中华绒螯蟹“水瘪子”病超微病理和病理生理研究
杨宗英1,2, 曾柳根1,*, 王玉兰1, 姚毅1, 侯玉洁1, 雷小青1, 许亮清1, 熊春贤1, 杨先乐2
1.南昌市农业科学院,江西 南昌 330038
2.上海海洋大学 国家水生动物病原库,上海 201306
*通信作者,曾柳根,E-mail: bingjianla2008@163.com

作者简介:杨宗英(1988—),女,河南驻马店人,博士研究生,助理工程师,主要研究方向为水产生物免疫学与病害控制。E-mail: lxyangzongying@163.com

摘要

采用透射电镜技术和生化分析等方法,对患“水瘪子”病病蟹的超微病理和病理生理进行研究。超微结构观察表明,病蟹肝胰腺、鳃、肌肉等组织细胞发生了不同程度的病变,主要表现为肝细胞变性、坏死,脂滴锐减,微绒毛肿胀、断裂,细胞内线粒体肿胀,内嵴紊乱、减少甚至消失形成空泡,内质网扩张或断裂为片层状结构;鳃上皮细胞角质膜变薄,细胞核异染色质化,角质层面伸出的指状突起破裂消失,上皮细胞顶膜形成的微绒毛杂乱、断裂甚至消失,角质膜下空腔增大,线粒体畸变,数量减少,内嵴减少,形成空泡,溶酶体数量增多,并与空泡和空泡化的线粒体形成自噬体,严重病变的鳃上皮细胞中出现细菌颗粒,未见包涵体等病毒样颗粒;肌肉的病变主要是肌纤维松弛、断裂,肌质网溶解消失或者形成小泡,线粒体数量减少、体积变小,细胞核固缩且边缘化。病理生理分析结果显示,病蟹血淋巴中血糖含量和谷草转氨酶活力显著高于健康蟹,碱性磷酸酶和谷丙转氨酶活力极显著高于健康蟹,甘油三酯的含量极显著低于健康蟹;病蟹肝胰腺中肝糖原含量极显著低于健康蟹,碱性磷酸酶和酸性磷酸酶活力显著低于健康蟹。

关键词: 中华绒螯蟹; “水瘪子”病;; 超微病理; 病理生理
中图分类号:S945 文献标志码:A 文章编号:1004-1524(2018)07-1137-12 doi: 10.3969/j.issn.1004-1524.2018.07.06
Ultramicroscopical histopathology and pathophysiology of “Shuibiezi” disease of Eriocheir sinensis
YANG Zongying1,2, ZENG Liugen1,*, WANG Yulan1, YAO Yi1, HOU Yujie1, LEI Xiaoqing1, XU Liangqing1, XIONG Chunxian1, YANG Xianle2
1. Nanchang Academy of Agricultural Sciences, Nanchang 330038, China
2. State Collection Center of Aquatic Pathogen, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China
Abstract

Ultramicroscopical histopathological observations and pathophysiological analysis of Eriocheir sinensis with “Shuibiezi” disease were conducted by the transmission electron microscope technique and biochemical analysis. Ultramicroscopical histopathological results showed that pathological changes in different degrees were observed in gills, muscles and hepatopancreas of diseased crabs. The main pathological characteristics were degenerative and necrotic hepatic cells, decreased number of lipid droplets, and swelled or fractured microvillus. The swelled mitochondria showed abnormal appearance, such as swell, disorganization and reduction or vanish of the crista. The endoplasmic reticula were dilated or fragmented into lamellar structure. As for gills, the chitin layer became thinner, the cell nucleus of epithelial cells of gill was heterochromatinized, the finger shaped protuberance extended from the chitin layer was collapsed and disappeared, microvilli arranged disorderly and fractured or vanished, the sub-cuticular space was expended, the number of mitochondria was decreased and mitochondria was swelled or vacuolar with the decrease of crista, the number of lysosome was increased and lysosome formed autophagosomes with vacuoles and vacuolar mitochondria. Bacteria particles appeared in the severely changed gill epithelium, but no inclusions and other virions. The main pathological changes in muscle cells were relaxed and cracked muscular fibers, melted sarcoplasmic reticulum or formed many small bubbles, the number and volume of mitochondria decreased, and the nuclear was pyknosis and marginalized. Pathophysiological analysis results showed that glucose content and GOT activity in hemolymph of diseased crabs were higher than that of healthy crabs, ALP and GPT activities were significantly higher than those of healthy crabs, whereas triglyceride content was significantly lower than that of healthy crabs. As for hepatopancreas, the liver glycogen content of diseased crabs was significantly lower than that of healthy crabs, and ALP and ACP activities were lower than those of healthy crabs.

Keyword: Eriocheir Sinensis; “shuibiezi” disease;; ultramicroscopical histopathology; pathophysiology

中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)又称河蟹, 是我国特有的名特优水产品, 也是我国重要的养殖经济蟹类。随着20世纪80年代初期中华绒螯蟹人工繁育技术取得成功以后, 其繁育技术和养殖技术日趋成熟, 中华绒螯蟹的人工养殖发展迅速[1]。近年来, 随着养殖模式的不断改善和发展, 养殖产量也逐年上升。江苏省是中国中华绒螯蟹养殖大省, 2014年河蟹产值达到了40亿美元[2]。兴化市是江苏省重要的河蟹主养区, 所生产的河蟹具有金爪、黄毛、青壳、白肚的特点, 被授予中国“ 河蟹养殖第一县” 的称号, 然而, 2015年大面积暴发的中华绒螯蟹“ 水瘪子” 病对兴化市的中华绒螯蟹养殖业造成了沉重的打击, 兴化市80%以上的塘口出现了该病, 发病率达到30%~40%[3]。据文献[4]报道, 该病在2010年在江苏省就有发生, 但是当时发病率较低, 并未引起高度重视, 2015年该病的首次暴发使河蟹养殖户损失惨重。病蟹甲壳发黑、壳薄且脆, 肝胰腺颜色变淡、萎缩甚至糜烂呈糨糊状, 头胸甲积液, 附肢肌肉萎缩剪断附肢也有水状液体流出, 为此养殖户形象地称之为“ 水瘪子” 病[5]。之前报道的中华绒螯蟹肝胰腺疾病主要是中华绒螯蟹肝胰腺白化症, 病蟹主要表现的症状是肝胰腺发白, 发病期主要集中在10月份河蟹上市时, 且雄蟹的发病率明显高于雌蟹[6]; “ 水瘪子” 病蟹表现的症状主要是吃食减少或停止吃食, 肝胰腺颜色变淡、坏死, 发病期主要集中在5— 8月份, 雄蟹和雌蟹的发病率没有明显的差异[5]

本课题组之前对病蟹进行的寄生虫检查、病原微生物分离回感、无菌滤液回感及病变组织的电镜观察等病原学研究表明, 河蟹“ 水瘪子” 病为非病原性疾病, 是受到一些不利环境因素胁迫所导致的[7]。本文在之前研究成果的基础上, 利用生化分析和组织学等方法对采自中华绒螯蟹“ 水瘪子” 病流行区的病蟹进行超微组织病理和病理生理分析, 旨在了解该病的生理生化特征及在细胞水平了解该病的组织器官损伤, 为阐明该病的病理变化过程及探讨致病机制提供科学参考, 也为在养殖过程中对该病的防控提供一定的指导。

1 材料与方法
1.1 实验动物

实验用患病中华绒螯蟹采自江苏省兴化市安丰镇发病养殖塘, 规格为(107.20± 6.14)g, 健康蟹采自江苏省张家港市中华绒螯蟹养殖基地, 规格为(111.20± 6.10)g, 采样时间均为2016年10月份。所选用的病蟹主要临床表现为病蟹肝胰腺淡黄色或土黄色, 鳃丝水肿或稍发黑, 附肢发软, 附肢肌肉萎缩; 健康蟹肝胰腺呈橘红色, 肌肉饱满。

1.2 主要实验药物和器材

药品:丙酮(分析纯), 戊二醛(分析纯), 磷酸缓冲液(分析纯), 冰醋酸(分析纯), 二甲苯(分析纯), 无水乙醇(分析纯), 苦味酸均购买于上海国药集团; 锇酸(锇含量1%)购买于上海榕柏生物技术有限公司; 蜡块, 苏木精, 伊红, Epon 812树脂均购买于上海生工生物工程有限公司; 碱性磷酸酶(ALP), 酸性磷酸酶(ACP), 谷丙转氨酶(GPT), 谷草转氨酶(GOT), 糖原(Glycogen), 葡萄糖(GLU)和考马斯亮蓝总蛋白测试试剂盒均购买于南京建成生物工程研究所。

仪器:冷冻离心机(BECKMAN COULTER AgllegraX-15R)、紫外分光光度计(普析通用T6-新世纪)、组织匀浆机(IKA T18)、超薄切片机(LEICA UC7)、透射电镜(日立 HT7700)、酶标仪(BIOTEK ELX808)。

1.3 实验方法

1.3.1 血清生理生化指标的测定

将病蟹和健康蟹分别置于冰水混合物中麻醉, 用不加抗凝剂的注射器从河蟹第三步足基部抽取血淋巴, 4 ℃下, 4 024 g离心 30 min, 取上清液, 用于葡萄糖和甘油三酯含量, 碱性磷酸酶、谷丙转氨酶和谷草转氨酶活力的测定。

血清中上述指标的测定严格按照南京建成试剂盒使用说明书操作。其中ALP和TG的测定采用微量酶标法, ALP分解磷酸苯二钠产生游离酚和磷酸, 酚在碱性溶液中与4-氨基安替吡啉作用形成红色醌衍生物, 在520 nm处具有最大吸收峰, 其定义为100 mL血清在37 ℃与基质作用30 min 产生1 mg酚为一个酶活力单位, 最终结果转换为U· L-1; TG的测定采用GPO-PAP 酶法, 最终生成的醌类化合物颜色的深浅与TG的含量成正比, 在510 nm处具有最大吸收峰, 单位为mmol· L-1; GOT和GPT的测定采用赖氏法, 以卡门氏单位报告结果, 卡门氏单位的定义为1 mL血清, 反应液总容量3 mL, 340 nm波长, 1 cm光径, 25 ℃, 1 min内所生成的丙酮酸, 使NADH氧化成NAD+而引起吸光度每下降0.001为一个卡门氏单位, 1卡门氏单位=0.482 U· L-1, 最终GOT和GPT的单位均表示为U· L-1; 血糖的测定采用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法, 在505 nm处具有最大吸收峰, 单位为mmol· L-1

1.3.2 肝胰腺生理生化指标的测定

待病蟹和健康蟹麻醉, 抽取血淋巴后, 打开甲壳, 取少量肝胰腺, 分别称重后, 按照质量(g):体积(mL)=1:9的比例加入0.86%冰冷的生理盐水, 于冰浴中匀浆, 制备肝胰腺10%组织匀浆液。4 ℃, 4 024 g, 离心30 min, 取上清, 用于测定肝胰腺中总蛋白和肝糖原含量, 酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活力。

蛋白质分子具有-N H3+基团, 考马斯亮蓝显色剂上的阴离子可以与之结合, 最后使溶液变蓝, 在595 nm处可测出蛋白含量, 单位为g· L-1; 糖原在浓硫酸作用下可脱水生成糖醛衍生物, 后者再与蒽酮作用形成蓝色化合物, 在620 nm具有最大的吸收峰, 单位为mg· g-1; ACP和ALP的测定采用微量酶标法, ALP的定义为每g组织蛋白在37℃与基质作用15 min产生1 mg酚为一个酶活力单位, ACP的定义为每g组织蛋白在37 ℃与基质作用30 min产生1 mg酚为一个酶活力单位, 两者分别在520 nm处具有最大的吸收峰, 单位均为金氏单位· g-1pro, 1金氏单位=7.14 U· L-1, 最终ACP和ALP的单位表示为U· mg-1

1.3.3 超微病理

分别取15只病蟹和5只健康蟹的肝胰腺、鳃、肌肉等组织, 切成1~2 mm3的小块, 用2.5%戊二醛溶液前固定, 用0.1 mol· L-1磷酸缓冲液冲洗3次, 1%锇酸后固定, 0.1 mol· L-1磷酸缓冲液冲洗3次, 固定样品经酒精、丙酮梯度脱水, Epon 812树脂包埋, 制备超薄切片, 透射电镜观察, 观察病变组织的超微病理变化及可能存在的病原生物。

1.4 数据处理

试验所得数据用平均值± 标准差(mean± SD)表示; 病理生理指标均为3个样品的平均值, 采用Microsoft Office Excel 2007和SPSS 19.0对均值进行差异显著性检验, 显著水平设为P< 0.05, 极显著水平设为P< 0.01。

2 结果与分析
2.1 病蟹血清生理生化指标的变化

病蟹血清生理生化指标的变化见表1。病蟹血糖含量和谷草转氨酶活力为(18.54± 2.67 )mmol· L-1和(55.38± 3.44)U· L-1, 均显著高于健康蟹的(9.03± 1.14)mmol· L-1和(38.65± 5.78)U· L-1(P< 0.05); 病蟹血清碱性磷酸酶活力、谷丙转氨酶活力分别为(38.13± 4.07)U· L-1和(36.90± 2.05)U· L-1, 均极显著高于健康蟹的(24.85± 2.27)U· L-1和(26.66± 1.00)U· L-1(P< 0.01); 病蟹血清甘油三酯的含量为(0.73± 0.05)mmol· L-1, 极显著低于健康蟹的(0.87± 0.01)mmol· L-1(P< 0.01)。

表1 病蟹和健康蟹血清生理生化指标的比较 Table 1 Comparison of physiological and biochemical indexes of serum between diseased and healthy E. sinensis
2.2 病蟹肝胰腺生理生化指标的变化

病蟹肝胰腺生理生化指标的变化见表2。病蟹肝糖原的含量为(6.89± 0.81)mg· g-1, 极显著低于健康蟹肝糖原含量(15.30± 1.01)mg· g-1(P< 0.01); 病蟹碱性磷酸酶活性为(3.73± 0.25)U· mg-1, 显著低于健康蟹(4.94± 0.55)U· mg-1(P< 0.05); 病蟹酸性磷酸酶活性为(22.31± 0.31)U· mg-1, 极显著低于健康蟹(23.98± 0.35)U· mg-1(P< 0.01)。

表2 病蟹和健康蟹肝胰腺生理生化指标的比较 Table 2 Comparison of physiological and biochemical indexes of hepatopancreas between diseased and healthy E. sinensis
2.3 病蟹肝胰腺超微结构病理变化

河蟹的肝胰腺由无数肝小管组成, 肝小管是肝胰腺的结构和功能的基本单位, 肝小管的中央是管腔。每一肝小管都是由位于基膜上的单层柱状上皮细胞构成, 细胞核排列整齐, 细胞间界线清楚, 上皮细胞分为胚细胞(EC)、分泌细胞(BC)、吸收细胞(FC)和储存细胞(RC)。超微结构下, 正常蟹肝胰腺上皮结构完整, 管腔清晰, 细胞间边界清楚, R细胞管腔面具有发达且排列整齐的微绒毛, 脂滴丰富, 脂滴周围具有丰富的线粒体和内质网, 线粒体形状规则, 呈圆形或扁圆形, 外膜平整, 由内层膜折叠成的嵴排列紧密, 尤其以靠近细胞顶端微绒毛处的线粒体数量较多, 粗面内质网结构完整, 内质网上附着有大量的核糖体(图1-A、B)。

图1 病蟹和正常蟹肝胰腺超微结构
A, 正常肝细胞, 管腔(Lu)清晰, 微绒毛(Mv)排列整齐, 脂滴(LD)丰富, 线粒体(Mi)和粗面内质网(RER)丰富; 正常肝细胞, 细胞联结(J)清晰, → 指示Lu为管腔, Mv为微绒毛, LD为脂滴, J为细胞联结, Mi为线粒体, RER为粗面内质网; C, 轻微病变肝细胞, 细胞联结清楚, 微绒毛肿胀、断裂, 脂滴锐减, 线粒体肿胀、内嵴减少或空泡化; D, 严重病变肝细胞, 内质网肿胀或断裂为片层状, 部分细胞器破裂, 只剩残体, → 指示Rb为残余体; E, 严重病变肝细胞, 大部分细胞器肿胀破裂, 仅剩残体; F, 坏死肝细胞, 胞质完全降解, 肝细胞出现空泡坏死。
Fig.1 Hepatopancreas ultrastructure of diseased and healthy crabs
A, Normal hepatic cells, lumen (Lu) was clear, microvilli (Mv) arranged well, abundant lipid droplets (LD) , abundant mitochondria (Mi) and rough endoplasmic reticulum (RER); B, Normal hepatic cells, cell-cell junction (J) was clear, arrows point to lumen(Lu), microvilli (Mv), lipid droplets (LD), cell-cell junction (J), mitochondria (MI), rough endoplasmic reticulum (RER); C, Hepatic cells with mild histopathological changes, cell-cell junction was clear, swollen or fractured microvilli, decreased lipids droplets, mitochondria became swelling or vacuolar with the decreased crista; D, Hepatic cells with severe histopathological changes, swollen or fractured endoplasmic reticulum, some of the organelles were ruptured, some residual bodies appeared, the arrow points to residual bodies (Rb); E, Hepatic cells with severe histopathological changes, most of the organelles were swollen and ruptured and only the residual bodies was left; F, Necrotic hepatic cells, the cytoplasm was completely degrade and led to hepatic cells necrosis.

轻微病变肝胰腺, 细胞间联结清楚, 微绒毛肿胀、断裂、空泡化, R细胞中脂滴数量锐减, 线粒体肿胀变形呈不规则状, 内嵴减少, 部分线粒体大半体积或者整体呈空泡状(图1-C); F细胞中粗面内质网肿胀变形, 内质网部分断裂, 出现一定数量的空泡(图1-D), 肝胰腺病变严重者, 肝细胞内线粒体、内质网等细胞器大部分肿胀破裂, 仅剩残体(图1-E), 或者胞质完全降解, 肝细胞出现空泡化坏死(图1-F)。

2.4 病蟹鳃组织超微结构病理变化

中华绒螯蟹每条鳃都由具有支撑和运输功能的鳃轴及向两侧发出的相互平行的鳃叶构成, 正常鳃叶由外向内分别是角质膜, 上皮细胞层和鳃腔, 其中网状的鳃腔由上皮细胞和柱状细胞共同形成, 鳃腔中有曲折迂回的通道, 有少量游离的血细胞。超微结构下, 正常河蟹鳃上皮细胞, 细胞核结构完整, 核内染色体分布均匀, 细胞核周围有大量的线粒体; 角质层层面伸出许多指状突起; 上皮细胞顶膜具有丰富且排列紧密的微绒毛, 微绒毛基部具有规则的角质膜下空腔; 线粒体形状规则, 呈圆形或腊肠形, 外膜平整, 内膜向内折叠形成的嵴排列紧密(图2-A、B)。

图2 病蟹和正常蟹鳃组织超微结构
A, 正常鳃, 细胞核(N)形状规则, 核内染色质分布均匀, 线粒体(Mi)丰富且形状规则, 角质层面伸出许多指状突起(FSP);
B, 正常鳃, 微绒毛(Mv)丰富且排列紧密, 较少且排列规则的角质膜下空腔(Sc), → 指示N为细胞核, Cm为角质膜, Mi为线粒体, FSP指状突起, Mv为微绒毛, Sc为角质膜下空腔; C, 轻微病变鳃上皮细胞, 细胞核固缩, 染色质呈异染色质化; 角质膜变薄, 指状突起数量减少; 微绒毛减少, 排列疏松; 角质膜下空腔变大, 呈不规则状; 线粒体数量减少, 基质稀薄, 嵴减少, 部分线粒体肿胀, 甚至空泡化; D, 严重病变鳃上皮细胞, 细胞核高度异染质化, 边缘皱缩, 核膜模糊; 线粒体数量锐减, 部分细胞器呈现空泡化, 出现一定数量的溶酶体, → 指示Ly为溶酶体, Va为空泡; E, 坏死鳃上皮细胞, 指状突起大部分肿胀, 甚至破裂消失; 角质膜下空腔变大, 微绒毛几乎全部破裂消失; 大量线粒体空泡化, 溶酶体数量增多, 溶酶体和空泡化的线粒体或者小泡结合形成自噬体, → 指示AP为自噬体; F, 坏死鳃上皮细胞, 染色质散落, 核膜模糊, 部分断裂, 上皮细胞中出现细菌颗粒, → 指示BP为细菌颗粒。
Fig.2 Gill ultrastructure of diseased and healthy crabs
A, Normal gill, the shape of nuclear was regular, the chromatin in the nucleus was evenly distributed, a large number of mitochondria was uniform in size, many finger shaped protuberance extended from the cutin membrane; B, Normal gill, abundant microvilli (Mi) arranged tightly, a small number of sub-cuticular space (Sc) arranged orderly, arrows point to nuclear (N), Cutin membrane (Cm), mitochondria(Mi), finger shaped protuberance (FSP), microvilli (Mv), sub-cuticular space (Sc); C, The gill epithelial cells with mild histopathological changes, nuclear was condensed, chromatin was partly heterochromatinized; the cutin membrane became thin, the number of finger shaped protuberance decreased; reduced microvilli arranged loosely; the sub-cuticular space became large and irregular; the number of mitochondria decreased, some mitochondria was swollen with reduced cristae and matrix or instead by vacuoles; D, The gill epithelial cells with severe histopathological changes, the nucleus was shriveled and the nuclear membrane was blurred, chromatin was highly heterochromatinized, there was a marked reduction in the number of mitochondria, some organelles were vacuolated, a certain number of lysosome appeared, arrows point to Va(vacuole), Ly(lysosome); E, Necrotic gill epithelial cells, most finger shaped protuberance were swollen or collapsed and disappeared, almost all of the microvilli was ruptured and disappeared, most mitochondria changed to vacuole, the number of lysosome increased and formed autophagosomes with vacuoles or vacuolar mitochondria, the arrow points to autophagosomes (AP); F, Necrotic gill epithelial cells, The chromatin was dispersed, the nuclear membrane was indistinct and partly ruptured, bacteria particles could be found in the necrotic gill epithelial cells, the arrow points to bacteria particles (BP).

病变较轻的河蟹鳃上皮细胞, 细胞核固缩, 核内染色质呈异染色质化; 角质膜变薄, 角质层伸出的指状突起数量减少; 上皮细胞顶膜的微绒毛减少, 排列疏松; 角质膜下空腔变大, 呈不规则状; 线粒体数量减少, 基质稀薄, 由内膜形成的嵴减少, 部分线粒体肿胀, 甚至空泡化(图2-C); 病变严重者, 细胞核高度异染质化, 边缘皱缩, 核膜模糊; 细胞核周围线粒体数量锐减, 部分细胞器呈现空泡化, 出现一定数量的溶酶体(图2-D); 病变最严重者, 角质膜层伸出的指状突起大部分肿胀, 甚至破裂消失; 角质膜下空腔变大, 微绒毛几乎全部破裂消失; 大量线粒体空泡化, 溶酶体数量增多, 溶酶体和空泡化的线粒体或者小泡结合形成自噬体(图2-E); 上皮细胞中出现细菌颗粒(图2-F)。

2.5 病蟹附肢肌肉超微病理变化

中华绒螯蟹的附肢肌肉为横纹肌, 超微结构下, 可见正常蟹肌纤维排列整齐, 横纹清晰, 肌纤维间的肌质网丰富, 线粒体多且基质浓密, 由内膜折叠形成的嵴清晰可见(图3-A、B)。病变蟹附肢肌肉肌纤维松散, 部分肌纤维断裂, 肌质网部分解体, 形成小泡; 线粒体数量减少, 且体积变小; 部分肌细胞核呈高度异染色质化, 细胞核明显边缘化(图3-C、D)。

图3 病蟹和正常蟹附肢肌肉超微结构
A, 正常肌细胞, 肌纤维排列整齐, 肌质网丰富; B, 正常肌细胞, 线粒体多且内嵴排列紧密, MF示肌纤维、SR示肌质网、Mi示线粒体; C, 病变肌细胞, 肌纤维松散, 部分肌纤维断裂, 肌质网部分解体, 形成小泡; 线粒体数量减少, 且体积变小; D, 病变肌细胞, 部分肌细胞核呈高度异染色质化, 细胞核明显边缘化, N表示细胞核。
Fig.3 Appendage muscle ultrastructure of diseased and healthy crabs
A, Normal muscle cells, the muscle fibers arranged well, the sarcoplasmic reticulum was well-developed; B, Normal muscle cells, there were a large number of mitochondria and the cristae arranged closely, MF was muscle fibers, SR was sarcoplasmic reticulum, Mi was mitochondria; C, The muscle cells with histopathological changes, the muscle fibers arranged loosely and partly ruptured, the sarcoplasmic reticulum partly disintegrated and formed small bubbles, the number and volume of mitochondria decreased; D, The muscle cells with histopathological changes, some nucleus of muscle cells were highly heterochromatinized, the nucleus was obviously marginalized, N was nucleus.

3 讨论
3.1 生理生化变化

甲壳动物中常可选用组织中的葡萄糖[8, 9]、乳酸[9]以及血淋巴中的总脂、胆固醇、总蛋白、甘油三酯等指标含量的变化来评价机体的生理状况[10]。机体在应对环境胁迫时, 耗氧率升高, 机体对能量需求量增加[11], 研究表明虾类在应对胁迫时主要是利用碳水化合物作为能源[12], 当现存的碳水化合物不足以提供机体所需的能量时, 机体则通过改变代谢途径来满足机体能量需求, 主要是肌糖原或肝糖原分解为葡萄糖并运送至血淋巴[8, 13]。如果由糖原分解的葡萄糖仍旧无法满足机体需求, 机体将出现“ 代谢妥协” [14], 即机体将继续动用自身的肌肉蛋白和储存的脂肪来满足不断增加的能量需求, 甘油三酯是中华绒螯蟹血清总脂中重要的组分, 研究表明甘油三酯是虾卵、摄食前幼体、成虾的主要能源[15], 本研究中病蟹肝糖原和血淋巴中甘油三酯含量下降, 说明河蟹在环境胁迫下, 所需能量增加, 蟹体不仅要分解肝糖原功能, 还需动用脂肪来满足蟹体的能量需求。

磷酸酶在机体免疫, 细胞自溶以及分化中起重要的作用[16]。碱性磷酸酶和酸性磷酸酶是动物体内重要的酶类, 它们不仅可以分解正磷酸单酯为机体的磷代谢和核酸代谢提供磷酸基团[17], 而且与营养物质的消化吸收有关[18], 还有研究表明, 这两种酶是体内重要的解毒酶, 在抗氧化胁迫方面具有重要作用, 其活性高低可反映机体受危害的程度, 一旦水环境受到污染碱性磷酸酶的活力就会受到影响, 多种农药对鱼类和甲壳类碱性磷酸酶活性具有抑制效应[19, 20]。甲壳动物相关研究中已把碱性磷酸酶看作是一种检测甲壳动物免疫功能的指示酶[21, 22], 酸性磷酸酶常被用于检测生物体某些器官的病变情况[23]。本研究中病蟹肝胰腺中碱性磷酸酶和酸性磷酸酶活性均降低说明机体受到了危害, 同时也说明肝胰腺组织受到了损伤[23]

谷丙转氨酶主要存在于肝中, 谷草转氨酶主要存在于肝和心脏等组织细胞中, 这两种酶是动物细胞线粒体中重要的氨基转移酶, 在机体蛋白质代谢中起重要作用[24]。当组织损伤或中毒发生时, 会引起起细胞通透性增加, 导致细胞内两种酶大量外泄[25]。本研究中病蟹血淋巴中两种酶含量升高, 说明河蟹肝胰腺受到了损伤[26]。而血清中碱性磷酸酶主要来自于肝和骨骼, 是肝疾病损伤的辅助指标之一, 其呈上升趋势, 进一步说明了病蟹肝胰腺组织损伤, 功能受损[27]

3.2 超微病理变化

肝胰腺是甲壳动物重要的免疫消化器官[28], 肝胰腺中R细胞的主要功能是吸收和储存脂肪、糖原等营养物质以及进行胞内消化[29, 30, 31], 细胞内具有丰富的线粒体, 线粒体是合成ATP的重要场所, 其双层膜和线粒体内嵴在能量合成和电子传递中起重要作用[32]。线粒体还是对各种损伤最为敏感的细胞器之一, 其内膜皱褶形成的内嵴负责很多的生化反应, 病蟹线粒体肿胀, 甚至空泡化, 内嵴被破坏, 致使蛋白质合成受阻, 必然抑制细胞内的能量代谢活动。F细胞具有大量的粗面内质网和核糖体, 主要功能是合成和分泌消化酶[33, 34]。粗面内质网是细胞内一个精细的膜系统, 粗面内质网的主要功能是合成分泌性的蛋白质及多种膜蛋白、酶蛋白。病变肝胰腺F细胞中内质网肿胀, 断裂成大小不等的片段, 受损严重。粗面内质网受损势必会影响酶和其他蛋白质的合成及贮存, 导致各项生理活动无法正常进行, 机体免疫防御功能也会受到影响, 免疫力下降。中华绒螯肝胰腺F和R细胞顶端的微绒毛及微绒毛表面的黏膜对物质转运具有重要的作用, 随着新的营养物质进入到肝胰腺, 微绒毛表面旧的黏膜脱落, 新的黏膜形成, 如此反复, 丰富而排列整齐的微绒毛说明肝胰腺具有正常的生理功能[35], 病蟹微绒毛肿胀、断裂甚至消失, 说明肝胰腺的生理功能已经受损。病蟹肝胰腺这些超微病理变化和红螯光壳螯虾受到亚硝酸胁迫[36], 河蟹受到锌离子胁迫[37]、镉胁迫[38], 日本蟳受到硫化物胁迫[39]表现出的病理特征相似。

正常中华绒螯蟹每条鳃都由具有支撑和运输功能的鳃轴及向两侧发出的相互平行的鳃叶构成, 正常鳃叶由外向内分别是角质膜、上皮细胞层和鳃腔。河蟹的鳃具有调节渗透压、呼吸以及排泄等功能, 因其与水环境直接接触, 是阻挡病原的第一道防线, 易受到环境影响和病害损伤。上皮细胞是鳃的主要组成成分, 上皮细胞顶端形成丰富的微绒毛, 以增大上皮细胞的表面积, 同时鳃上皮细胞中丰富的线粒体有利于河蟹的呼吸[40]。中华绒螯蟹鳃上皮细胞是特化了的上皮细胞, 属于离子转运型上皮, 质膜内褶上具有丰富的Na+、K+-ATP酶, 与离子转运有关, 能够调节河蟹的渗透压和血液离子浓度[41, 42]。角质膜是河蟹鳃组织中阻止病原侵袭的屏障[40]。病变河蟹鳃角质膜变薄使得河蟹对各种病原感染及环境胁迫因子敏感, 微绒毛数量减少、破裂使鳃上皮细胞的表面积变小, 影响河蟹的呼吸功能; 线粒体等细胞器的肿胀、嵴减少或消失、空泡化可能是因为膜对钾、氯离子的渗透性增加的结果; 溶酶体数量增加, 并和空泡化的小泡和线粒体结合形成自噬体, 参与自噬作用, 最终使鳃组织结构受到不可逆转的损伤。这一结果也和吕晓燕等[36]对亚硝酸盐胁迫下红螯光壳螯虾(Cherax quadricarinatus), Xu等[39]对硫化钠胁迫下日本蟳(Charybdis japonica), 卢敬让等[43]对镉胁迫下中华绒螯蟹, Yang等[44]对铜离子胁迫下中华绒螯蟹鳃结构观察相似。

病蟹的附肢肌肉和肝胰腺及鳃相比, 病变较轻, 仅表现为肌肉萎缩, 肌纤维松弛, 肌质网水肿, 线粒体萎缩, 细胞核固缩且边缘化, 这一病理变化和营养因素导致的中华绒螯蟹肝胰腺白化症, 病理变化相似[45]

3.3 发病原因及致病机理

本研究在进行河蟹病变组织超微结构观察时, 未见包涵体等病毒性颗粒, 仅在发病严重的河蟹鳃组织中发现少量的细菌颗粒, 而关于可能病原细菌的分离回感, 作者已进行了分离回感试验[7], 经鉴定分别属于弧菌属、希瓦氏菌属和不动杆菌属, 回感健康河蟹未出现“ 水瘪子” 病样症状, 将发病早期的河蟹进行抗生素治疗也未见有任何效果, 且病蟹一般不容易出现死亡, 将病蟹剪碎直接饲喂健康蟹以及将病蟹和健康蟹混养, 健康蟹均未出现“ 水瘪子” 病, 由此可见河蟹“ 水瘪子” 病和病原关系不大。根据超微病理变化, 可见肝胰腺中脂滴数量减少, 肝细胞空泡化, 甚至最后出现坏死; 鳃上皮细胞受损与河蟹及其他甲壳动物受到重金属及各种不适理化因子胁迫时表现出的病理结构相似。

有研究表明, 甲壳动物在环境胁迫条件下, 会降低自身活动水平, 将自身储存的营养物质主要用于维持机体的基本生理代谢[46]。在胁迫状态下, 机体分解代谢加强, 合成代谢减弱, 导致有些营养物质耗竭, 此外, 环境胁迫还可以扰乱机体的正常生理状态, 从而导致其食欲下降[47, 48, 49], “ 水瘪子” 病蟹吃食量减少或停止摄食, 与这一病理特征相似, 随着胁迫时间的延长, 河蟹的主要免疫消化器官肝胰腺结构受损, 尤其是合成和分泌消化酶的F细胞受损, 进一步影响河蟹的摄食。病蟹肝胰腺超微结构观察可见病蟹肝胰腺R细胞中脂滴减少, 研究表明, 甲壳动物肝胰腺细胞的超微结构与其影响状态存在密切的关系[50, 51, 52], 当脂质营养缺乏时, 中华绒螯蟹肝胰腺R细胞中脂滴减少[53], “ 水瘪子” 病蟹在摄食量减少的同时, 脂质营养也相应缺乏, 从而出现了肝胰腺中脂滴减少的症状。环境胁迫会提高机体的耗氧率, 机体所需能量增加, 河蟹面对不断增加的能量需求, 肝脏和骨骼肌最先响应[54], 河蟹的肌肉组织主要分布在步足、螯和胸部, 是典型的骨骼肌, 肝胰腺中肝糖原降解以提供葡萄糖供能, 肌肉蛋白异化供能, 为此河蟹的附肢肌肉发生萎缩, 再加上病蟹摄食减少或停止, 使蟹体消瘦, 最终萎缩的附肢肌肉影响河蟹的活动能力, 病蟹表现为活力下降。在胁迫后期, 河蟹肝胰腺、鳃等组织病变坏死, 组织内的血淋巴液外渗, 同时大分子物质崩解入血, 使蟹体渗透压升高, 外界的水分进入蟹体, 病蟹甲壳内出现大量积液[55], 同时积液渗透附肢导致附肢积水。肝胰腺是中华绒螯蟹重要的消化免疫器官[28], 肝胰腺的病变影响了河蟹对营养物质的消化吸收, 使蜕壳后的蟹无法获得充足的营养物质, 从而导致甲壳软化。

(责任编辑 卢福庄)

The authors have declared that no competing interests exist.

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