紫茎泽兰透皮剂的制备工艺优化及其临床杀螨效果观察
王柳杰1, 房春林2, 古小彬1, 谢跃1, 杨光友1,*
1.四川农业大学 动物医学院,四川 成都611130
2.成都农业科技职业学院 畜牧兽医分院,四川 成都 611130
*通信作者,杨光友,E-mail:guangyou1963@aliyun.com

作者简介:王柳杰(1989—),女,四川成都人,硕士,从事动物寄生虫病学研究。E-mail:1096024143@qq.com

摘要

以紫茎泽兰杀螨活性主成分紫茎泽兰素A(9-羰基-10,11-去氢泽兰酮,euptox A)提取率为考查指标,对影响提取率的乙醇体积分数、料液比、提取时间、提取次数等因素在单因素试验的基础上进行正交试验优选,确定紫茎泽兰乙醇最佳提取工艺为:加20倍量(体积质量比)的95%乙醇,回流提取3次,每次1 h。将以最佳提取工艺条件提取的紫茎泽兰乙醇提取液制成加或不加氮酮的杀螨透皮剂,进行家兔皮肤的急性毒性试验和刺激性试验。结果表明,家兔完整皮肤和破损皮肤在给药72 h后没有出现急性毒性反应和刺激性。另开展临床杀螨治疗效果试验,将30只痒螨兔和26只疥螨兔分别分成6组,A、B、C、D组分别以加氮酮紫茎泽兰生药含量1.0 g·mL-1、0.5 g·mL-1和不加氮酮生药含量为1.0 g·mL-1、0.5 g·mL-1的杀螨液涂擦处理,E组为阳性对照组,注射伊维菌素0.2 mg,F组为空白对照组,涂擦0.9%生理盐水。试验结果表明,不论痒螨组还是疥螨组,杀螨效果最好的都是加氮酮高剂量组(A组)。

关键词: 紫茎泽兰; 提取工艺; 临床杀螨; 杀螨液; 皮肤安全性试验
中图分类号:S855.9;S853.73 文献标志码:A 文章编号:1004-1524(2018)04-0576-10 doi: 10.3969/j.issn.1004-1524.2018.04.08
Optimizing transdermal agent preparation process of Eupatorium adenophorum and evaluating its effectiveness against Psoroptes cuniculi and Sarcoptes scabiei in vivo
WANG Liujie1, FANG Chunlin2, GU Xiaobin1, XIE Yue1, YANG Guangyou1,*
1. College of Veterinary Medicine, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China
2. Animal Husbandry and Veterinary Branch, Chengdu Agricultural Science and Technology Vocational College, Chengdu 611130, China
Abstract

To screen the extraction process of Eupatorium adenophorum and evaluate its acaricidal activity in vivo, 9-oxo-10,11-dehydro ageraphorone (euptox A), which is the main acaricidal active ingredient, was chosen as the detective index, and single factor level test and orthogonal test were carried out to investigate the influence of volume percentage of ethanol, solid to liquid ratio, extraction duration and extraction times on the extraction percentage. The optimal extraction conditions for ethanol extraction were proposed as: 95% volume percentage of ethanol, solid to liquid ratio of 1:20, extraction duration of 1 h, extraction times of three. The skin acute toxicity test and skin irritation test were carried out by sapreading the acaricidal preparations of E. adenophorum on the integral and damaged back skin of healthy rabbits. The results showed that after using the drug for 72 h, rabbits did not show any reaction of acute toxicity and irritation. In acaricidal clinical test, 30 rabbits with psoroptes mites and 26 rabbits with scabies mites were respectively divided into six groups. The animals in group A and B were treated with the acaricidal preparation contained azone and raw drug ( E. adenophorum) 1.0, 0.5 g·mL-1, respectively. The animals in groups C and D were treated with the acaricidal preparation contained raw drug 1.0, 0.5 g·mL-1, which did not contain azone, respectively. The animals in group E and F were injected with ivermectin 0.2 mg (positive controls) and embrocated 0.9% normal saline on skin (negative controls), respectively. The results showed that,whether for the psoroptes mite group or the scabies mite group, the prepatation with high dose of E. adenophorum and azone worked best.

Keyword: Eupatorium adenophorum; extraction process; clincal acariasis; acaricidal preparation; skin safety test

动物螨病是主要由疥螨科、痒螨科、蠕形螨科和皮刺螨科等螨类寄生于动物体表或表皮内所引起的传染性寄生虫病。螨病能够引起动物生产性能和产品质量的下降, 严重时导致出现大量死亡[1]。化学类杀螨药物为目前国内外防治动物螨病的主力, 包括有机磷杀虫剂、有机氯杀虫剂、大环内酯类杀虫剂、除虫菊和拟除虫菊酯类杀虫剂。这类药物虽然杀螨效果好, 但存在毒性高、残留时间长、环境污染大和长期使用可产生耐药性等问题[2]。植物源的天然药物具有对人畜低毒、对非靶标生物比较安全、对环境压力比较小, 且不易产生残留和耐药性等特点[3, 4, 5]; 因此, 从天然植物中提取出高效、低毒、低残留的杀螨物质及有效杀螨活性成分, 对动物螨病的防控具有重要意义。

紫茎泽兰(Eupatorium adenophorum)属菊目菊科(Compositae)泽兰属(Eupatorim)多年生草本植物, 原产美洲的墨西哥至哥斯达黎加一带, 它具有超凡的繁殖能力和密集成片取得种群优势的生物学特性。作为一种重要的外来有害入侵植物, 已在我国重庆、四川、贵州、云南、西藏、广西、河北、台湾等地迅速传播, 给当地生态平衡带来巨大威胁。近年来, 随着对紫茎泽兰防控与利用研究的不断深入, 已发现紫茎泽兰可作为开发植物源性天然药物的原料, 不仅可以变害为宝, 有效地控制这一有害杂草的蔓延, 而且还能克服化学药物的环境毒性、残留和耐药性等缺点。研究报道, 紫茎泽兰的提取物不仅可以用来杀灭蚜虫、抑制蛾虫产卵、治疗二斑叶螨病和柑橘全爪螨病、杀灭仓库害虫等农业害虫[6, 7, 8, 9], 还可以用于治疗动物球虫病、线虫病、伊氏锥虫病等寄生虫病[10, 11, 12]。本课题组在前期研究中发现, 紫茎泽兰的醇和醚提取物对危害动物的蜱、疥螨、痒螨和足螨具有较好的杀虫活性[13, 14, 15, 16, 17, 18]。为了进一步对紫茎泽兰进行生产开发利用, 特开展紫茎泽兰源外用杀螨液提取工艺、制剂及临床杀螨效果观察与研究。

1 材料与方法
1.1 试验材料

1.1.1 供试动物

自然感染螨病的家兔, 即痒螨兔30只, 雌雄各半; 疥螨兔26只, 雌雄各半; 平均体质量2.3 kg, 购自成都市都江堰某兔场。成年、健康、皮肤无损伤的清洁级家兔24只, 雌雄各半, 体质量2.4~2.8 kg, 购自成都达硕试验动物有限公司。实验动物生产许可证号:SCXK(川)2015— 030。

1.1.2 供试植物及试剂

紫茎泽兰2016年采自四川省攀枝花市。紫茎泽兰素A(9-羰基-10, 11-去氢泽兰酮, euptox A)标准品, 购自上海远慕生物科技有限公司, 纯度95%, 5 mg。99.7%无水乙醇, 分析纯; 甲醇, 色谱纯; 水, 娃哈哈纯净水。

1.2 试验方法

以主要杀螨活性成分紫茎泽兰素A为考查指标, 以乙醇体积分数、料液比、提取次数、提取时间为考查因素, 利用单因素试验确定因素水平, 以L9(34)正交试验确定紫茎泽兰乙醇提取的最佳工艺条件。

(1)紫茎泽兰植株的处理。将采集来的紫茎泽兰植株带回四川农业大学动物寄生虫病研究中心实验室自然阴干, 为了进一步烘干, 把阴干后的植株放在50 ℃的电热恒温鼓风干燥箱中至恒重, 用粉碎机粉碎到50~200目, 所得植物粉用密封袋密封, 避光处保存备用。

(2)标准品溶液的制备。紫茎泽兰素A标准品5 mg置于50 mL容量瓶中, 用甲醇进行溶解, 稀释至刻度, 摇匀作为母液, 即配成溶液浓度为0.1 mg· mL-1的紫茎泽兰素A标准品溶液, 保存在4 ℃冰箱中备用。

(3)样品溶液的制备。精密称取粉碎的紫茎泽兰植物粉末10.0 g置于500 mL圆底烧瓶中, 加一定浓度和体积的乙醇溶液, 利用冷凝回流装置恒温水浴一定时间, 自然冷却后经2 770 g离心5 min过滤, 收集滤液之后, 利用旋转蒸发仪65 ℃水浴减压蒸馏浓缩到50 mL, 得生药浓度为0.2 g· mL-1, 备用。

(4)样品中紫茎泽兰素A含量的测定。测定样品紫茎泽兰素A含量的HPLC条件:流动相为甲醇:水=55:45(体积比), 流速1.0 mL· min-1, 进样量20.0 μ L, 检测波长255 nm, 190~400 nm波段全扫描, Cosmosil C18色谱柱(250 mm× 4.6 mm, 5.0 μ m), 柱温 30 ℃。测定方法:分别精密吸取标准品溶液与稀释后的样品溶液各20.0 μ L, 利用液相色谱仪测定。

1.3 单因素试验设计

1.3.1 乙醇体积分数对紫茎泽兰素A提取率的影响

取5份10.0 g的紫茎泽兰植物粉末, 放入圆底烧瓶中, 分别加入体积分数为50%、65%、75%、85%、95%的乙醇150 mL, 在98 ℃恒温水浴下冷凝回流1 h, 自然冷却后, 2 770 g离心5 min过滤, 把滤液收集到圆底烧瓶中, 65 ℃水浴旋转蒸发仪减压蒸馏浓缩至50 mL。分别从中取200 μ L用对应浓度的乙醇稀释3倍后进样, 稀释后的样品按照1.2节的色谱条件进行测定, 提取率分别为0.114%、0.156%、0.174%、0.176%、0.187%。由此得知, 紫茎泽兰素A提取率随着乙醇体积分数的增加而升高。

1.3.2 提取时间对紫茎泽兰素A提取率的影响

取4份10.0 g的紫茎泽兰植物粉末, 放入圆底烧瓶中, 加入体积分数为75%的乙醇150 mL, 分别在98 ℃恒温水浴下冷凝回流提取0.5、1.0、1.5、2.0 h。自然冷却后, 接下来的步骤同上。稀释3倍后进行测定, 提取率分别为0.167%、0.172%、0.177%、0.188%。由此得知, 紫茎泽兰素A提取率随着提取时间的延长而升高。

1.3.3 料液比对紫茎泽兰素A提取率的影响

取4份10.0 g的紫茎泽兰植物粉末, 放入圆底烧瓶中, 分别加入体积分数为75%的乙醇100 mL(料液比1:10)、150 mL(料液比1:15)、200 mL(料液比1:20)、300 mL(料液比1:30)。在98 ℃恒温水浴下冷凝回流 1 h, 自然冷却后, 同上操作, 稀释3倍后进行测定, 提取率分别为0.056%、0.094%、0.097%、0.110%。由此得知, 紫茎泽兰素A提取率随着料液比的减小而升高。

1.3.4 提取次数对紫茎泽兰素A提取率的影响

取3份10.0 g的紫茎泽兰植物粉末, 放入圆底烧瓶中, 分别加入体积分数为75%的乙醇150 mL, 在98 ℃恒温水浴下分别冷凝回流1次、2次、3次, 每次1 h。合并每次冷凝回流溶液自然冷却后, 同上操作, 稀释3倍后进行测定, 提取率分别为0.103%、0.114%、0.151%。由此得知, 紫茎泽兰素A提取率随着提取次数的增加而升高。

1.4 正交试验设计

参考单因素试验结果, 从实际生产成本考虑, 设计正交试验表(表1)。

1.5 试验药液制备

按照正交试验最佳提取工艺条件制得紫茎泽兰的乙醇提取液, 以制剂中是否加入促透剂氮酮(azone)来作为本次临床杀螨效果的评估。依照初步筛选处方(5%氮酮、15%吐温-80、50%丙三醇、30%酒精)对紫茎泽兰植株乙醇提取液进行溶解, 在4 ℃冰箱中静置48 h后过滤, 制得生药含量分别为1.0、0.5 g· mL-1(质量体积比, 下同)样品液备用; 不含氮酮组药液以等体积0.9%生理盐水代替氮酮进行溶解, 同样方法在4 ℃冰箱中静置48 h后过滤, 制得生药含量分别为1.0、0.5 g· mL-1样品液备用。

1.6 皮肤安全性试验

1.6.1 皮肤急性毒性试验

按照郝光荣[19]介绍的方法分组与处理。取皮肤无损伤、体质量相近、健康状况好的家兔12只, 雌雄各半, 随机分成3组:A组, 加氮酮1.0 g· mL-1; B组, 未加氮酮; C组, 空白对照组(0.9%生理盐水)。在给药之前的24 h, 采用机械方法给家兔背部脊柱两侧10 cm× 5 cm区域进行对称剪毛, 并且利用脱毛剂(8%硫化钠)来脱毛。试验前注意检查去过毛的皮肤是否完整, 受伤了的皮肤不能用来做完整皮肤的试验。

表1 L9(34)正交试验因素水平 Table 1 Factor level design of L9 (34) orthogonal test

A、B组家兔给予相应杀螨液3 mL· 只-1, C组家兔给予0.9%生理盐水3 mL· 只-1。试验过程中, 将药物均匀涂擦家兔背部的脱毛区域, 涂药后区域立即用湿巾、消毒纱布和无刺激性胶布固定。停用药之后的24 h, 利用温水洗去残留的药物, 洗掉药物之后1 h及1~7 d, 每天观察并且记录家兔整体状况, 包括体质量、四肢活动、饮食与粪便、毛发、皮肤、呼吸、眼与黏膜等有没有中毒的表现, 以及死亡情况等。如果杀螨液完整皮肤组无毒性反应, 则用75%(体积分数)医用酒精对家兔右侧脱毛区域进行消毒, 用于制作破损皮肤, 用16号灭菌针头在消过毒的区域内划“ #” , 只损伤到表皮不损伤到真皮, 以有少量血渗出来为度, 马上在破损皮肤部位涂擦杀螨液。具体操作方法、用药剂量及观察指标同完整皮肤组, 试验过程中要进行3个组的相互对照比较。如果过程中有动物出现死亡, 应及时进行尸体解剖检查。当存在肉眼观察能见的病变时, 应该进行病理组织学相关检查[20]

1.6.2 皮肤刺激性试验

依据参考文献[21]进行分组与处理。取试验家兔12只, 雌雄各半, 按照随机数字将它们分为2组:第一组是完整皮肤组, 第二组是破损皮肤组, 每组6只, 编号1~12来进行标记。脱毛法同皮肤急性毒性试验。第2组家兔用酒精消毒后, 在右侧皮肤用灭菌16号针头进行“ #” 字划

破, 以皮肤有血渗出为度, 破损的区域面积为5 cm× 4 cm, 划痕之间的距离为0.5 cm。

采用同体左右侧自身对照法, 每组家兔右侧脱毛涂擦生药含量为1.0 g· mL-1添加透皮剂杀螨液3 mL, 作为对照, 给予左侧脱毛区涂擦0.9%生理盐水3 mL, 用湿巾、消毒纱布和无刺激性胶布固定, 每天擦药一次, 连着擦药5 d, 在最后一次擦药后24 h利用温水洗去残留的药物, 洗掉药物之后1、24、48、72 h用肉眼观察受药部位的皮肤有没有红斑、水肿等情况。按照刺激反应的评分标准(表2), 分别对完整皮肤和破损皮肤的刺激强度进行评价:总分值0~0.49为无刺激; 总分值0.50~2.99为轻刺激; 总分值3.00~5.99为中刺激; 总分值6.00~8.00为强刺激[22]

表2 皮肤刺激性反应评分标准 Table 2 Parameters used to evaluate clinical response score of skin irritation intensity
1.7 临床治疗试验

参照Perrucci等[23]、Walton等[24]的方法进行试验。

兔痒螨病组试验。将30只试验家兔随机分成6组:4个外用杀螨液(涂擦)治疗试验组分别为含紫茎泽兰生药1.0、0.5 g· mL-1加氮酮组和紫茎泽兰生药1.0 g· mL-1、0.5 g· mL-1未加氮酮组, 每组试验动物各6只; 阳性药物对照组(含伊维菌素0.2 mg), 试验动物3只; 空白对照组(0.9%生理盐水), 试验动物3只。

兔疥螨病组试验。将26只试验家兔随机分成6组, 除外用杀螨液(涂擦)治疗试验组每组动物各5只外, 其余动物分组和处理均与兔痒螨病组相同。

伊维菌素, 按照0.2 mg· kg-1(以体质量计)皮下注射, 每隔6 d一次, 连用2次。药液试验组:耳道采用滴入法, 足爪患部先剪去被毛, 棉花蘸取药液涂擦; 耳缘及嘴鼻等其他患部直接涂药, 每隔6 d一次, 连用2次。生理盐水组:直接用0.9%生理盐水进行涂擦, 每隔6 d一次, 连用2次。

于试验开始的第0、3、7、14、30天, 收集痂皮, 根据镜检螨的存在情况计算治愈率。显微镜观察时, 有螨虫显示阳性, 没有螨虫显示阴性。按照相关文献的方法[25, 26, 27], 计算每个治疗组的治疗效果(螨病治愈率)。

痒螨病组(左)和疥螨病组(右)疗效等级评分判定见表3

表3 临床评估感染程度与恢复描述等级评分 Table 3 Parameters used to evaluate score of clinical infection and recovery degree
1.8 数据分析

采用SAS软件进行数据分析[28]

2 结果与分析
2.1 紫茎泽兰外用杀螨液提取工艺优化

表4可以得出, 各因素对紫茎泽兰素A提取率的影响从高到低依次为A(提取浓度)> C(提取时间)> D(提取次数)> B(料液比), 最佳工艺为A3B2C1D3, 即乙醇体积分数95%, 料液比1:20(g· mL-1), 提取时间1 h, 提取次数3次, 提取率约为0.281%。

表4 正交试验设计及结果 Table 4 Orthogonal test design and result
2.2 皮肤安全性试验

2.2.1 皮肤急性毒性试验

在试验的14 d内, 与C组(对照组)相比, A组和B组在涂擦杀螨液后, 完整皮肤组家兔四肢活动自如, 皮毛光泽正常, 饮食、尿液和粪便、眼与黏膜、呼吸方面无明显变化, 精神状况没有不正常, 也未出现中毒现象, 更没有发生死亡。破损皮肤组在试验的7 d之内, A组和B组也未出现中毒症状, 和C组相比, 体质量无显著差异(P> 0.05)(表5)。试验结果初步证实, 皮肤接触此杀螨液并不会产生急性毒性作用。

表5 皮肤急性毒性试验对家兔体质量的影响 Table 5 Effect of acute toxicity test on rabbit body weight kg

2.2.2 皮肤刺激性试验

完整皮肤组家兔涂擦透皮杀螨液后无任何异常出现, 破损皮肤组涂擦透皮杀螨液后, 给药处有轻微红斑, 轻微水肿, 为轻度刺激级别。但在洗去药物72 h 后, 红斑及水肿现象消失, 初步证明透皮杀螨液未对皮肤造成不可逆损伤。根据试验结果分析:紫茎泽兰提取的杀螨液对完整皮肤家兔除在1 h内有轻度刺激外, 之后再无刺激性, 而对于破损皮肤组则在 1~72 h为轻度刺激性, 之后再无刺激性(表6表7)。

表6 完整皮肤组刺激性试验结果 Table 6 Results of irritation test of complete skin group
表7 破损皮肤组刺激性试验结果 Table 7 Results of irritation test of damaged skin group
2.3 临床治疗效果

2.3.1 痒螨病组

从痒螨病组治疗统计结果(表8)可知, A组治疗3 d, 与其他药液治疗组相比治愈率有显著(P< 0.05)提升。治疗7 d后, 治愈率即达到100%。

表8 耳道感染与治疗恢复后的评分等级统计结果 Table 8 Clinical score of infection and degree of recovery for ears

2.3.2 疥螨病组

从疥螨病组治疗统计结果(表9)可知, A组治疗3、7 d, 与其他药液治疗组相比治愈率有显著(P< 0.05)提升。治疗7 d, 治愈率即达100%。

表9 疥螨外耳缘部位感染与治疗恢复后的评分等级统计结果 Table 9 Clinical score of infection and degree of recovery of external ear margins in rabbits
3 讨论

紫茎泽兰的化学成分种类很多, 分离出来的化学成分已达100余种, 主要为半萜类、甾体类、黄酮类、单萜类、苯丙素类、三萜类6大类及其衍生物。利用紫茎泽兰提取物进行兔疥螨、兔痒螨、牛足螨、长角血蜱(硬蜱科)的临床试验, 证实紫茎泽兰粗提物对它们有极强的杀灭作用[13, 14, 15, 16, 17, 18], 并成功地鉴别出了主要杀螨活性单体为9-羰基-10, 11-去氢泽兰酮(紫茎泽兰素A, Euptox A)。紫茎泽兰素A对疥螨和痒螨的离体和在体杀灭都表现出很好的活性。对紫茎泽兰素A在紫茎泽兰体内的分布及积累动态进行研究发现, 紫茎泽兰叶片醇提物具有抑菌、抗病毒、杀虫活性。经过进一步筛选, 明确了紫茎泽兰倍半萜成分和以紫茎泽兰素A为主的泽兰酮衍生物是主要的杀虫活性成分[29, 30, 31, 32, 33]。选取紫茎泽兰素A作为考查指标对提取工艺进行筛选, 可以更好地反映提取物的杀螨活性。

以往利用高效液相色谱法测定紫茎泽兰提取液中紫茎泽兰素A含量的研究报道[30, 32, 33]中, 对于流动相的配比没有统一明确的结果。本试验在1.0 mL· min-1流速下, 对甲醇:水(体积比)分别为60:40、55:45、50:50情况下的流动相进行了考查, 发现当流动相中甲醇:水(体积比)=55:45、流速1.0 mL· min-1洗脱时, 色谱峰分离较好, 峰形对称较好, 基线平稳, 且出峰时间合适。

本研究还对提取溶剂进行了考查。在紫茎泽兰杀虫活性的提取溶剂研究中, 采用乙醇、石油醚、乙酸乙酯、甲醇等的报道很多[30, 34], 其中, 乙醇提取最常见。从生产成本低和提取溶剂安全性等方面考虑, 用乙醇进行提取最合理。从正交试验结果可知, 采用乙醇回流法对紫茎泽兰中杀螨活性成分进行提取, 提取浓度和提取时间对紫茎泽兰素A提取率的影响较大, 提取次数和料液比的影响相对较小。以紫茎泽兰素A为指标, 采用回流提取方法对紫茎泽兰外用杀螨液进行提取的最佳工艺为:乙醇体积分数95%, 料液比1:20(g· mL-1), 每次提取时间1 h, 提取次数3次, 考查指标提取率为0.281%。该工艺简单、经济、可行。

螨类寄生于动物的皮肤表面、表皮及毛囊与皮脂腺内, 经皮给药途径是动物螨病的治疗方式之一。氮酮是目前公认的一种较好的透皮吸收促透剂, 它的使用浓度低、促透效果好、无毒、无刺激, 能促进大多数疏水性和亲水性化合物的透皮吸收。它主要通过加速角质层类脂流动和溶解皮肤的类脂增加药物透皮吸收, 被广泛应用于外用制剂研究中[35, 36, 37, 38]。本试验首次在紫茎泽兰的乙醇提取液中加入透皮制剂氮酮, 并进行临床杀螨对比试验, 结果表明, 加入氮酮组的临床治疗效果优于未加氮酮组, 并且在用药第3天加氮酮高剂量组(A组)不论是兔痒螨病还是兔疥螨病, 治疗效果均比其他组好, 试验结果差异显著。本研究中, 皮肤刺激和毒性试验的结果显示, 氮酮对家兔没有造成任何危害, 尤其是临床杀螨效果最好的加氮酮高剂量组, 对完整皮肤组的靶动物也没有表现出危害, 在破损皮肤组中, 外用杀螨液对靶动物有轻度的刺激作用, 但也只是在72 h内, 72 h之后刺激逐渐消失, 并且杀螨液也没有表现出对破损皮肤组靶动物的毒性作用, 更没有引起破损皮肤因细菌感染引起的脓肿等现象。

(责任编辑 卢福庄)

The authors have declared that no competing interests exist.

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