泥鳅蛋白抗氧化肽的Plastein反应修饰研究
高丹丹1, 程浩1, 马忠仁1,2, 田晓静1, 李明生1,2, 陈士恩1, 常坤朋1, 刘根娣1,*, 娜扎瑞尔·亚哈亚3
1.西北民族大学 生命科学与工程学院,甘肃 兰州 730124
2.甘肃省动物细胞工程技术研究中心,甘肃 兰州 730030
3.马来西亚伊斯兰理科大学 理工学院,马来西亚 森美兰州 尼来新区 71800
*通信作者,刘根娣,E-mail: mymawanyun@163.com

作者简介:高丹丹(1983—),女,河南汝州人,博士,副教授,研究方向为食品生物技术。E-mail:gaodan0322@163.com

摘要

采用中性蛋白酶水解泥鳅蛋白制备抗氧化肽,以DPPH自由基清除能力为指标,用木瓜白酶对泥鳅蛋白抗氧化肽进行Plastein反应修饰研究。通过单因素试验研究了外源氨基酸种类、pH值、时间、E/S、温度和外源氨基酸的添加量对泥鳅蛋白抗氧化肽Plastein反应修饰的影响,在此基础上采用响应面法对泥鳅蛋白抗氧化肽Plastein反应修饰工艺进行了优化。结果表明,泥鳅蛋白抗氧化肽Plastein反应修饰的最佳条件为:底物浓度40%、组氨酸添加量为0.5 mmol·g-1、E/S为1 782.49 U·g-1 、pH值9.0、温度35 ℃、时间3 h,此条件下制备的Plastein反应修饰产物的抗氧化活性是修饰前的1.99倍,其对DPPH自由基的清除率为(77.98±0.08)%。

关键词: 泥鳅蛋白; 抗氧化肽; Plastein反应; 响应面
中图分类号:S98;TS201.2 文献标志码:A 文章编号:1004-1524(2018)08-1312-09
Modification of antioxidant peptide from loach protein by Plastein reaction
GAO Dandan1, CHENG Hao1, MA Zhongren1,2, TIAN Xiaojing1, LI Mingsheng1,2, CHEN Shi'en1, CHANG Kunpeng1, LIU Gendi1,*, NAZARIYAH Yahaya3
1.College of Life Science and Engineering, Northwest Minzu University, Lanzhou 730124, China
2. Engineering Technology Research Center for Animal Cell, Lanzhou 730030, China
3.Faculty of Science and Technology, Universiti Sains Islam Malaysia, Bandar Baru Nilai , Nilai, Negeri Sembilan 71800, Malaysia
Abstract

Loach protein was hydrolyzed by neutrase to prepare antioxidant peptide in this study. Plastein reaction was used to modify loach protein hydrolysates for enhancing the scavenging ability of DPPH free radical of peptides by papain. The influences of the types of added amino acids, the extrinsic glycine dose, the substrate/enzyme ratio, pH value, temperature and hydrolysis time on scavenging ability of DPPH free radical of the Plastein reaction modification of loach protein hydrolysates were investigated by using single factor analysis method. On this basis, the optimal technology conditions for Plastein reaction modification of antioxidant peptide from loach protein was obtained by response surface methodology. Results showed that the optimal conditions for Plastein reaction modification of antioxidant peptide from loach protein were as followings: substrate concentration at 40%, extrinsic dose of histidine at 0.5 mmol·g-1, E/S ratio at 1 782.49 U·g-1, pH at 9.0, temperature at 35 ℃, and reaction time at 3.0 h. The antioxidant activity of modified antioxidant peptide by Plastein reaction was about 1.99 times of original antioxidant peptide under this condition, and the scavenging ability of DPPH free radical was (77.98±0.08)%.

Keyword: loach protein; antioxidant peptide; Plastein reaction; response surface

自由基是一类可以单独存在于生物体中的含有一个或几个未配对电子的原子或原子团, 其氧化活性极高, 具有非常活跃的化学性质[1]。过多的自由基会破坏机体细胞的结构与功能, 从而引起如心脑血管病、关节炎、肿瘤、老年性白内障、肝病、肺病、扩张性心肌病、衰老等各种疾病[2]。抗氧化肽具有清除自由基的功能, 能够抑制或消除氧化反应, 利用抗氧化肽作为自由基清除剂来预防和治疗自由基诱发的疾病具有广阔的发展前景[3]。目前, 国内外学者大多采用蛋白酶直接将原料蛋白质水解的方法来制备抗氧化肽, 研究重点主要集中在不同底物蛋白质、水解酶的选择以及酶解条件的优化等方面[4, 5, 6, 7]。然而, 原料蛋白质的一级结构必定会限制和影响酶解法制备得到的抗氧化肽的一级结构和抗氧化活性, 为了打破这种限制, 有效提高抗氧化肽的抗氧化活性, 可以对其分子结构进行修饰处理。

Plastein反应又称类蛋白反应, 是Danilevski和Okuneff于1902年发现的。Plastein反应一般被认为是蛋白酶存在下蛋白质水解反应的逆反应, 通常分为水解、浓缩和合成三步进行[8], 是指在一定条件下, 蛋白酶催化高浓度的蛋白质水解物或低聚肽混合物, 生成沉淀、触变胶体或具触变性黏稠的胶状类蛋白产物的过程[9]。该反应的机理较为复杂, 可能涉及水解反应、浓缩作用、转肽作用、物理聚集中的一种或几种[10]。Plastein反应能够产生原料蛋白质所没有的新肽段, 其产物具有与原料蛋白质不同的氨基酸序列, 所以Plastein反应可以去除蛋白质水解物的苦味, 改善蛋白质的功能性质, 提高蛋白质的营养价值, 已成为食品工业研究的热点[11]。研究表明, Plastein反应修饰可以显著提高某些动植物蛋白源抗氧化肽的抗氧化活性。张强等[12]研究发现双孢蘑菇源抗氧化肽修饰产物的DPPH自由基清除能力大概是修饰前的4倍。王晗欣等[13]研究发现, 鹰嘴豆蛋白抗氧化肽修饰产物的还原力和羟自由基清除率都有显著提高。Zhao等[14]发现Plastein反应修饰可以提高大豆蛋白的抗氧化活性, 并采用响应面法优化修饰反应的工艺条件。但Plastein反应用于改善泥鳅蛋白源抗氧化肽的活性的研究还未见报道。因此, 本研究以泥鳅为原料提取泥鳅蛋白, 采用中性蛋白酶水解泥鳅蛋白制备抗氧化肽, 采用木瓜蛋白酶对泥鳅蛋白抗氧化肽进行Plastein反应修饰, 以期提高泥鳅蛋白抗氧化肽的抗氧化活性, 为天然高效抗氧化剂的制备提供一种新途径, 为泥鳅资源的综合开发利用提供理论依据。

1 材料与方法
1.1 材料

1.1.1 实验材料

泥鳅购于甘肃省兰州市城关区绿色市场; 木瓜蛋白酶(107 145 U· g-1)购于中生瑞泰科技有限公司; DPPH自由基购于美国Sigma公司; 酪氨酸、甘氨酸、亮氨酸、组氨酸、缬氨酸上海中泰化学试剂有限公司; 磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、邻苯二甲醛、无水乙醇、十二烷基硫酸钠、硼酸、硼砂、β -巯基乙醇、氢氧化钠、盐酸等均为国产分析纯。

1.1.2 主要仪器设备

JA2003N型电子天平, 上海天平仪器厂; PB-10型便携式台式酸度计, 北京格拉威尔公司; UV2000型紫外可见分光光度计, 龙泥柯仪器有限公司; JJ-2组织捣碎机, 江苏金坛市环宇科学仪器厂; WS28型电热恒温水浴锅, 西安禾普生物科技有限公司; TCL-16M型高速台式冷冻离心机, 湖南湘仪离心机仪器有限公司; 直立台式冻干机, 美国热电公司。

1.2 方法

1.2.1 泥鳅蛋白抗氧化肽的制备

鲜活泥鳅→ 预处理→ 捣碎成肉泥→ 5%(m/V)悬浮液→ 热变性处理(90 ℃水浴15 min)→ 冷却至室温→ 调节pH至7.0→ 中性蛋白酶水解(E/S为3 200 U· g-1, 温度25 ℃, 时间4 h)→ 加热灭酶(90 ℃水浴15 min)→ 调节pH至4.6→ 离心(5 000 r· min-1, 20 min)→ 收集中间清液→ 真空冷冻干燥→ 泥鳅蛋白抗氧化肽。

1.2.2 游离氨基含量的测定

采用邻苯二甲醛(OPA)法[15]

1.2.3 DPPH自由基清除能力的测定

吸取1 mL样品溶液于比色管中, 加入0.2 mL 0.4 mol· L-1 DPPH自由基溶液(无水乙醇配制), 再加入2.0 mL蒸馏水, 混匀反应体系, 室温下置于黑暗中反应30 min后于517 nm波长处测定吸光值; 以等体积无水乙醇代替DPPH自由基溶液作样品干扰实验; 以等体积蒸馏水代替样品溶液作样品对照试验, 计算DPPH自由基的清除率[16]

1.2.4 单因素实验设计

称取一定量的泥鳅蛋白抗氧化肽于试剂瓶中, 用蒸馏水配制成底物浓度为40%的悬浮液, 研究不同的外源氨基酸种类(按0.5 mmol· g-1的比例分别加入甘氨酸、亮氨酸、酪氨酸、组氨酸、缬氨酸)、外源氨基酸的比例(分别为0.3、0.4、0.5、0.6和0.7 mmol· g-1)、酶与底物浓度比E/S(800、1 600、2 400、3 200和4 000 U· g-1)、反应温度(25、35、45、55和65 ℃)、反应pH值(5.0、6.0、7.0、8.0和9.0)和反应时间(2.0、3.0、4.0、5.0和6.0 h)对Plastein反应产物游离氨基酸减少量和DPPH自由基清除率的影响, 每组实验重复3次。

1.2.5 响应面实验设计

根据单因素实验得到的结果, 采用响应面法设计实验, 运用Box-Behnken的中心组合实验, 选择对泥鳅蛋白抗氧化肽Plastein反应修饰中具有显著影响的三个因素:pH值(A)、时间(B)和加酶量(C), 采用三因素三水平的响应面实验设计, 见表1

表1 Box-Behnken试验设计 Table 1 Experimental design and variables levels for Box-Behnken

1.2.6 数据分析

采用F检验对响应面实验数据进行方差分析以评价模型的统计意义, 数据分析软件采用Design Expert 8.0。

2 结果与分析
2.1 单因素结果分析

2.1.1 外源氨基酸的筛选

DPPH自由基清除率测定是一种常见的有效评价活性物质抗氧化能力的方法, 其分子结构中有未成对的电子存在, 性质稳定, 在波长517 nm处有最大的吸收值, 其吸收值会随着其他自由基电子与它本身未成对电子的配对而降低, 且二者呈定量关系。在它与抗自由基活性物质相互作用时, 它的吸收值降低得越多, 则说明抗自由基活性物质的抗氧化活性越强[15]。游离氨基减少量则通常作为评价Plastein反应进行程度的指标, 其数值越大, 表明修饰程度越大, 反之则修饰程度越小。由图1可知, 加入5种外源氨基酸之后, 泥鳅蛋白抗氧化肽的修饰产物对DPPH自由基均表现出一定的清除活性。其中在加入组氨酸的情况下, 修饰产物的DPPH自由基清除率最高, 达到了(46.98± 0.78)%, 加入其他4种氨基酸所得的修饰产物与空白对照(39.16± 0.73)%相比, DPPH自由基清除能力都有所提高, 说明采用Plastein反应修饰可以提高产物的活性。在加入组氨酸的情况下, 体系中游离氨基减少量最多, 说明组氨酸对泥鳅蛋白抗氧化肽的修饰程度最大, 而该修饰产物对DPPH自由基的清除率最高, 因此选用组氨酸作为最佳的外源氨基酸。

图1 外源氨基酸种类对泥鳅蛋白抗氧化肽Plastein反应的影响Fig.1 Effect of extrinsic amino acid on Plastein reaction of antioxidant peptide from loach protein

2.1.2 外源氨基酸的比例对泥鳅蛋白抗氧化肽Plastein反应的影响

由图2可知, 外源氨基酸的添加量也是影响Plastein反应的重要因素之一。随着外源组氨酸添加量的增多, 修饰产物对DPPH自由基的清除能力先增大后减小, 反应体系中的游离氨基减少量除在外源组氨酸添加比例0.4 mmol· g-1时稍有降低外, 整体呈现出先增多后减少的变化趋势。当外源加入组氨酸的比例为0.5 mmol· g-1时, 修饰效果最好, 修饰产物对DPPH自由基的清除率也达到最大值(60.11± 1.66)%; 加入外源组氨酸比例低于0.5 mol· L-1时, 由于外源氨基酸添加量不足, 造成修饰程度不足, 影响修饰效果; 外源组氨酸加入比例高于0.5 mmol· g-1时, 则可能造成外源氨基酸过剩, 同样会使修饰产物的抗氧化活性降低。因此, 选择0.5 mmol· g-1为最佳外源氨基酸添加比例。

图2 外源氨基酸的添加量对泥鳅蛋白抗氧化肽Plastein反应的影响Fig.2 Effect of extrinsic glycine dose on Plastein reaction of antioxidant peptide from loach protein

2.1.3 酶与底物浓度比(E/S)对泥鳅蛋白抗氧化肽Plastein反应的影响

由图3可知, 随着木瓜蛋白酶添加量的增多, 修饰产物对DPPH自由基的清除率呈现出先增大后减小的趋势, 酶与底物浓度比为1 600 U· g-1时, 其抗氧化活性最高, 对自由基的清除率最大, 达到了(59.04± 0.86)%。反应体系中游离氨基减少量的变化则没有规律, 总体呈现出先增大后减小的变化趋势, 加酶量2 400 U· g-1时, 游离氨基酸减少量最多为(356.32± 9.21) μ mol· g-1, Plastein修饰程度最大, 但此时修饰产物对DPPH自由基的清除率仅有(49.29± 1.73)%。由此可以看出, 修饰产物对DPPH自由基的清除率和反应体系中游离氨基酸减少量并非总是能同步达到最大值。考虑到提高抗氧化活性和节约成本, 选择木瓜蛋白E/S为1 600 U· g-1作为响应面实验的中心点。

图3 加酶量对泥鳅蛋白抗氧化肽Plastein反应的影响Fig.3 Effect of neutrase dose on Plastein reaction of antioxidant peptide from loach protein

2.1.4 温度对泥鳅蛋白抗氧化肽Plastein反应的影响

由图4可知, 在一定温度范围内, 随着温度升高, 修饰产物对DPPH自由基的清除率和游离氨基的减少量都呈现出先增高后降低的趋势。反应温度为35 ℃时, 修饰产物对DPPH自由基的清除能力最强, 清除率达到了(58.69± 0.88)%, 低于或高于此温度, 其抗氧化活性都有不同程度的降低。而游离氨基酸的减少量在温度为45 ℃时达到最大, 为(342.05± 2.12)μ mol· g-1。蛋白酶的活性受反应温度影响较大, 每种酶都有各自的最适反应温度, 温度偏低或偏高, 都会对蛋白酶的活性产生一定的抑制作用, 从而影响Plastein反应的效果。因此, 选择35 ℃作为最佳反应温度。

图4 温度对泥鳅蛋白抗氧化肽Plastein反应的影响Fig.4 Effect of temperature on Plastein reaction of antioxidant peptide from loach protein

2.1.5 pH值对泥鳅蛋白抗氧化肽Plastein反应的影响

由图5可知, 随着pH值的增加, 泥鳅蛋白抗氧化肽的修饰产物对DPPH自由基的清除能力先增大后减小, 反应体系中游离氨基减少量则呈现出先增大再减少的变化趋势。pH值小于6时, 修饰产物对自由基的清除率均小于40%, 这可能是因为酸性环境抑制了中性蛋白酶的活性, pH值为8时, 其对自由基的清除率最大, 达到了(68.92± 0.88)%, 表现出较强的抗氧化活性, 且此时反应体系中游离氨基减少量达到了最大值, Plastein修饰程度最高。因此, 选择pH值8作为响应面实验的中心点。

图5 pH值对泥鳅蛋白抗氧化肽Plastein反应的影响Fig.5 Effect of pH on Plastein reaction of antioxidant peptide from loach protein

2.1.6 反应时间对泥鳅蛋白抗氧化肽Plastein反应的影响

由图6可知, 随着Plastein反应时间的延长, 泥鳅蛋白抗氧化肽的修饰产物对DPPH自由基的清除率先增大后减小, 反应体系中游离氨基减少量则呈现出先升高后降低的变化。反应时间2~5 h, 游离氨基减少量逐渐增大, 修饰程度随之提高, 产物对DPPH自由基清除率增加, 并在4 h时达到最大值(57.35± 0.94)%。反应5 h时, 体系中游离氨基减少量达到最大值(346.24± 2.88)μ mol· g-1, 随着反应时间的增加, 游离氨基酸的减少量变小, 说明游离氨基酸含量增加, 这可能是因为修饰产物在中性蛋白酶的作用下又发生了水解反应, 重新生成了相对分子质量较小的肽类物质, 修饰程度降低。因此本实验选择反应时间4 h作为响应面实验的中心点。

图6 时间对泥鳅蛋白抗氧化肽Plastein反应的影响Fig.6 Effect of time on Plastein reaction of antioxidant peptide from loach protein

2.2 泥鳅蛋白抗氧化肽的Plastein反应修饰响应面实验分析

2.2.1 多元二次方程模型的建立与检验

泥鳅蛋白抗氧化肽的Plastein反应修饰的响应面分析实验选择3个对修饰产物DPPH自由基清除率影响较显著的三个因素:pH(A)、时间(B)和E/S(C), 根据Box-Beknhen 中心组合试验设计原理, 设计三因素三水平的响应面实验。实验设计了17组处理, 其中包括5组中心点重复实验, 每组实验平行重复3次, 数据结果如表2所示。

表2 Box-Behnken 试验设计及实验数据结果 Table 2 Box-Behnken design matrix and the experimental result

利用Design Expert 8.0软件对表2中的实验数据进行多元回归拟合, 得到泥鳅蛋白抗氧化肽Plastein反应修饰产物DPPH自由基清除率的回归方程为:

Y=54.87+5.47A-7.75B-2.53C-0.74AB+6.31AC-2.30BC-2.11A2+10.60B2-13.18C2

响应面多元二次模型方差分析结果如表3所示。从表3数据可以看出, 本实验所选用的二次多项模型具有极高的显著性(P< 0.01), 说明本实验方法是可靠的, 该模型的二次方程可以用来模拟真实三因素三水平的分析。模型的失拟项在α =0.05水平上不显著(P=0.598 1> 0.05), 说明本实验的结果受未知因素的影响较小, 其决定系数R2为0.975 7, 校正决定系数 RAdj2为0.944 5, 说明该二次多项模型可以解释94.45%的响应值变化, 仅有总变异的5.55%不能用该二次多项模型来解释, 表明此模型的拟合度好, 用来对泥鳅蛋白抗氧化肽Plastein反应修饰过程进行优化是合适的。

表3 二次多项模型方差分析结果 Table 3 Variance analysis for the fitted quadratic polynomial model

该回归方程的回归系数的显著性检验结果如表4所示。从表4数据可以看出, 一次项A(P< 0.01)和B(P< 0.01), 二次项B2(P< 0.01)和C2(P< 0.01)在1%水平内显著, 一次项C(P< 0.05)在5%水平内显著, 表明在泥鳅蛋白抗氧化肽Plastein反应修饰过程中, pH值、时间和E/S这三个因素对修饰产物DPPH自由基清除率都有显著影响。交互项AC(P< 0.05)在5%水平内显著, 表明pH值和加酶量两因素的交互作用对修饰产物DPPH自由基清除率有显著的影响。

表4 回归方程系数显著性检验结果 Table 4 Regression coefficients and their significance of the quadratic model

2.2.2 响应面分析和优化

通过上述响应面二次多项回归模型方程的建立, 得出如图7所示的响应面的曲面图。通过该组动态图可以对任意两个因素交互作用影响修饰产物DPPH自由基清除率效应进行评价与分析, 并可以从中确定最佳因素的水平范围。交互作用影响效应的强弱和大小可以通过等高线的形状反映出来, 其形状越接近椭圆, 表示两种因素的交互作用影响越显著, 反之越接近圆形, 则表明两种因素的交互作用影响越不显著[17]

图7 pH值、时间和加酶量交互作用影响修饰产物对DPPH自由基清除率的曲面图Fig.7 Response surface plot for the effects of scavenging capacity on DPPH free radical of modified antioxidant peptide by Plastein reaction pH, time and neutrase dose

图7-A表示了pH值和反应时间修饰产物DPPH自由基清除率的交互作用的影响效应。由其等高线图可以看出pH值和时间的交互作用影响不显著。当把加酶量固定在0水平时, 随着反应时间的延长, 修饰产物对DPPH自由基的清除率先减小后增大。随着反应pH值的升高, 修饰产物对DPPH自由基的清除率呈现出增大趋势。pH值9.0, 反应时间3 h, 修饰产物对DPPH自由基的清除率达到最大值79.45%。由图7-A也可以看出反应时间对DPPH自由基清除率的曲线比较陡峭, 说明在反应过程中时间对修饰产物DPPH自由基清除率的影响大于pH值。

图7-B表示了pH值和加酶量对修饰产物DPPH自由基清除率的交互作用的影响效应。由其等高线可以看出pH值和加酶量的交互作用影响显著。当把反应时间固定在0水平时, 修饰产物对DPPH自由基的清除率随着pH值的升高而增大。随着加酶量的增多, 修饰产物对DPPH自由基的清除率先增大后减小, 加酶量1 600 U· g-1时, 修饰产物对DPPH自由基的清除率达到最大值, 随着加酶量的继续增多, 则有所减小, 可能是由于过量的蛋白酶会引发修饰产物发生二次水解, 使体系中抗氧化活性物质的数量有所减少, 从而影响修饰产物对DPPH自由基的清除率。pH值8.0, 加酶量1 600 U· g-1时, 修饰产物对DPPH自由基的清除率达到最大值58.56%。

图7-C表示了反应时间和加酶量对修饰产物DPPH自由基清除率的交互作用的影响效应。由其等高线可以看出反应时间和加酶量的交互作用影响不显著。当把pH值固定在0水平时, 随着反应时间的延长, 修饰产物对DPPH自由基的清除率先降低后升高。随着加酶量的增多, 修饰产物对DPPH自由基的清除率呈现出先增大后减小的趋势。反应时间3 h, 加酶量1 600 U· g-1时, 修饰产物对DPPH自由基的清除率达到最大值73.22%。

2.2.3 模型验证实验

根据Box-Behnken实验得到的结果和二次多项回归方程, 并利用 Design Expert 8.0软件, 获得本实验修饰产物对DPPH自由基清除率最高时的各因素的最佳反应条件为pH值9.0、反应时间3 h、E/S为1 782.49 U· g-1, 在此反应条件下, 修饰产物对DPPH自由基的清除率为78.03%。为了检验模型预测的可信度, 在此最佳反应条件下进行3次验证实验, 测得修饰产物对DPPH自由基清除率分别为77.98%、77.91%和78.07%, 平均值为(77.98± 0.08)%, 该实测值与理论值的误差小于± 1%, 由此可见该模型能较好地预测实际的泥鳅蛋白抗氧化肽Plastein反应修饰的情况。

3 结论

采用中性蛋白酶水解泥鳅蛋白制备抗氧化肽, 用木瓜蛋白酶对其进行Plastein反应修饰, 以DPPH自由基清除能力为指标评价其抗氧化活性, 以游离氨基酸的减少量作为Plastein反应程度的指标, 通过单因素试验研究了氨基酸种类、外源氨基酸添加量、E/S、pH值、温度和时间对泥鳅蛋白抗氧化肽Plastein反应修饰的影响, 并在此基础上采用响应面法优化了泥鳅蛋白抗氧化肽Plastein反应修饰工艺, 得到泥鳅蛋白抗氧化肽Plastein反应修饰的最佳工艺为:以木瓜蛋白酶催化泥鳅蛋白抗氧化肽与组氨酸反应, 反应体系pH值9.0、时间3 h、加酶量1 782.49 U· g-1、底物浓度40%、温度35 ℃、外源氨基酸比例0.5 mmol· g-1, 在此反应条件下测得泥鳅蛋白抗氧化肽Plastein反应修饰产物对DPPH自由基的清除率达到(77.98± 0.08)%, 是修饰前的1.99倍, 与响应面模型优化后得到的预测结果较吻合。本研究通过Plastein反应修饰的方法有效提高了泥鳅蛋白抗氧化肽的抗氧化活性, 为其作为天然高效抗氧化剂方面的开发奠定基础, 并为泥鳅资源的综合利用提供新途径。

The authors have declared that no competing interests exist.

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