来了严重的经济损失。为了弄清我省部分养猪地区致仔猪腹泻大肠杆菌的生物学特性,我们于2011-2013年在江苏省部分养猪地区及周边地区,从临诊上疑似仔初生仔猪腹泻(黄、白痢)及断奶仔猪腹泻和／或水肿病病猪的直肠棉拭及病死猪的十二指肠共分离鉴定出576株大肠杆菌,并对其相关生物学特性进行了研究。 1江苏部分地区致初生仔猪腹泻大肠杆菌的O血清型、毒素型和黏附素型共分离出致初生仔猪腹泻大肠杆菌348株,除93株未定型,4株自凝外,共测定出251株大肠杆菌血清型,定型株共覆盖了44种O血清型,其中以O6、O9、O20、O24、0101、0105和0149为主,共174株,占本次定型菌株的69.32%(174/251),为本次致初生仔猪腹泻大肠杆菌调查的主要流行血清型。主要流行的血清型与以往报道的致初生仔猪腹泻大肠杆菌常见血清型间存在一定差异,如024、0105很少报道,也证实了江苏地区致仔猪腹泻大肠杆菌O血清型呈多样性的趋势。利用多重PCR,对分离的348株大肠杆菌进行毒素基因(sta、stb、lt、stx2e、eaeA)的检测。结果表明：共202株大肠杆菌检出毒素基因,检出率达58.05%(202/348)。可分为13种毒素类型,以lt+、stb+、sta+、sta+lt+4种为主要毒素类型,分别为69、55、23和20株。根据毒素特征可将这些分离株分成五种类型：ETEC、STEC、AEEC、ETEC/STEC、 ETEC/AEEC。其中ETEC共168株,占毒素基因阳性菌株的83.17%(168/202),表明ETEC仍是导致初生仔猪腹泻的最重要的病原大肠杆菌。应用玻板凝集试验,对分离的348株大肠杆菌菌株进行4种黏附素(F4、F5、F6、F41)的鉴定,结果表明：有50株大肠杆菌表达一种或多种黏附素,检出率为14.37%(50/348)。本次调查共检测出六种黏附素类型,其中以F4+F5+、F41+和F4+3种黏附素类型为主,分别检出23、11和9株。另外有3株F5+F41+,3株F4+F5+F41+以及1株F5+。对大肠杆菌O血清型、毒素类型及黏附素类型检测结果进行分析,结果显示：202株携带毒素基因的菌株主要血清型为O20、O24、O26、O78、O101、O105和O149,分别有23、33、5、6、5、5和38株。0149大肠杆菌毒素基因型主要为stb+及stb+eaeA+,分别占其毒素基因阳性株的65.79%(25/38)和23.68%(9/38)；024毒素基因型主要为stb+、sta+lt+及lt+,分别占其菌毒素基因阳性株的39.39%(13/33)、30.30%(10/33)和24.24%(8/33)。49个黏附素和毒素基因均呈阳性的分离株,可表现出10种组合形式,其中0149共38株,毒力因子组合形式为stb+/F41+(11株)、stb+eaeA+/F4+F5+(9株)、stb+/F4+(7株)、stb+/F4+F5+(7株)、lt+/F4+F5+F41+(3株)及lt+eaeA+/F4+F5+(1株),而024共的毒力因子组合形式以stb+/F4+F5+(5株)为主。 2致断奶仔猪腹泻和/或水肿病大肠杆菌的O血清型、毒素型和黏附素型共分离出断奶仔猪源大肠杆菌228株,除61株未定型,4株自凝外,测定出共163株大肠杆菌血清型,定型株共覆盖了28种O血清型,其中以09、014、024、044、065、0101为主,共128株,占定型株的78.52%(128/163),为本次致仔猪腹泻和／或水肿病大肠杆菌调查的主要血清型。主要流行血清型与以往报道的断奶仔猪源大肠杆菌常见血清型存在一定的差异,如024、044很少报道,证实了我省部分地区致断奶仔猪腹泻和／或水肿病大肠杆菌O血清型呈多样化的趋势。对这些分离株进行五种毒素基因(sta、stb、lt、stx2e、eaeA)检测,共有110株大肠杆菌检出毒素基因,阳性率达48.25%(110/228)。可分为13种毒素类型,以eaeA+、sta+、 stx2e+eaeA+为主要类型,分别占毒素基因阳性株的35.45%(39/110)、18.18%(20/110)、11.81%(13/110)。根据毒素特征,可将这些分离株为七类：ETEC、STEC、AEEC、ETEC/ST EC、STEC/AEEC、ETEC/AEEC和ETEC/STEC/AEEC,分别占阳性株的30.91%(34/110)、5.45%(6/110)、35.45%(39/110)、0.91%(1/110)、11.82%(13/110)、13.64%(15/110)和1.82%(2/110)。对上述228株大肠杆菌分离株进行5种黏附素(F4、F5、F6、F18、F41)的鉴定,结果表明：有54株大肠杆菌表达一种或多种黏附素,检出率为23.68%(54/228)。本次调查共检测出9种黏附素类型,其中以F18+、F5+F41+和F5+类型为主,分别检出21、17和7株,分别占黏附素阳性株的38.89%(21/54)、31.48%(17/54)和12.93%(7/54)。对大肠杆菌O血清型、毒素类型及黏附素类型检测结果进行分析,结果显示：110个携带毒素基因的菌株主要血清型为014、024、044、065和0101,分别有8、29、7、7和5株,其中024主要见于stx2e+eaeA+和eaeA+(?)日性的大肠杆菌。54个黏附素阳性的菌株覆盖了12个血清型,以024为主要血清型,共25株。其中有11株024大肠杆菌表达F5F41,9株表达F18。32个黏附素和毒素基因均呈阳性的菌株,可表现出19种毒力因子组合形式,以stx2e+eaeA+/F18+以及sta+lt+/F18+为主要组合形式,分别为5和4株。国内外024很少报道,在本次调查中,024有8种毒力因子组合形式,以stx2e+eaeA+/F18+以及sta+lt+/v18+为主,均为3株。

... 还有研究表明,江苏部分地区仔猪腹泻大肠埃希菌以O₆、O₉、O₂₀、O₁₀₁等为优势血清型^[13] ...

... 但也有研究表明,在江苏地区引起仔猪腹泻的大肠埃希菌的肠毒素基因携带类型以LT和ST2为主^[13],但这些研究的调查地区并不明确,也有可能是由于近年来ST2的肠毒素基因分布逐步变广所致 ...

2014

0.0

王景. 江苏部分地区致初生仔猪腹泻大肠杆菌的分离鉴定及O₂₄ ETEC分离株人工感染试验[D]. 扬州: 扬州大学, 2014.

WANG

. Isolation and characterization of Escherichia coli from piglets with neonatal diarrhea in part of Jiangsu Province and challenge of commercial pigs with O₂₄ ETEC isolates[D]. Yangzhou: Yangzhou University, 2014. (in Chinese with English abstract)

产肠毒素大肠杆菌(ETEC)是引起新生仔猪腹泻的重要病原,一直是养猪业的困扰,给养猪业造成一定的经济损失。我们于2013-2014年在江苏部分养猪地区及其周边地区,从临诊上疑似致初生仔猪腹泻(黄、白痢)的直肠棉拭及病死猪的十二指肠、空肠和回肠共分离鉴定出397株大肠杆菌,并对其血清型、肠毒素类型及黏附素类型进行鉴定。 1江苏部分地区及周边地区致初生仔猪腹泻大肠杆菌的分离鉴定本试验共分离出397株致初生仔猪腹泻大肠杆菌,其中64株未定型,5株自凝,328株大肠杆菌O血清型定型,定型菌株共覆盖了38种O血清型,其中以024、0101、0141、055、020和0149为主,共252株,占本研究定型菌株的76.83%(252/328),为本研究致初生仔猪腹泻大肠杆菌的主要流行血清型。本研究分离鉴定出的主要血清型中的024、055和0105在以往报道的初生仔猪腹泻大肠杆菌常见血清型中很少出现,可见024、055和0105有成为江苏地区致仔猪腹泻大肠杆菌主要O血清型的趋势。采用多重PCR对397株大肠杆菌分离株进行五种毒素基因(sta、stb、lt、stx2e、eaeA)的检测。结果显示：397株大肠杆菌分离株中共有171株检测出毒素基因,毒素基因的检出率达43.07%(171/397)。根据检测结果可将其分为13种毒素基因组成类型,其中以sta+、lt+、stb+、stx2e+为主要的肠毒素类型,分别有93、22、14和8株。应用兔回肠结扎试验乳鼠灌胃试验和Vero细胞毒性试验分别对部分菌株(主要为024血清型分离菌)的It、sta、stx2e三种毒素基因的表达进行检测。检测结果表明,024分离菌的毒素基因均能表达,表现出其毒力。应用玻板凝集试验和D-甘露糖抵抗血凝试验(MRHA),对397株大肠杆菌分菌株进行4种黏附素(F4、F5、F6、F41)的鉴定,共检测出37株大肠杆菌有黏附素的表达,检出率为9.32%(37/397),37株大肠杆菌分别表达一种或两种黏附素。本研究分离鉴定共有五种黏附素类型F4+、F5+F41+、F4+F5+、F41+和987P+,分别检出11、10、7、6和3株。对所分离到的397株大肠杆菌O血清型、毒素类型及黏附素类型鉴定结果进行相关性分析：171个携带毒素基因的菌株共覆盖了17个血清型,其主要血清型为024、0141、0149、0101、020和0105,分别拥有57、22、15、9、9和7株。024主要毒素基因类型为sta、lt、stx2e+eaeA分别占024血清型毒素基因阳性菌的59.65%(34/57)、10.53%(6/57)、8.78%(5/57)；0149大肠杆菌毒素基因型主要为stb和stb+stx2e,分别占其毒素基因阳性株的75%(12/15)和25%(3/15)；0101毒素基因型为sta和stx2e;O20的毒素基因类型主要为sta,占该血清型毒素基因阳性株的88.89%(8/9)；0105的毒素基因类型主要为sta,占该血清型毒素基因阳性株的71.43%(5/7)。37株黏附素表达的阳性菌中共有34个分离菌黏附素和毒素基因均呈阳性,可表现出13种组合形式,其中0149共14株,其毒力因子有三种组合形式：stb/F4+F5+、stb+/F41+和stb+stx2e+/F5+F41+,分别有7株,5株和2株；而024的毒力因子组合形式有sta+/F4+(2株)、stb+/F4+(2株)、lt+/F5+F41+(1株)、sta+stb+/F4+(1株).sta+lt+stx2e+/F5+F41+(1株)2O24ETEC分离株人工感染试验 3头刚出生未经母乳喂养的商品仔猪分别经口感染024LYG129株(stb/F5+F41+).O24LYG141株(lt+/F141+).024YC267株(stb+/F4+F5+),攻毒后观察仔猪精神状态、采食、腹泻情况等变化,每3小时采集一次棉拭子,攻毒后72小时扑杀。试验结果表明,在攻毒15小时后,3头仔猪均出现不同程度的腹泻,最初是黄色稀粪,然后转而水样腹泻,脱水,消瘦。其中YC267攻毒猪腹泻严重于其他两组,攻毒24小时后死亡,并从心血中分离到攻毒菌株。攻毒12小时后均能从粪便中持续分离出大肠杆菌,其O血清型、毒素型及黏附素型与攻毒株一致。因此,024血清型的ETEC能够引起仔猪腹泻,具有明显的致病性。

... 王景^[14]的研究结果显示,江苏地区初生仔猪腹泻大肠埃希菌的肠毒素类型以ST1和LT为主要类型,而携带ST2肠毒素基因的大肠埃希菌大约只占8% ...

2002

0.0

刁有祥, 李久芹, 陈庆普. 山东省鸡大肠杆菌的分离鉴定[J]. 中国预防兽医学报, 2002, 24(1): 21-23.

DIAO Y

, LI J

, CHEN Q

. Isolation and identification of avian Escherichia coli in Shand ong Province[J]. Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine, 2002, 24(1): 21-23. (in Chinese with English abstract)

为确定我省流行的鸡大肠杆菌血清型,为研制鸡大肠杆菌灭活疫苗提供相对应的菌株,我们从全省17个地市的56个种鸡场及商品鸡场,分离出210株鸡源大肠杆菌,根据血清型鉴定结果,共有15个血清型,其中O78、0143、O15、O2、018、O11最常见,致病力较强,O18 O78、O2分离率最高,分别为15.8%、12.5%、6.8%,其中O18在国内报道较少.药敏试验结果表明,所分离大肠杆菌对丁胺卡那霉素、氧氟沙星、培氟沙星、环丙沙星的抑菌作用最强,高敏菌株达75%～96%;氯霉素、新霉素、庆大霉素、蒽诺沙星敏感性居中,敏感菌株在50%～60%之间;青霉素、痢特灵、强力霉素、磺胺-5-甲氧嘧啶抑菌作用较低,敏感菌株低于20%.

... 因此,在临床上治疗细菌性疾病应先进行药敏测试,选择敏感药物进行临床治疗^[15] ...

2014

0.0

... 有研究表明,在江苏徐州地区,猪大肠埃希菌耐药性强,且耐药谱广,对四环素、多种青霉素、环丙沙星、头孢曲松等常用药物均表现出具有较高的耐药性^[16] ...