作者简介:陈兵(1990—),男,四川遂宁人,硕士研究生,研究方向为实验动物疾病模型研究。E-mail: cbing13@163.com
探究人工感染条件下,鸭源小鹅瘟病毒QH-L01株对樱桃谷雏鸭各器官组织病理学变化的影响,以期阐明QH-L01的病理发生规律及特征。实验组以每只0.2 mL(106.54 ELD50)的剂量肌肉接种30只2日龄樱桃谷肉鸭鸭源小鹅瘟病毒,对照组的鸭接种等量的灭菌生理盐水,分别在1、3、6、9 d观察各组织器官的病理变化。感染后1 d,先出现肺点状出血,部分肺小叶扩张,十二指肠、回肠和盲肠等肠道组织绒毛上皮细胞坏死脱落。感染后3 d,脑、肾、胸腺、法氏囊出现病理变化,十二指肠、回肠和盲肠等肠道组织绒毛和黏膜层轻度坏死、脱落。感染后6 d,脾脏淋巴细胞增多,十二指肠、回肠和盲肠等肠道组织绒毛和黏膜层中度坏死、脱落。感染后9 d,各组织病变减轻或者恢复正常。整个感染期死亡率为20%。
In the present study, the histopathological changes of various organs of Cherry Valley ducklings were explored under the condition of artificial infection, to clarify the pathogenesis and characteristics of duck-origin goose Parvovirus strain QH-L01. Thirty Cherry Valley ducks in experimental group were intramuscularly inoculated with 0.2 mL of 106.54 ELD50 duck-origin goose Parvovirus strain, and the ducks in the control group were intramuscularly inoculated with 0.2 mL of sterilized normal saline per duck, to observe the pathological changes of various tissues/organs in each infective stage at 1, 3, 6, 9 d, respectively. On the 1st day after infection, the lungs appeared punctate hemorrhage, partial lobular expansion, and intestinal tissue villous epithelial cells necrosed. On the 3rd day after infection, brain, kidney, thymus, bursa fabricius showed pathological changes, and villus of duodenum and ileum slight necrosed, mucosa layer of cecum appeared slight necrosis. On the 6th day after infection, lymphocytes in spleen increased, moderate necrosis was detected in villus of duodenum, ileum and mucosa layer of cecum. On the 9th day after infection, the lesions were reduced or returned to normal. The mortality rate was 20% during the whole infection period.
鸭短喙与侏儒综合征(beak atrophy and dwarfism syndrome, BADS), 是由鸭源小鹅瘟病毒(duck-origin goose Parvovirus, D-GPV)引起的以樱桃谷雏鸭生长不良、胫骨短而厚、上下喙变短、舌头外伸为特征的疾病[1]。该病是近年来我国樱桃谷鸭新发生的一种疾病, 据学者研究, 其病原为小鹅瘟病毒变异株, 与小鹅瘟病毒经典株、番鸭细小病毒相比, 该病毒感染率和死亡率均较低[2, 3]。1971年, 法国首次报道番鸭中有该病的发生[4]。此后在我国台湾也暴发BADS疫情[5]。2015年, 江苏、安徽、四川等地最早报道该病的发生[6]。随后的3年间, BADS发病区域不断扩大, 给中国樱桃谷肉鸭养殖企业造成了巨大的经济损失。目前, 有关D-GPV对樱桃谷鸭的病理学研究大多仅限于自然病例报道[6, 7]。自然病例具有随机单一性和不可控的多重感染和继发感染, 同时发病程度因个体差异而存在较大不同, 导致病理变化不具有代表性, 同时也不能发现病毒侵染损害器官的作用规律。为此, 拟通过人工感染的可控方式感染樱桃谷雏鸭, 并动态选取各器官进行组织病理学观察, 以期阐明D-GPV的病理发生规律及特征, 旨在为D-GPV人工感染樱桃谷雏鸭的致病机制研究提供科学的理论依据, 也为本病的临床诊断和综合防治提供进一步的科学依据。
1.1.1 病原
鸭源小鹅瘟病毒QH-L01株, 由本实验室于2016年从四川邛崃某樱桃谷鸭场分离鉴定得到[8], 樱桃谷鸭胚尿囊液ELD50为10-6.54· 0.2 mL-1。
1.1.2 主要试剂及仪器
4%(质量分数)多聚甲醛, 75%(体积分数)乙醇、85%(体积分数)乙醇、95%(体积分数)乙醇、100%(体积分数)乙醇、苏木素、伊红、二甲苯、苯蜡、蜡、包埋蜡、超薄切片机。
1.2.1 实验动物分组及处理
60只健康的2日龄樱桃谷雏鸭, 购买于成都新太丰农业开发有限公司。随机分为2组:实验组30只, 每只肌肉注射鸭胚尿囊液0.2 mL(106.54 ELD50); 空白对照组30只, 每只肌肉注射生理盐水0.2 mL。
1.2.2 被检材料采取
实验组雏鸭分别于QH-L01株感染后1、3、6、9 d剖杀取材, 并进行系统的病理学检查, 每次随机抽取5只雏鸭, 颈动脉放血处死, 快速采取心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、腺胃、十二指肠、空肠、回肠、胰腺、盲肠、法氏囊、胸腺、大脑、食道等组织器官, 迅速用4%多聚甲醛溶液固定。对照组在相同时间剖杀2只, 并取同样脏器。
1.2.3 剖检观察
对D-GPV感染的雏鸭进行剖检检查, 记录病理解剖学变化。
1.2.4 病理组织学观察
经4%多聚甲醛缓冲液固定后的组织块, 常规石蜡包埋、切片(5 μ m), 苏木素-伊红染色, 进行病理组织学观察。
将QH-L01接种2日龄健康樱桃谷雏鸭。感染后1 d, 部分鸭张口呼吸; 感染后3 d, 部分鸭呼吸困难, 抑郁, 精神委顿, 拉稀, 鼻孔多有分泌物, 1只患鸭死亡; 感染后6 d, 4只患鸭死亡, 实验组较对照组生长缓慢, 3只鸭见胫骨稍肿胀; 感染后9 d, 1只患鸭死亡, 实验组患鸭较对照组瘦小。对照组樱桃谷雏鸭均未出现典型的临床症状。发病死亡鸭统计结果见表1。
QH-L01株感染雏鸭后, 肺、肝、小肠、盲肠及脾脏均表现出明显的病理变化, 主要表现为出血、充血及实质细胞坏死。出血、充血表现为组织器官被膜或者黏膜面血管数量增多, 实质细胞坏死主要体现为胰腺、脾等器官体积缩小, 表面局部色泽暗淡, 呈褐色。
肺。感染后1 d, 肺脏呈鲜红色、质地柔软; 感染后3~6 d, 肺体积缩小, 肺脏充血, 切面有稀薄泡沫血液流出; 感染后9 d, 肺脏病理剖检未见明显的异常。
肝。感染后1 d, 肝脏呈淡黄色, 稍肿大, 表面光滑; 感染后3~6 d, 肝脏体积肿大, 局部肝脏呈褐色, 被膜紧张, 表面有出血点或出血斑; 感染后9 d, 肝脏病理剖检未见明显的异常。
脾。感染后1 d, 脾脏为粉红色, 背面平, 腹面凹, 呈不规则圆形; 感染后3~6 d, 脾脏颜色暗淡, 局部呈现褐色, 体积缩小; 感染后9 d, 脾脏未见明显的病理剖检变化。
肾。感染后1 d, 肾脏呈红褐色长条扁豆状, 质地柔软; 感染后3~6 d, 肾脏表面散在有出血点, 质脆易碎; 感染后9 d, 肾脏病理剖检未见明显的异常。
腺胃。感染后1~9 d, 腺胃病理剖检未见明显的异常。
胰腺。感染后1 d, 胰腺呈淡黄色; 感染后3~6 d, 胰腺呈苍白色, 质地易碎, 长度稍变短, 体积缩小; 感染后9 d, 胰腺呈苍白色。
十二指肠。感染后1 d, 十二指肠可见肠道轻度肿胀, 浆膜面潮红, 有散在出血点; 感染后3~6 d, 十二指肠严重肿胀, 黏液性分泌物增多, 部分鸭可见肠腔积液, 有少量脱落的肠上皮细胞的坏死物; 感染后9 d, 十二指肠剖检的病理学变化逐渐减轻。
回肠。感染后1 d, 回肠病理剖检未见明显的异常; 感染后3~6 d, 回肠肿胀、充血, 有稍许黄色液体附着在黏膜表面, 局部出血斑; 感染后9 d, 空肠轻度肿胀, 程度变轻。
盲肠。感染后1 d, 盲肠未见明显的病理剖检变化; 感染后3~6 d, 盲肠肿胀, 肠腔积液呈褐色, 黏液性分泌物增多, 黏膜面潮红, 有充血或瘀血斑; 感染后9 d, 盲肠症状稍减轻。
法氏囊。感染后1 d, 法氏囊呈白色, 褶皱明显; 感染后3~6 d, 法氏囊体积略有缩小, 质地变软; 感染后9 d, 法氏囊未见明显的病理剖检变化。
胸腺。感染后1~9 d, 胸腺病理剖检未见明显的变化。
脑。感染后1 d, 未见明显的病理学形态变化; 感染后3~6 d, 局部轻微脑膜充血, 稍肿胀; 感染后9 d, 仅可见脑膜稍肿胀。
心、食管、气管、空肠、胸腺。感染后1~9 d, 均未见明显的病理剖检变化。
对照组樱桃谷雏鸭组织器官病理剖检未见明显的异常。
肺脏。感染后1 d, 肺呈点状出血, 部分肺小叶扩张; 感染后3 d, 肺萎缩, 肺小叶数量显著减少, 结构紊乱, 肺小叶管腔代偿性扩张(图1); 感染后6 d, 肺有灶性间质细胞增生, 肺小叶数量减少; 感染后9 d, 肺呈灶性出血、肺毛细管数量显著减少, 肺小叶腔扩张。
十二指肠。感染后1 d, 十二指肠肠绒毛顶端上皮细胞坏死; 感染后3~6 d, 十二指肠肠绒毛中度坏死脱落; 感染后9 d, 十二指肠上皮细胞糜烂。
回肠。感染后1 d, 绒毛顶端轻度坏死脱落; 感染后3~6 d, 绒毛顶端上皮坏死, 固有层淋巴细胞数量增加; 感染后9 d, 回肠绒毛坏死, 甚至消失, 大量炎性细胞浸润。
盲肠。感染后1 d, 盲肠结构正常; 感染后3~6 d, 盲肠局部黏膜顶端坏死、脱落, 淋巴细胞增多; 感染后9 d, 盲肠固有层细胞增多, 结构基本正常。
结直肠。感染后1 d, 结直肠结构正常; 感染后3~6 d, 结直肠黏膜顶端糜烂、脱落; 感染后9 d, 结构基本正常。
肝。感染后1 d, 肝脏结构正常, 肝细胞内含大量胚胎时期吸收卵黄形成的脂肪滴; 感染后3 d, 肝细胞肿胀, 少量肝细胞坏死; 感染后6 d, 肝索结构紊乱; 感染后9 d, 肝索单行排列, 肝血窦清晰可见。
脾。感染后1 d, 脾结构正常, 红髓白髓界限分明; 感染后3~6 d, 可见脾小结和淋巴细胞增多; 感染后9 d, 淋巴细胞增多。
肾。感染后1 d, 肾结构正常, 肾小管和集合管清晰可见; 感染后3~6 d, 肾轻度萎缩, 局部出血; 感染后9 d, 肾轻度萎缩, 肾小管管径变小。
胰腺。感染后1 d, 胰腺结构正常, 可见胰岛形成团索, 其间有丰富的有空毛细血管; 感染后3~6 d, 可见胰腺轻度肿胀; 感染后9 d, 胰腺腺管结构不清, 胰腺结构紊乱。
脑。感染后1 d, 脑组织轻度水肿, 脑膜出血; 感染后3~6 d, 可见脑膜下炎性细胞浸润; 感染后9 d, 局部脑膜下轻度炎性细胞浸润。
法氏囊。感染后1 d, 法氏囊结构正常; 感染后3~6 d, 法氏囊淋巴滤泡淀粉样变, 部分滤泡皮髓质分界不清; 感染后9 d, 法氏囊结构恢复正常。
此外, 心、食管、空肠、胸腺, 感染后1~9 d, 病理剖检均未见明显的异常。对照组樱桃谷雏鸭组织器官未见明显的组织病理学变化。
BADS是近年来主要影响樱桃谷肉鸭生产的流行性疾病之一, 其病原是鸭源小鹅瘟病毒。已报道的分离株有SDLC01株[9]、AH-D15株[6]、SD株[10]、SBDS-GPV M15株[11]等。本研究所用的QH-L01株系本实验室2015年7月分离自临床表现BADS症状的患鸭, 并且在2日龄樱桃谷鸭上成功复制出该病临床症状。
汪开毓[12]采用口服接种方式研究人工感染小鹅瘟的病理形态学变化, 杨金龙[13]发现口服和注射小鹅瘟病毒, 对小鹅瘟病毒在体内的增殖分布影响较小。为保证感染的统一性和接种剂量的准确性, 本研究采用2日龄樱桃谷肉鸭, 每只肌肉注射0.2 mL(106.54 ELD50)QH-L01。感染后患鸭临床症状主要表现为呼吸困难、委顿、拉稀、鼻孔有分泌物, 病理变化最突出的特征是肺萎缩、肺小叶数量显著减少、十二指肠肠道绒毛上皮细胞坏死脱落。殷冬冬等[6]的动物回归实验结果显示, 感染鸭脑实质血管充血, 肾、脾等有炎性细胞浸润。陈浩等[7]对临床14日龄发病鸭进行组织切片, 结果显示, 胸腺组织水肿, 肾小管间质出血, 肾小管腔狭窄等病理变化。武世珍等[14]对患鸭血液指标研究发现, 感染鸭肾脏功能不全, 肠道有不同程度损伤。本研究中, 脑、肾、脾和胸腺出现的病理变化与前述报道相似, 但本实验中肺、十二指肠、回肠、盲肠的病理变化更为明显。由此推测, 肺、十二指肠、回肠、盲肠、脑、肾等组织是该病毒的主要靶器官, 但仍需配合荧光定量PCR和免疫组化等实验来进行病毒定量和定位研究。
从不同时期剖杀雏鸭的组织学变化来看:感染前期(1 d), 主要损伤肺、肾、十二指肠; 感染中期(3— 6 d), 主要损伤脑、肾, 但同时刺激胸腺、法氏囊和脾淋巴细胞增殖; 感染后期(9 d), 肺、肾等部分受损伤器官功能逐渐恢复。临床报道[6, 10]显示, 患鸭表现出生长发育迟缓, 推测其可能的原因为患鸭感染前期肠道绒毛坏死脱落, 导致后期机体吸收营养物质能力下降。部分患鸭在接种QH-L01后第3天出现死亡, 死因推测为接种QH-L01株病毒后, 引起患鸭肺萎缩、呼吸困难, 从而导致死亡。宁康等[15]临床发现, 感染D-GPV引起的患鸭死亡率较低, 可能的原因是D-GPV在浸染樱桃谷鸭过程中, 刺激樱桃谷鸭体内胸腺、法氏囊和脾等免疫器官淋巴细胞增多, 使其机体免疫功能增强, 进而可以杀灭肺、肾和脑等组织/器官中鸭D-GPV或者抵抗组织/器官中D-GPV的侵染。据陈翠腾等[16]报道, D-GPV和鹅细小病毒(GPV)同源性在95.6%以上。但研究发现, 本病毒除引起肠道病变外, 前期还引起肺出现严重病理变化, 但导致肺出现病变的具体原因还有待进一步研究。
值得注意的是, 机体组织/器官出现损伤是多种原因相互作用的结果。病毒作为一种生物因子, 可产生毒素和代谢产物引起组织损伤, 也可通过炎症反应、变态反应引起损伤[17]。本实验中肺、肠道及脑等组织出现的损伤是由病毒在细胞内增殖或者产生毒素还是病毒入侵引起机体炎性抵抗造成的损伤, 还需做进一步研究。
The authors have declared that no competing interests exist.