碱蓬根系嗜盐耐盐真菌的分离与鉴定
吴曰福1,2, 顾爱星1, 王洪凯2,*
1.新疆农业大学 农学院,新疆 乌鲁木齐 830052
2.浙江大学 生物技术研究所,浙江 杭州310058
*通信作者,王洪凯,E-mail:hkwang@zju.edu.cn

作者简介:吴曰福(1995—),男,江西鄱阳人,植物保护专业本科生。E-mail:1648590732@qq.com

摘要

为分析耐盐植物碱蓬根系真菌的组成和耐盐程度,采用常规植物组织真菌分离方法对盐碱地中生长健康的碱蓬根系进行真菌分离,将分离得到的真菌在不同NaCl浓度培养基上进行培养,检测菌株的嗜盐耐盐性,并对分离得到的嗜盐耐盐真菌进行形态学鉴定和分子生物学鉴定。结果显示:分离得到耐盐真菌40株,分别属于镰刀菌属( Fusarium sp.)、链格孢属( Alternaria sp.)、曲霉属( Aspergillus sp.)、腐霉属( Pythium sp.)等,其中,棘孢曲霉( Aspergillus aculeatus)和尖孢镰刀菌( Fusarium oxysporum)是没有被报道过的耐盐真菌;分离得到嗜盐真菌3株,都属于聚多曲霉( Aspergillus sydowii)。结果表明,耐盐植物碱蓬中嗜盐耐盐真菌多样性丰富。

关键词: 嗜盐真菌; 耐盐真菌; 碱蓬; 真菌多样性
中图分类号:Q938.2 文献标志码:A 文章编号:1004-1524(2018)04-0649-07 doi: 10.3969/j.issn.1004-1524.2018.04.17
Isolation and identification of halophilic and halotolerant fungi from roots of Suaeda plants
WU Yuefu1,2, GU Aixing1, WANG Hongkai2,*
1.College of Agronomy, Xinjiang Agricultutal University, Urumqi 830052, China
2. Institute of Biotechnology, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China
Abstract

In the present study, the traditional tissue-isolation method was used to isolate fungi from suaeda roots collected from Inner Mongolian for investigation of fungi composition structure and their salinity tolerance. Salinity tolerance of fungi were evaluated by fungal incubating method on PDA media with different concentrations of NaCl. The halophilic and halotolerant fungi were screened out and identified via both morphological characters and ITS rDNA sequencing. A total of 40 halotolerant fungi strains were isolated in this study, and were preliminary classified as Fusarium sp., Alternaria sp., Aspergillus sp., Pythium sp., etc. Among these fungi, Aspergillus aculeatus, Fusarium oxysporum were newly recorded halotolerant fungi. Three halophilic fungi were isolated and all were classified as Aspergillus sydowii. Results of the present research indicated that thediversity of salinity-tolerance fungi was high in the halotolerant plant rhizosphere.

Keyword: halophilic fungi; halotolerant fungi; suaeda; fungal diversity

随着社会的发展, 人们面对的环境问题越发多样, 高盐环境问题就是其中之一。利用微生物处理环境问题一直是生物技术的研究前沿, 分离采集能够适应高盐环境的微生物, 可以为开发利用此类微生物打下基础。嗜盐耐盐真菌是一类新型微生物资源, 用途广泛, 在环境生物治理、食品工业, 以及嗜盐菌与耐盐植物协同修复盐碱土壤等方面极具应用前景, 日益受到关注。

嗜盐耐盐真菌的研究是从研究晒盐场真菌多样性开始的。在早期的研究中, 嗜盐真菌是指可以在3.0 mol· L-1(17.5%, 质量分数, 下同)甚至更高的盐浓度下生长, 且可以在 1.7 mol· L-1(10%)盐浓度下经常被分离到的真菌; 耐盐真菌是指在 1.7 mol· L-1 盐浓度下只能零星分离到, 但也能够耐受 3.0 mol· L-1 盐浓度的真菌[1]。随着研究的深入, 研究者对耐盐真菌的界定发生变化, 倾向于认为可以适应高盐环境的真菌就是耐盐真菌。Smolyanyuk等[2]认为, 耐盐真菌是指可以在超过0.5 mol· L-1盐浓度下生长的真菌, 测定时一般采用3%、5%、10%、15%、20%的浓度梯度测定真菌的嗜盐耐盐性。

过去, 人们认为真菌并不能生长在高盐浓度的环境中。自Gunde-Cimerman等[3]在晒盐场首次发现嗜盐耐盐真核微生物后, 对嗜盐耐盐真菌的研究迅速发展。李艳华[4]于2003年报道了在沧州盐池发现的嗜盐真菌新种, 命名为嗜盐链孢霉(Streptosporomy halophila gen. nov. sp. nov), 该菌对NaCl的耐受范围在5%~30%。2013年, 代东梅[5]从青海湖土样中共分离出36株嗜盐耐盐真菌, 其中包括2个新种、1个新纪录种。2014年, Min等[6]从韩国黑松木根系中分离出18株耐盐真菌, 多数属于青霉属(Penicillium sp.)和木霉属(Trichoderma sp.)。近年来, 能够提供全系列矿化度的晒盐场一直是研究嗜盐耐盐微生物的重要场所。迄今, 已知的最嗜盐的真菌是Wallemia ichthyophaga, 该菌需要在至少含10%氯化钠的环境才能生长, 而且在饱和氯化钠环境中也能够生长[7]。嗜盐耐盐微生物因为具有独特的渗透调节、三羧酸循环和糖酵解机制, 因而能够适应极端环境[8, 9]

嗜盐耐盐真菌具有重要的研究价值和广阔的应用前景。研究证实, 在高盐环境生长的真菌Penicillium sp. NICS01可以作为生物肥料和生物防治剂来改善植物生长, 提高植物抵抗盐胁迫和枯萎病病菌感染的能力[10]。此外, 菌根真菌与植物的共生有助于协助寄主植物通过机体复杂的调节机制来抵抗高盐环境[11], 如菌根真菌与植物根系形成的共生组织可显著提高盐碱胁迫下沙枣幼苗叶片叶绿素含量和光合作用, 同时, 菌根真菌具有较强的生长活力[12]。红树林在平衡高盐环境的渗透压作用中, 嗜盐微生物也起到了关键作用[13]。嗜盐菌还可用于食品工业, 主要用于食用添加剂的生产, 目前已实现利用嗜盐菌生产胡萝卜素和类胡萝卜素[14]

碱蓬属(Suaeda)植物广泛分布于世界各地的盐碱土地区, 是一类典型的盐生植物, 属于重要的盐生植物资源[15]。碱蓬叶片肉质化程度高, 无泌盐结构, 植株通过稀释的方式避免体内的高盐分发生毒害, 从而体现出较高的耐盐性[16]。高盐环境中生长的耐盐植物组织中可能蕴藏着丰富的嗜盐耐盐真菌, 但从盐碱地上生长的耐盐植物碱蓬根系分离嗜盐耐盐真菌的研究甚少。本研究分离并鉴定碱蓬根系组织中的嗜盐耐盐真菌, 旨在为了解我国盐碱地耐盐植物根际嗜盐耐真菌的多样性, 及其与耐盐植物的互作, 为此类真菌资源的开发利用打下基础。

1 材料与方法
1.1 试验材料

碱蓬(Suaeda)采自内蒙古自治区巴彦淖尔市五原县复兴镇(海拔1 023.415 m, 40.9512° N, 东经107.9710° E)。

PDA培养基(马铃薯琼脂培养基):马铃薯200.0 g, 葡萄糖20.0 g, 琼脂粉15.0 g, 加水定容至1 000 mL, 高压灭菌。1.7 mol· L-1和3.0 mol· L-1 NaCl盐浓度的PDA培养基:在每1 000 mL PDA培养基中分别加入 99.45、175.5 g NaCl。

PCA培养基(马铃薯-胡萝卜-琼脂培养基):马铃薯50.0 g, 胡萝卜50.0 g, 琼脂粉15.0 g, 加水定容至1 000 mL, 高压灭菌。

1.2 真菌的分离与纯化

取碱蓬根系, 自来水洗净后, 用无菌水洗3遍。将根切成3 mm的小段, 放置到PDA培养基上, 25 ℃培养一周。期间每天观察, 及时将长出的真菌挑到新的平板上进行纯化。产孢后, 进行单孢分离, 保存在PDA斜面上。

1.3 抗盐性检测

将纯化的菌株分别接种到1.7 mol· L-1和3.0 mol· L-1 NaCl浓度的PDA培养基上, 每种盐浓度下各设3个重复, 同时将每个菌株分别接种到不含NaCl的PDA培养基上作为对照。置于25 ℃恒温培养箱内培养, 每天观察、记录菌株的生长状况。当对照菌落快长到培养皿边缘时, 测量菌株的菌落直径。依据Gunde-Cimerman等[1]对嗜盐耐盐真菌的定义, 将在3 mol· L-1甚至更高的盐浓度下分离到的真菌记录为嗜盐真菌, 将在1.7 mol· L-1的盐浓度下分离到的真菌记录为耐盐真菌。

盐浓度抑制率(I)计算公式:

I= dPDA-dPDA+NaCldPDA× 100%。 (1)

式(1)中dPDAdPDA+NaCl分别为PDA培养基上和含1.7 mol· L-1或3.0 mol· L-1 NaCl盐浓度的PDA培养基上的菌落直径。

1.4 分子鉴定

1.4.1 DNA提取

采用CTAB法[17]提取真菌基因组DNA。

1.4.2 5.8S rDNA-ITS序列扩增与测序

利用5.8S rDNA-ITS通用引物ITS1(5’ -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’ )和ITS4(5’ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ )进行PCR扩增。PCR扩增反应体系(25 μ L):2× Taq mix 12.5 μ L(上海生工生物工程股份有限公司); ITS1 0.5 μ L, ITS4 0.5 μ L(杭州擎科梓熙生物技术有限公司合成); DNA模板1 μ L, ddH2O 10.5 μ L。PCR扩增程序:95 ℃预变性5 min; 94 ℃变性30 s, 57 ℃退火30 s, 72 ℃延伸1 min, 35个循环; 72 ℃延伸5 min, 4 ℃保存。PCR扩增产物利用l%的琼脂糖凝胶电泳检测有无适当大小的目的条带, 将检测出目的条带的PCR扩增产物纯化后送至杭州擎科梓熙生物技术有限公司进行测序。

1.4.3 真菌鉴定

分子鉴定:运用BioEdit软件对测序结果进行分析校正, 利用NCBI中的Blast对得到的菌株序列进行比对, 确认测序结果。

形态鉴定:分别将嗜盐耐盐菌株接种到PCA培养基上, 置于25 ℃恒温培养箱内培养, 待产孢后, 制作玻片, 通过显微镜观察其显微形态, 参照《真菌鉴定手册》[18]、《真菌分类学》[19]、《真菌学词典》第9版, 以及Mycobank网站数据库(http://www.mycobank.org/)对菌株进行形态鉴定, 结合菌株的BLAST序列比对结果鉴定菌株。

2 结果与分析
2.1 嗜盐耐盐真菌的分离与鉴定

从碱蓬根系共分离得到163株真菌, 嗜盐耐盐性检测显示:得到嗜盐真菌3株, 经鉴定均为聚多曲霉(Aspergillus sydowii); 得到耐盐真菌40株, 分别属于镰刀菌属(Fusarium sp.)、链格孢属(Alternaria sp.)、曲霉属(Aspergillus sp.)、腐霉属(Pythium sp.)、埃里格孢属(Embellisia sp.)、青霉属(Penicillium sp.)、小球腔菌属(Leptosphaeria sp.)、暗球腔菌科(Phaeosphaeriaceae sp.)、炭角菌目(Xylariales sp.)和多孔菌目(Polyporales sp.)。其中:镰刀菌属15株, 菌株数最多, 占比9.2%; 链格孢属8株, 占比4.9%; 曲霉属4株, 占比2.4%; 腐霉属3株, 占比1.8%; 埃里格孢属2株, 占比1.2%; 青霉属1株, 占比0.6%; 小球腔菌属1株, 占比0.6%; 暗球腔菌科5株, 占比3.1%; 炭角菌目真菌3株, 占比1.8%; 多孔菌目真菌1株, 占比0.6%。结果表明镰刀菌是碱蓬根际的优势菌种(表1)。

表1 嗜盐耐盐真菌分离频率 Table 1 Isolating proportion of halophilic and halotolerant fungi

鉴定到种的分别是聚多曲霉(Aspergillus sydowii)(3株)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)(1株)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)(8株)、厚垣镰刀菌(Fusarium chlamydosporum)(2株)和细极链格孢(Alternaria tenuissima)(1株)。在含不同浓度的NaCl培养基上检测, 结果显示聚多曲霉是嗜盐真菌, 在1.7 mol· L-1和3.0 mol· L-1的盐浓度下都表现出较高的耐盐性; 棘孢曲霉、尖孢镰刀菌、厚垣镰刀菌和细极链格孢是耐盐真菌, 在1.7 mol· L-1的盐浓度下都表现出较好的耐盐性, 在3.0 mol· L-1的盐浓度下几乎不生长(表2)。其中棘孢曲霉和尖孢镰刀菌是没有被报道过的耐盐真菌。聚多曲霉作为耐盐真菌已由Kis-Papo等[20]从死海海水中分离得到。

表2 碱蓬根际嗜盐耐盐真菌耐盐性及ITS序列分析 Table 2 Salinity tolerance and ITS sequence analysis of halophilic and halotolerant fungi isolated from roots of Suaeda plants
2.2 嗜盐耐盐真菌的形态特征

2.2.1 棘孢曲霉 Aspergillus aculeatus

菌株JP 17-7-1于25 ℃培养5 d, 在PDA培养基上生长迅速, 菌落直径约37 mm, 质地紧密, 边缘白色隆起, 中心黑色并下凹, 有放射状沟纹, 菌落反面呈淡黄色。菌株在1.7 mol· L-1 NaCl盐浓度的PDA培养基上生长缓慢, 直径约26.7 mm, 白色, 在3.0 mol· L-1 NaCl盐浓度的PDA培养基上不生长。分生孢子头球形, 顶囊近球形, 直径约50 μ m; 分生孢子椭圆或圆形, 淡褐色, 表面有刺突, 直径约5 μ m。菌株形态符合曲霉特征, 并且5.8S rDNA-ITS序列与棘孢曲霉相似度为100%, 因此鉴定该菌株为棘孢曲霉。本研究首次报道棘孢曲霉是耐盐真菌(图1-A)。

图1 五种嗜盐耐盐真菌显微形态
A, 棘孢曲霉; B, 尖孢镰刀菌; C, 厚垣镰刀菌; D, 细极链格孢; E, 聚多曲霉。标尺=10 μ m。
Fig.1 Micrographic morphological characteristics of 5 species of halophilic and halotolerant fungi
A, Aspergillus aculeatus; B, Fusarium oxysporum; C, Fusarium chlamydosporum; D, Alternaria tenuissima; E, Aspergillus sydowii. Bar=10 μ m.

2.2.2 尖孢镰刀菌 Fusarium oxysporum

菌株JP 4-2在PDA培养基上生长迅速, 25 ℃培养5 d菌落直径约46 mm, 菌丝紧密, 边缘白色, 中间淡红色并隆起。菌株在1.7 mol· L-1 NaCl盐浓度的PDA培养基上生长缓慢, 直径约9 mm, 白色, 菌丝稀疏; 菌株在3.0 mol· L-1 NaCl盐浓度的PDA培养基上不生长。分生孢子梗产孢部位较细, 单瓶梗, 在菌丝上散生。大型分生孢子由中间向两端变尖, 呈月牙形, 多数3个隔, 大小约为50 μ m× 5 μ m; 小型分生孢子卵圆形, 表面光滑, 大小约4 μ m。菌体形态符合镰刀菌特征, 并且5.8S rDNA-ITS序列与尖孢镰刀菌相似度为100%, 因此鉴定该菌株为尖孢镰刀菌。本研究首次报道尖孢镰刀菌是耐盐真菌(图1-B)。

2.2.3 厚垣镰刀菌 Fusarium chlamydosporum

菌株JP 17-1于25 ℃培养5 d, 在PDA培养基上生长迅速, 菌落长满培养皿, 绒毛状, 菌丝奶白色, 气生菌丝发达, 培养基背面淡黄色。菌株在1.7 mol· L-1 NaCl盐浓度的PDA培养基上生长较快, 直径约27 mm, 白色; 菌株在3.0 mol· L-1 NaCl盐浓度的PDA培养基上不生长。菌丝中间或端部膨大形成多个串联的厚垣孢子, 圆形, 表面粗糙, 直径20~25 μ m。该菌株的5.8S rDNA-ITS序列与厚垣镰刀菌相似度为100%, 因此鉴定该菌株为厚垣镰刀菌。丁小维[21]于2014年已报道厚垣镰刀菌是耐盐真菌(图1-C)。

2.2.4 细极链格孢 Alternaria tenuissima

菌株JP 13-3于25 ℃培养5 d后, 在PDA培养基上生长迅速, 菌落直径约为53 mm, 毛绒状, 气生菌丝发达, 边缘灰白色, 背面深褐色。菌株在1.7 mol· L-1 NaCl盐浓度的PDA培养基上生长缓慢, 直径约20 mm, 白色, 菌丝稀疏; 菌株在3.0 mol· L-1 NaCl盐浓度的PDA培养基上不生长。菌丝分支多, 孢子链短, 分生孢子梨形, 多数分生孢子3个纵膈孢。菌株形态特征符合链格孢, 并且5.8S rDNA-ITS序列与细极链格孢相一致, 鉴定该菌株为细极链格孢。代东梅[5]已在2013年报道了细极链格孢是耐盐真菌(图1-D)。

2.2.5 聚多曲霉 Aspergillus sydowii

菌株JP 10-1于25 ℃培养5 d, 在PDA培养基上菌落直径约为32 mm, 边缘白色, 中间淡褐色, 中心少部分暗蓝色。菌株在1.7 mol· L-1 NaCl盐浓度的PDA培养基上生长较快, 菌落直径约38 mm, 中间暗蓝色, 边缘白色; 菌株在3.0 mol· L-1 NaCl盐浓度的PDA培养基上菌落直径约13.3 mm, 白色, 质地紧密。分生孢子头辐射状, 直径约30 μ m, 顶囊近球形, 较小, 分生孢子球形, 表面粗糙, 有刺突, 直径约4 μ m。菌体形态符合曲霉特征, 并且5.8S rDNA-ITS序列与聚多曲霉相似度为100%, 因此鉴定该菌株为聚多曲霉(图1-E)。该菌在1.7 mol· L-1和3.0 mol· L-1 NaCl盐浓度下抑制率分别为-18.7%和58.3%(图2), 表明1.7 mol· L-1 NaCl盐浓度对聚多曲霉生长具有促进作用, 而3.0 mol· L-1 NaCl盐浓度对聚多曲霉抑制作用较大。

图2 聚多曲霉耐盐性
A、B、C中培养基上NaCl的浓度分别为0、1.7、3.0 mol· L-1
Fig.2 Salt tolerance of Aspergillus sydowii
NaCl concentration in medium A, B, C were 0, 1.7, 3.0 mol· L-1, respectively.

3 讨论

根际真菌对植物具有重要作用。在干旱、高盐胁迫环境条件下, 根际真菌提高了植物根系从胁迫环境中吸收水分的能力, 估计可以达到根系总吸水量的20%。植物根系与特定微生物通过互作建立互惠的关系, 可以促进植物生长, 增强植物适应性, 减轻逆境胁迫的症状。已有报道, 具有忍耐高盐胁迫能力的菌根真菌与植物根系建立互惠共生体, 能够调节植物多种生理生化代谢, 增强植物抗盐性[22, 23]。筛选高效耐盐的菌根真菌资源, 对开发菌根真菌提高植物抗盐性的应用具有重要意义。本研究从碱蓬根系中分离到的耐盐真菌属于多个属, 有2个种是首次报道的耐盐真菌。本研究得到的真菌是从健康的碱蓬根系表面分离的, 虽然分离时没有进行表面消毒, 无法区分分离到的是黏附在根系表面的真菌还是内生真菌, 但许多菌株在培养过程中没有出现任何形式的孢子, 与分离内生真菌时遇到的情况相似[24], 据此推测有些菌株可能属于内生真菌。关于内生真菌与植物根系的互作情况和对植物抗(耐)盐性的影响将作进一步研究。

高盐环境是一种极端环境, 研究者根据其采样的环境, 对耐盐真菌耐盐浓度的定义标准也不同。早期的研究是从晒盐场分离真菌, 筛选耐盐真菌的标准是能够在10% NaCl盐浓度下生长; 后期有研究从海边土壤、植物中分离真菌, 考虑到海水的平均含盐量约为3%, 因此采用3%的NaCl盐浓度作为耐盐标准[25]。黄菁菁等[26]从海水环境中的土样和植物样品中分离真菌, 筛选耐盐真菌的标准是6%的含盐量。本研究采用从晒盐场筛选耐盐菌株的标准(10%的盐浓度), 从盐碱地生长健壮的碱蓬根系中分离的真菌, 许多是耐盐菌株, 说明碱蓬可作为研究耐盐菌株多样性的重要来源, 盐碱地生长的植物根系中的真菌具有丰富的多样性。

(责任编辑 高 峻)

The authors have declared that no competing interests exist.

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