海洋源高产葡萄糖氧化酶细菌的筛选和主要酶学性质
叶日英, 徐德峰*, 孙力军, 王雅玲, 王俊峰, 莫日坚, 王嘉伟, 包艳
广东海洋大学 食品科技学院,广东省水产品加工与安全重点实验室,广东省海洋食品工程技术研究中心,水产品深加工广东普通高等学校重点实验室,广东 湛江 524088
*通信作者,徐德峰,E-mail:13827198525@163.com

作者简介:叶日英(1965—),女,广东湛江人,高级实验师,主要从事食品微生物及水产品保鲜与高值化加工研究。E-mail:zhzt.2009@163.com

摘要

从海洋环境中筛选高产葡萄糖氧化酶的海洋细菌, 为生产葡萄糖氧化酶提供新的菌种资源。采集海泥、海水及珊瑚样品,采用亚甲基蓝平板显色培养的方法初步分离产酶细菌,再对分离菌株进行显色培养,挑选产酶优势菌株,用液态摇瓶发酵的方法测定优势菌株的产酶能力,然后检测温度及酸碱度对酶活性的影响,并对优势菌株进行形态鉴定、生化鉴定以及16S rDNA基因序列鉴定。从海泥样品中初筛得到几株产葡萄糖氧化酶的细菌,其中菌株MS-4产酶活力最高,该菌在常规LB液体培养条件下葡萄糖氧化酶活力达到8.8 U·mL-1;所产酶最适作用温度为14 ℃,最适pH为7.0,在25 ℃以下活性稳定;经过综合鉴定MS-4是蜡状芽孢杆菌,其中生化鉴定和基因序列鉴定的结果显示,该菌与蜡状芽孢杆菌的相似度分别为98.8%和100%。实验结果说明,MS-4具有相对较高的产葡萄糖氧化酶能力,可作为低温食品保鲜用葡萄糖氧化酶的生产用菌进行开发和研究。

关键词: 海洋细菌; 葡萄糖氧化酶; 筛选; 鉴定
中图分类号:Q939.97 文献标志码:A 文章编号:1004-1524(2018)04-0672-07 doi: 10.3969/j.issn.1004-1524.2018.04.21
Screening and main enzymatic property of high-producing glucose oxidase bacteria from marine environment
YE Riying, XU Defeng*, SUN Lijun, WANG Yaling, WANG Junfeng, MO Rijian, WANG Jiawei, BAO Yan
College of Food Science and Technology, Guangdong Ocean University, Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Product Processing and Safety, Guangdong Provincial Engineering Technology Research Center of Marine Food, Key Laboratory of Advanced Processing of Aquatic Products of Guangdong Higher Education Institution, Zhanjiang 524088, China
Abstract

In order to gain high-producing glucose oxidase bacteria from marine environment and provide new strains for glucose oxidase manufacture, producing glucose oxidase bacteria was separated with coloration culture method using methylene blue medium in Petri dish from sea mud, sea water and coral, the dominant producing glucose oxidase bacteria among them was screened with being coloration cultivated again, and it's producing glucose oxidase ability was measured with shaking liquid fermentation, and influence of pH and temperature on enzymatic activity were checked, afterwards it was identified in morphological, biochemical and 16S rDNA sequences. The results showed that several strains producing glucose oxidase were separated from sea mud, of which MS-4 was the highest producing glucose oxidase bacteria, it secreted glucose oxidase in fermentation fluid of normal LB culture reaching 8.8 U·mL-1, and the glucose oxidase best fit act temperature was 14 ℃, pH was 7.0,and stability was maintained below 25 ℃. Synthesize identification showed that MS-4 was Bacillus cereus, the similarity of biochemical and 16S rDNA sequences were 98.8% and 100%, respectively. The experimental results indicated MS-4 was relatively high-producing glucose oxidase marine bacteria, and it could be studied and developed as a bacteria that produce glucose oxidase which could be used in food fresh keeping at low temperature.

Keyword: marine bacteria; glucose oxidase; screening; identification

近年来, 随着海洋生物技术的兴起和对海洋生物资源开发意识的增强, 国内外对海洋微生物及其产酶的研究进展迅速, 开发具有全新性质的酶已成为国际酶制剂研究的热点[1, 2, 3]。葡萄糖氧化酶(glucose oxidase, GOD)能高度专一性地催化β -D-葡萄糖与空气中的氧反应, 使葡萄糖氧化变成葡萄糖酸和过氧化氢[1], 一方面可降低食品基质中的氧, 减轻因葡萄糖的存在而造成褐变等品质劣变; 另一方面过氧化氢具有抑菌和杀菌的功效, 基于葡萄糖氧化酶这些良好的生物脱氧和抑菌效果, 目前葡萄糖氧化酶已在食品、医药和饲料工业中得到广泛应用[4, 5, 6]

目前葡萄糖氧化酶酶制剂菌种主要采用青霉和黑曲霉属微生物, 国外主要生产企业诺维信等公司多选用青霉, 但在发酵过程中较低的表达量以及杂蛋白的存在给分离纯化带来很大困难, 导致产品质量和价格差异较大[7, 8, 9]。因此, 筛选产酶活力高且杂蛋白较少的优良菌株是提升国内葡萄糖氧化酶酶制剂质量和市场竞争力的关键。由于细菌相对真菌具有较简单的代谢途径, 产生的杂蛋白含量比真菌少, 易于分离纯化, 而且海洋细菌的独特生存环境如低温、高压和高渗透压等条件会使其产生的葡萄糖氧化酶的酶学性质与陆生微生物有所不同, 因此产葡萄糖氧化酶的海洋细菌引起相关研究人员的极大关注。目前, 从海洋环境资源中筛选产葡萄糖氧化酶的目标菌株已见报道。例如石淑钰等[10]从黄海海域深6~30 m的海泥样品中筛选分离到一株产葡萄糖氧化酶的假单胞杆菌, 并对其酶学性质进行了研究。本研究从北部湾海域采集海泥样品, 采用亚甲基兰呈色培养基分离和筛选产葡萄糖氧化酶细菌, 选择其中的产酶优势细菌进行形态鉴定、生化鉴定和基因序列鉴定。一般而言, 酶制剂的酶学性质主要是适宜作用温度范围、pH值范围以及对热的稳定性, 由此本实验对海洋细菌分离株所产的葡萄糖氧化酶进行这三个方面特性检测, 以便为葡萄糖氧化酶生产提供新型的工程菌株。

1 材料与方法
1.1 材料

1.1.1 原料

海泥、海水和珊瑚样品取自南海水深20 m左右的海底。

1.1.2 试剂

1.0× 10-3 moL· L-1靛蓝胭脂红水溶液; 0.2 mol· L-1乙酸-乙酸钠缓冲溶液(pH 5.2); 12 mg· L-1过氧化氢标准溶液; 初筛培养基(下层), 蛋白胨5 g, 牛肉膏1 g, 氯化钠1 g, 琼脂粉15 g, 人工海水1 000 mL, 调pH值为7左右; 初筛培养基(上层), 葡萄糖5 g, 亚甲基蓝0.05 g, 琼脂15, 人工海水1 000 mL, pH值7左右; 复筛培养基, 蛋白胨5 g, 牛肉膏1 g, 氯化钠1 g, 琼脂粉15 g, 葡萄糖5 g, 亚甲基蓝0.05 g, 人工海水1 000 mL, pH值7左右; 液态发酵产酶培养基采用LB培养基。上述试剂中过氧化氢、氯化钠、靛蓝胭脂红、亚甲基蓝和乙酸-乙酸钠等均为分析纯试剂, 其余均为化学纯试剂。

1.1.3 仪器

分光光度计UV-2102p(上海博迅实业有限公司医疗设备厂); PB-10型精密PH计(上海精密仪器厂); BX-51型生物荧光显微镜(日本Olympus公司); Hitachi S4800扫描电镜(日本日立公司); 全自动细菌鉴定仪VITEK-609(法国梅里埃公司); PCR仪GT9611(郑州南北仪器设备有限公司); DZF-6052真空干燥箱(上海风棱实验设备有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 产GOD酶细菌的初步筛选

分别称取海泥、海水和珊瑚样品25 g或25 mL加入到装有225 mL生理盐水的锥形瓶中制成10-1溶液, 然后按10倍稀释法用无菌生理盐水将三种样品溶液依次稀释成10-2、10-3、10-4、10-5和10-6溶液。用移液枪分别吸取各样品的10-4、10-5、10-6溶液1 mL加入到无菌平皿中, 再加入预先配制好并恒温至45 ℃左右的下层培养基15 mL, 每个样品的每个稀释度做2个平皿, 轻轻转动平皿使培养基与样品溶液混合均匀, 静置冷却凝固后, 置于30 ℃下培养3 d左右, 待菌落充分生长至培养基表面, 然后加入8 mL左右的上层培养基, 快速转动平皿将培养基表面的菌落完全覆盖, 静置30 min后观察菌落及其周围培养基是否出现蓝色褪色变白现象, 挑选出现白色圈的目标菌落进行单独纯化培养。

1.2.2 产GOD优势细菌株的重复筛选及其酶活性检测

用复筛培养基倒制平板, 将初步筛选纯化的菌株用圆点接种的方法接种于平皿, 每个平皿接种1种菌, 每株菌在平皿中接种4个点, 置于30 ℃培养3 d, 观察每株菌接种点菌苔的生长情况及其周围出现白色圈的状况, 挑选明显出现白色圈的菌株单独接种于液态发酵产酶培养基30 ℃摇瓶发酵5 d, 摇床转速200 r· min-1, 每株菌各做3个平行。发酵结束后参考李丕武等[11]的比色法检测酶活力, 该方法具有指示反应灵敏度高, 选择性好等优点, 具体操作过程为:取25 mL具塞试管8支, 编号为0~7, 分别加入1 mL靛蓝胭脂红溶液和3 mL 0.2 mol· L-1乙酸-乙酸钠缓冲溶液。然后按试管号顺序依次加入0、1、2、3、4、5、6、7 mL过氧化氢标准溶液, 然后, 均以水定容至刻度, 塞紧, 摇匀。同时放入沸水浴中, 加热13 min后取出, 迅速用自来水冲淋、冷至室温, 终止反应。用1 cm比色皿, 以水为参比, 于615 nm波长处, 测定吸光度D, 以1 g(D0/D)对过氧化氢浓度作图, 得标准曲线。

取10 mL菌株发酵液和10 mL葡萄糖溶液混合后于25 ℃在摇床反应30 min, 摇床转速200 r· min-1, 得酶促反应液。然后用1 mL酶促反应液代替过氧化氢标准溶液, 与1 mL靛蓝胭脂红溶液和3 mL缓冲溶液混合, 用超纯水定容至25 mL后置于100 ℃水浴13 min, 取出后迅速用自来水冷却至室温以终止反应。用1 cm比色皿, 以水为参比, 于615 nm处测定吸光度D, 根据标准曲线方程计算出过氧化氢量, 从而计算酶活力。酶活力单位定义:在上述实验条件下, 每分钟催化氧化1 μ g 过氧化氢所需的酶量定义为一个酶活力单位(U)[12]

1.2.3 产酶优势菌株的GOD活性与温度及pH值的关系

粗酶液的制备:将目标菌株发酵液用双层纱布过滤后, 用超声波破碎细胞以释放胞内酶(超声波处理条件为50 Hz、25 ℃、30 min), 然后置于真空干燥箱浓缩至约1/5, 得到粗酶液, 备用。

最适作用pH值检测:在酶的最适作用温度下, 在pH为3.5~8.5、每间隔0.5的pH梯度点检测酶活性。具有最大酶活性的pH点即为最适作用pH值。

最适作用温度检测:设定pH为7.0, 在温度为4~44 ℃、每间隔5 ℃的梯度检测粗酶液的活性。最大酶活性的温度点即是最适作用温度。

对热稳定性的检测:设定pH为7.0, 在温度为15~45 ℃、每间隔5 ℃的梯度恒温1 h后检测粗酶液活性。

1.2.4 产GOD优势菌株的鉴定

细胞形态观察:将发酵液酶活力较高的细菌作革兰氏镜检, 并观察其菌落特征, 同时采用扫描电镜观察细菌形态[13]

生化鉴定:采用全自动细菌生化鉴定仪进行鉴定, 方法是在无菌离心管中加入3 mL无菌生理盐水, 用接种环接入单株上述优势产酶细菌, 摇匀后制成具有一定浓度的菌悬液, 然后用已校正的VITEK2比浊仪将菌悬液以无菌水稀释至0.5~0.6麦氏单位, 将样品置于载卡台进行鉴定[14]

基因序列鉴定:参考林星宇等[15]的PCR分析方法并作改进。先采用反复冻融法提取细菌DNA, 取2 mL无菌离心管加入双蒸水30 μ L, 然后用接种环挑取优势细菌加入到双蒸水中, 摇匀后制成具有一定浊度的菌悬液, 置于-20 ℃冷冻15 min后, 取出于65 ℃水浴20 min, 反复冷冻和水浴3次后, 即可作为菌株DNA的PCR; 然后扩增模板, 通用引物为27F和1492R, 扩增16S rDNA区域。测序工作由广州基迪奥生物科技公司完成, 所得序列用Identify程序在EzTaxon模式菌株数据库中进行比对, 然后利用MEGA 5.05软件进行系统发育树构建。

2 结果与分析
2.1 产GOD细菌的重复筛选及产酶活性检测结果

在初筛培养皿中海水和珊瑚样品都没有发现产葡萄糖氧化酶的疑似菌, 在海泥样品中有3株疑似产葡萄糖氧化酶的菌株, 命名为MS-2、MS-4和MS-6, 将3株菌用圆点接种进行复筛后发现MS-4白色圈最大, MS-6白色圈较小, 而MS-2的白色圈不明显(图1)。3株菌的菌落形态及其发酵液的酶活力如表1所示。很显然, MS-4发酵液的酶活力最大, 达到8.80 U· mL-1, 为产酶优势菌株。

图1 三株产葡萄糖氧化酶细菌重复筛选的培养状态
左, MS-2; 中, MS-4; 右, MS-6。
Fig.1 Status of three glucose oxidase producing strains in repetition screening
Left, MS-2; Middle, MS-4; Right, MS-6.

表1 产葡萄糖氧化酶菌株的菌落特征及产酶活力 Table 1 Colony characteristics and producing activity of glucose oxidase bacteria
2.2 酶活性与温度及pH的关系检测结果

经过在上述不同的pH值及不同的温度检测MS-4粗酶液的活性, 发现在pH为6.0~7.5时酶活性较大, 其中最适作用pH值为7.0, 当pH值小于5时活性急剧减少, 如图2所示, 说明MS-4所产的葡萄糖氧化酶适宜在中性及弱酸、弱碱条件下使用; 在温度影响方面, 4~34 ℃时酶活性相对较大, 如图3所示, 其中最适温度为14 ℃, 4~34 ℃可作为适宜的作用温度。MS-4粗酶液对热稳定性检测结果如图4所示, 该酶在25 ℃以下活性几乎不变, 30 ℃略有降低, 35 ℃以上活性明显下降, 至45 ℃时活性几乎消失, 因此, 该酶产品不耐热, 应保存于25 ℃以下。

图2 pH值对酶活力的影响Fig.2 Influence of pH on enzymatic activity

图3 温度对酶活力的影响Fig.3 Influence of temperature on enzymatic activity

图4 发酵液在不同温度下加热1 h后的酶活力Fig.4 Enzymatic activity of fermented liquid after 1 h heat at different temperature

2.3 产GOD优势菌株的鉴定结果

2.3.1 优势菌株的细胞形态

MS-4镜检结果为革兰氏阳性, 细胞呈杆状, 末端方形, 呈短链或长连排列, 有芽孢生成, 扫描电镜下为典型杆菌形态, 单个菌体(0.9~1.2)μ m× (1.8~2.1) μ m, 电镜扫描及革兰氏镜检图像如图5所示。

图5 MS-4菌株在电镜扫描下的形态(左)及其革兰氏镜检状态(右)Fig.5 Scanning electron micrographs (left) and gram microscopic examination (right) of strain MS-4

2.3.2 生化鉴定结果

全自动细菌生化鉴定检测的结果如表2所示。MS-4与蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)的相似度为98.8%, 初步鉴定为蜡状芽孢杆菌。

表2 MS-4菌株部分生化特征 Table 2 Partly biochemical characteristics of strain MS-4

2.3.3 基因序列鉴定结果

将菌株获得的基因序列输入EzTaxon数据库, 应用Identify程序将获得的基因序列与数据库中基因序列进行对比, 发现菌株MS-4与蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus ATCC14579的序列同源性为100%, 将MS-4菌株16S rDNA序列提交到NCBI的GenBank数据库获得基因登录号为KU296971, 结合形态鉴定及生化鉴定的结果, 确定该菌株为蜡状芽孢杆菌。根据MS-4的基因所建的系统发育树如图6所示。

图6 菌株MS-4的16S rRNA 基因系统进化树
线段0.002 表示序列差异的分支长度; 发育树节点的数值表示Brootstrap 值; 上标T表示为模式菌株, 括号内数据为数据库中的登录号.
Fig.6 Phylogenetic tree of strain MS-4 and related species based on 16S rRNA gene sequences
Bar=0.002 nucleotide divergence. Number at notes presented bootstrap percentages (based on 1 000 sampling). The subscript of T noted the type strain and those in brackets were the EzTaxon accession number.

2.3.4 对MS-4鉴定结果的分析

MS-4菌株在LB 琼脂平板中培养24 h后, 形成5.0 mm 左右的菌落, 菌落扁平圆形, 表面略干燥, 灰白色, 不透明, 革兰氏染色阳性, 扫描电镜下与常见枯草芽孢杆菌形态相差不大, 这些形态学特征表明该菌是芽孢杆菌, 但未能确定该菌的种属; 生理生化实验结果表明, 该菌株能耐受7%氯化钠, 能水解明胶、淀粉、酪素, 能利用D-氨基葡萄糖、糖原、麦芽三糖、D-海藻糖、D-核糖为碳源, 不能利用菊粉、D-甘露糖、L-鼠李糖、D-半乳糖、甘露醇和木糖, β -甘露糖苷酶、β -甘露糖苷酶、接触酶、过氧化氢酶和β -N-乙酰氨基葡糖苷酶试验为阳性, 这些特征与蜡样芽孢杆菌高度相似, 相似度达到98.8%; 经过进一步的16S rDNA序列检测和序列比对后发现该菌与数据库中登录号为ATCC14579的一株蜡样芽孢杆菌相似率达到100%, 因此最终确定该菌为蜡样芽孢杆菌。

3 讨论

本实验从海泥中分离得到产葡萄糖氧化酶的蜡样芽孢杆菌MS-4, 说明海洋环境中存在产葡萄糖氧化酶细菌。MS-4的产酶能力比个别黑曲霉弱, 但也与一些黑曲霉产酶能力相近, 如朱运平等[6]从陆地土壤中分离得到的黑曲霉胞外产酶能力大于40 U· mL-1, 另外比一些海洋细菌的产酶能力强, 如石淑钰等[10]从黄海海域深6~30 m的海泥样品中分离筛选得到一株产葡萄糖的假单胞杆菌, 产酶能力为5.51 U· mL-1。本实验筛选的MS-4仅采用常规的LB液体培养所得发酵原液达到8.80 U· mL-1, 具有相对较高的产酶能力。

另一方面, 目前利用黑曲霉等真菌生产的酶最适作用温度在30 ℃左右, 低于20 ℃活性大大降低[16], 不适宜于低温保藏食品, 而MS-4产生的葡萄糖氧化酶最适作用温度较低, 在14 ℃左右, 在低至4 ℃时仍保持约67%的活力效果, 并且在中性条件下作用效果最佳, 适合食品尤其水产品的冷藏保鲜, 因此MS-4具有潜在的开发利用价值, 可通过产酶条件优化提高其产酶能力, 为葡萄糖氧化酶的生产提供新型的菌株。

(责任编辑 张 韵)

The authors have declared that no competing interests exist.

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