黄果柑果实抗坏血酸、谷胱甘肽和有机酸积累特性
代琳1, 徐媛媛1, 熊博1, 黄胜佳1, 孙国超1,2, 汪志辉1,2,*
1.四川农业大学 园艺学院,四川 成都 611130
2.四川农业大学 果蔬研究所,四川 成都 611130
*通信作者,汪志辉,E-mail:wangzhihui318@126.com

作者简介:代琳(1990—),女,四川自贡人,硕士研究生,研究方向为果树栽培理论与技术。E-mail: 1217122209@qq.com

摘要

为探究黄果柑果实发育过程中抗坏血酸、谷胱甘肽和有机酸的积累特性及相关性,采用高效液相色谱法测定黄果柑果实有机酸和抗坏血酸的含量。结果表明:黄果柑果实发育过程中抗坏血酸的积累主要以AsA为主,含量为21.11~33.73 mg·100g-1;谷胱甘肽的积累以GSH为主,含量为58.99~186.37 μmol·L-1;果实中检测出7种有机酸,其中柠檬酸含量最高,为641.10~4 192.85 mg·100g-1,总体呈“降—升—降”趋势。T-AsA含量与AsA/DHA、GSH/GSSG呈极显著相关,说明AsA/DHA和GSH/GSSG氧化还原能力对T-AsA的积累和维持有重要作用;T-GSH含量与有机酸组分呈极显著正相关,表明有机酸和T-GSH之间呈相互促进的关系;果实中T-AsA和AsA含量对主成分的影响程度相对较大;通径分析表明,柠檬酸和草酸与T-GSH的直接通径系数最大,说明柠檬酸和草酸对T-GSH的积累作用显著。

关键词: 黄果柑; 有机酸; 抗坏血酸; 谷胱甘肽; 主成分分析; 通径分析
中图分类号:S666 文献标志码:A 文章编号:1004-1524(2018)08-1341-08
Accumulation characteristics of ascorbic acid, glutathione and organic acids in Huangguogan fruit
DAI Lin1, XU Yuanyuan1, XIONG Bo1, HUANG Shengjia1, SUN Guochao1,2, WANG Zhihui1,2,*
1. College of Horticulture, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China
2. Institute of Pomology and Olericulture, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China
Abstract

To study the accumulation characteristics and correlation of ascorbic acid, glutathione and organic acids in Huangguogan fruit during fruit development, contents of ascorbic acid, glutathione and organic acids in Huangguogan fruit were measured. The results showed that AsA was the the main component of ascorbic acid and GSH was the main component of glutathione during the fruit development, their contents were 21.11-33.73 and 58.99-186.37 μmol·L-1, respectively. Seven kinds of organic acids were detected in fruit, among which citric acid content was the highest, in the range of 641.10-4 192.85 mg·100g-1 with the trend of “down-up-down”. The results of correlation analysis showed that the correlations of T-AsA content to AsA/DHA and GSH/GSSG were significant at P<0.01 level, indicating that the redox capacity of AsA/DHA and GSH/GSSG played an important role in the accumulation and maintenance of T-AsA. There was a significant positive correlation between the organic acids and organic acids, indicating a mutually reinforcing relationship between these two indicators. Principal component analysis showed that the scores of T-AsA and AsA were the highest, with a value of 0.534, indicating that the effects of T-AsA and AsA on the principal components were relatively largest. Path analysis showed that the direct path coefficients with citric acid and oxalic acid to T-GSH were maximum and positive, indicating that citric acid and oxalic acid had a significant effect on the accumulation of T-GSH.

Keyword: Huangguogan; organic acid; ascorbic acid; glutathione; principal component analysis; path analysis

黄果柑属于芸香科(Rutaceae)柑橘属(Citrus), 是我国具有自主知识产权的天然杂交柑橘[1], 其果实原产于四川省雅安市石棉县, 翌年3~5月成熟, 具有极丰产、无核、酸甜适口、适应性强等优良性状[2, 3, 4]。黄果柑果实中有机酸(organic acid)和抗坏血酸(ascorbic acid, 亦称维生素C)是品质形成的重要因素, 其含量直接影响果实的内在品质[5]。有机酸作为植物的初生和次生代谢产物, 在植物机体发育过程的细胞渗透调节和平衡细胞内过量阳离子方面起重要的调控作用[6]。其中, 柑橘有机酸主要来自三羧酸循环的中间产物, 包括柠檬酸、酒石酸、奎宁酸等[7, 8, 9, 10]。植物体内还原型谷胱甘肽(glutathione, GSH)作为脱氢抗坏血酸(dehydroascorbate, DHA)的电子受体, 与还原型抗坏血酸(L-ascorbic acid, AsA)偶联形成AsA-GSH循环(Ascorbate-glutathione cycle)[11], 在植物体清除自由基、光保护、抵抗环境胁迫等方面起重要作用, 同时维持和平衡AsA和GSH的氧化还原能力[12, 13, 14]。该循环中抗坏血酸的降解代谢会导致有机酸的形成, 柑橘类主要形成草酸[13], 而草酸与抗坏血酸降解代谢的互作机理鲜有报道[15]。本试验主要探究黄果柑果实发育过程中抗坏血酸、谷胱甘肽与有机酸的积累特性, 为黄果柑果实提质增效提供一定的理论依据和实践基础。

1 材料与方法
1.1 试验材料

试验于2016— 2017年在四川省雅安市石棉县先锋镇黄果柑果园进行。选择9株健壮的黄果柑树(树势基本一致, 无病虫害, 8 a生, 生长状况良好且株行距3 m× 4 m)作为试验用树。从花后60 d开始, 每21 d采样1次, 共计采样13次。每次采样时, 在每棵树树冠外围同一高度(高约1.6 m)东、西、南、北、中5个方位随机各采1个果实, 每个样共5个果实, 置于干冰中带回实验室, 保存于-80 ℃冰箱备用。

1.2 试剂

标准品有柠檬酸、奎宁酸、苹果酸、富马酸、草酸、乳酸、丙酮酸和抗坏血酸, 均购自上海源叶生物科技有限公司; 抗坏血酸纯度在99%以上, 其他标准品纯度均在98%以上。谷胱甘肽试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 谷胱甘肽和抗坏血酸含量测定

总抗坏血酸(total glutathione, T-AsA)、AsA和DHA是黄果柑果实中抗坏血酸的主要组分。抗坏血酸提取参考李玉明等[16]的方法进行改进:称取混合黄果柑果肉样品0.5 g, 加0.2%偏磷酸研磨, 定容至6 mL, 4 ℃ 12 000 g离心15 min; 取上清液, 过0.22 μ m水性滤膜后, 取1 mL用于AsA测定; 取3 mL加入10 μ L 0.2 mol· L-1二硫苏糖醇黑暗处理4 h后, 用于T-AsA测定; DHA含量为T-AsA和AsA含量的差值。

抗坏血酸采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)测定, 色谱条件:安捷伦1260液相色谱仪, C18色谱柱(150 mm × 4.6 mm, 5 μ m), 柱温35 ℃, 流动相为甲醇和0.2%偏磷酸(pH 2.5)体积比为15:85, 流速1 mL· min-1, 进样量10 μ L, 243 nm波长处测定。

总谷胱甘肽(total glutathione, T-GSH)、氧化型谷胱甘肽(glutathione oxidized, GSSG)和还原型谷胱甘肽(GSH)是黄果柑果实中谷胱甘肽的主要组分。谷胱甘肽提取和测定采用南京建成生物工程研究所的试剂盒。

1.3.2 有机酸含量测定

有机酸提取参考李云康[17]的方法, 有机酸采用HPLC测定, 色谱条件:安捷伦1260液相色谱仪, C18色谱柱(150 mm × 4.6 mm, 5 μ m), 柱温25 ℃, 进样量10 μ L, 流动相为3%甲醇水溶液, 用磷酸调pH至2.6, 流速0.8 mL· min-1, 波长210 nm。最终含量以每100 g鲜质量中所含毫克数计, 以mg· 100g-1表示。

1.3 数据分析

用Excel 2003进行数据整理和图表制作, 采用SPSS 22.00软件, 以P< 0.05为显著水平, 对结果进行相关性、主成分和通径分析。

2 结果与分析
2.1 黄果柑果实发育过程中抗坏血酸含量变化

黄果柑果实抗坏血酸在5 min内被完全分离且效果较好, 根据样品与标准品的保留时间进行定性, 抗坏血酸的标准曲线线性含量范围均符合样品的含量。从图1可知, 黄果柑果实发育过程中抗坏血酸组分和含量均呈现明显的规律性变化, T-AsA、AsA和DHA含量分别为22.15~37.98、21.11~33.73和1.07~7.38 mg· 100g-1。AsA和DHA含量占抗坏血酸的比例分别为78.34%~95.30%、1.07%~7.38%, 表明AsA是黄果柑果实中抗坏血酸的主要存在形式。

图1 黄果柑果实发育过程中T-AsA、AsA和DHA含量变化
不同时间无相同小写字母表示差异显著(P< 0.05); 数据以鲜质量计。下同。
Fig.1 Changes of T-AsA, AsA and DHA contents during fruit development of Huangguogan
Values without the same lower letters at different time indicate significant difference at P< 0.05; Data was detected based on fresh weight. The same as below.

黄果柑果实发育期间, T-AsA、AsA和DHA含量随着果实发育均呈“ M” 变化趋势, 花后60~123 d(幼果期)逐渐上升; 花后123~165 d(膨大期)逐渐下降; 花后165~228 d(转色期)快速上升, T-AsA和AsA含量在花后228 d达到最大值, 分别为37.98和33.73 mg· 100g-1, DHA含量在花后249 d达到最大值7.38 mg· 100g-1; 花后228~312 d(成熟期)有所下降; DHA含量在花后291~312 d快速上升。说明T-AsA和AsA主要在果实幼果和转色期积累, 成熟后期DHA的氧化能力大幅度提高, 导致T-AsA和AsA含量下降。表明在果实成熟过程中抗坏血酸的氧化性不断提高, 而还原性逐渐下降, 从而影响T-AsA含量的积累, 导致抗氧化能力减弱。

AsA-GSH循环系统中AsA/DHA可以衡量抗坏血酸的氧化还原能力。由图2可知, AsA/DHA随着果实发育呈“ 降— 升— 降” 变化趋势, 花后60 d AsA/DHA最高, 为22.63; 花后60~123 d AsA/DHA迅速降低, 花后123 d达到最低值4.43; 花后123~165 d逐渐上升, 花后186~312 d缓慢下降。说明AsA/DHA氧化还原能力在幼果期快速降低, 果实膨大期缓慢升高, 成熟期相对较低。

图2 黄果柑果实发育过程中AsA/DHA变化Fig.2 Changes of AsA/DHA during fruit development of Huangguogan

2.2 黄果柑果实发育过程中谷胱甘肽含量变化

由图3可知, 黄果柑果实发育过程中T-GSH、GSH和GSSG含量分别为106.23~290.52、58.99~186.37和30.21~105.76 μ mol· L-1, GSH和GSSG含量占谷胱甘肽比例分别为53.42%~76.78%和23.21%~46.57%, 表明GSH是黄果柑果实谷胱甘肽的主要存在形式。

图3 黄果柑果实发育过程中T-GSH、GSSG和GSH含量变化Fig.3 Changes of T-GSH, GSSG and GSH content during fruit development of Huangguogan

黄果柑果实发育过程中T-GSH、GSH和GSSG含量均呈“ M” 型变化趋势。花后60~123 d上升, 花后123 d达到最大值, 分别为290.52、186.37、105.76 μ mol· L-1; 花后123~165 d下降, 其中, T-GSH和GSH含量在花后165 d降到最低, 分别为106.23、58.99 μ mol· L-1; T-GSH含量在花后165~207 d缓慢上升, 207~312 d相对稳定; GSH含量在花后228~249 d呈上升趋势, 其后缓慢下降; GSSG含量在花后165~207 d缓慢上升, 花后207~270 d缓慢降低, 花后270 d降至最低, 为30.21 μ mol· L-1, 其后缓慢上升。说明谷胱甘肽含量在黄果柑幼果期不断升高, 膨大期急剧下降, 在果实成熟时期相对稳定。

总体上, 花后60~228 d的GSH/GSSG较低, 为1.19~1.63; 花后228~270 d迅速上升, 花后270 d达到最高, 为2.31; 花后270~312 d急剧下降(图4)。说明果实幼果期至转色期谷胱甘肽氧化还原能力相对较低, 成熟期较高。

图4 黄果柑果实发育过程中GSH/GSSG变化Fig.4 Changes of GSH/GSSG during fruit development of Huangguogan

2.3 黄果柑果实发育过程中有机酸含量变化

在黄果柑果实发育过程中检测出了7种有机酸, 其均能在15 min内被完全分离。从图5得知, 黄果柑果实发育过程中有机酸组分含量差异显著, 总酸含量为1 350.31~7 731.14 mg· 100g-1; 柠檬酸含量最高, 为641.10~4 192.85 mg· 100g-1, 在总酸中占比47.48%~78.85%; 苹果酸、奎宁酸和乳酸含量分别为46.23~4 692.71、31.35~691.28和54.9~696.13 mg· 100g-1; 富马酸、草酸和丙酮酸含量均在55 mg· 100g-1以下。

图5 黄果柑果实发育过程中有机酸含量变化Fig.5 Changes of organic acid content during fruit development of Huangguogan

黄果柑果实发育过程中有机酸除了柠檬酸、乳酸和富马酸外, 其他酸含量总体呈“ L” 变化趋势。柠檬酸含量的呈“ 降— 升— 降” 变化, 在花后60~102 d急剧下降, 花后102~123 d上升, 花后123 d含量达3 100.34 mg· 100g-1, 花后123~228 d快速下降, 花后228 d含量降至最低, 为640.10 mg· 100g-1; 乳酸含量变化规律呈“ M” 趋势, 花后60~144 d含量急剧上升, 花后144~165 d呈下降状态, 花后165~207 d又快速上升且花后207 d达到最大值696.13 mg· 100g-1, 之后略有下降且保持相对稳定; 花后60~165 d奎宁酸含量急剧下降, 花后165~228 d保持相对稳定, 在花后228 d时降至最低值为31.35 mg· 100g-1, 其后呈上升趋势; 草酸、丙酮酸和苹果酸含量在花后60~102 d急剧下降, 花后102 d含量分别降至12.07、10.2和253.43 mg· 100g-1, 之后保持相对稳定; 在花后60~81 d, 富马酸含量急剧上升, 花后81 d含量达到最大值50.25 mg· 100g-1, 花后81~207 d下降, 花后207 d降至最低值15.30 mg· 100g-1。表明黄果柑中有机酸的积累以柠檬酸积累为主, 柠檬酸含量在果实发育前期逐渐降低, 在果实发育中后期保持相对稳定; 在果实发育前期其他组分逐渐下降, 果实发育中期逐渐上升, 但成熟期时有机酸各组分含量逐渐下降。

2.4 抗坏血酸、谷胱甘肽和有机酸含量的相关性

表1可知, 黄果柑果实发育过程中T-AsA、AsA与DHA含量均呈极显著正相关; DHA与GSH呈极显著正相关, 但T-AsA与T-GSH之间的相关性不显著; 抗坏血酸与GSH/GSSG、乳酸均呈极显著正相关, 与AsA/DHA、GSSG、柠檬酸、奎宁酸、苹果酸、草酸和丙酮酸均呈极显著负相关; T-GSH与GSSG、柠檬酸、奎宁酸、草酸和富马酸均呈极显著正相关, 与GSH呈显著正相关; GSSG与柠檬酸、奎宁酸和富马酸呈极显著正相关, 与草酸呈显著正相关, 但与GSH/GSSG呈极显著负相关; GSH与GSH/GSSG呈极显著正相关。有机酸各组分之间均呈极显著正相关, 而其他酸与乳酸呈极显著负相关; 富马酸与丙酮酸相关性不显著。

表1 抗坏血酸、谷胱甘肽和有机酸的相关系数 Table 1 Correlation coefficient of ascorbic acid, glutathione and organic acid
2.5 AsA-GSH循环中抗氧化物质和有机酸含量的主成分分析

表2可知, 第1主成分的贡献率最大, 为53.072%, 第2主成分的贡献率为17.416%, 第3主成分的贡献率为14.339%, 第4主成分的贡献率为7.768%。4个主成分的特征值大于1且累积贡献率达到92.594%, 综合了抗坏血酸、谷胱甘肽和有机酸含量的大部分信息。

表2 主成分的特征值及贡献率 Table 2 Eigenvalues and contribution of principal component

表3所示为4种主成分的载荷矩阵。第1主成分(F1)反映指标主要为苹果酸、草酸、丙酮酸、奎宁酸、乳酸和AsA/DHA; 第2主成分(F2)反映指标主要为柠檬酸、富马酸、GSSG和T-GSH; 第3主成分(F3)反映指标主要为GSH、GSH/GSSG和DHA; 第4主成分(F4)反映指标主要为AsA和T-AsA。利用数学模型对4个因子进行综合评价, 因子得分F1为0.128, F2为0.327, F3为0.341, F4为0.534, 综合得分为0.262; 说明AsA和T-AsA对主成分的影响相对较大。

表3 主成分载荷矩阵 Table 3 Loading matrix of principle components
2.5 谷胱甘肽和有机酸含量的通径分析

以T-GSH含量为因变量, 以柠檬酸、苹果酸、奎宁酸、草酸、乳酸、富马酸和丙酮酸为自变量进行通径分析, 把有机酸含量与T-GSH含量的相关系数分解为直接作用和间接作用, 以明确有机酸组分含量与T-GSH的效应大小。通过软件比对和筛选得出, 柠檬酸、草酸与T-GSH呈极显著正相关, 相关系数分别是0.806和0.537, 柠檬酸、草酸对T-GSH的直接通径系数分别为0.609、0.248, 间接通径系数分别为0.649和0.735(表4), 表明柠檬酸和草酸对T-GSH含量影响的直接和间接通径系数较大。

表4 黄果柑果实中柠檬酸、草酸和T-GSH含量的通径分析 Table 4 Path analysis of citric acid, oxalic acid and T-GSH contents in Huangguogan fruit
3 结论与讨论

有机酸和抗坏血酸是黄果柑果实品质形成的重要因素[18], 本试验通过优化HPLC方法, 较为精确地测定黄果柑果实发育过程中有机酸和抗坏血酸的含量。结果表明, 黄果柑果实发育不同时期各项物质含量存在显著性差异, 随着果实成熟, 在花后165~312 d, 有机酸和抗坏血酸各组分含量几乎全部呈现降低趋势。

黄果柑果实中共检测出7种有机酸, 以柠檬酸为主。果实发育过程中除乳酸以外, 其他有机酸总体呈不同程度的下降趋势, 这与高阳等[19]和文涛等[20]的研究结果基本一致。果实成熟时, 有机酸含量大小为柠檬酸> 奎宁酸> 苹果酸> 草酸> 丙酮酸> 乳酸, 这与Yamaki等[21]在脐橙上的研究结果不一致, 推测柑橘中不同品种间有机酸各组分含量的积累可能存在一定差异, 也表明随着黄果柑果实的逐渐成熟, 有机酸逐渐降解, 柠檬酸含量降解最多, 这可能与黄果柑果实发育不同时期的有机酸代谢途径有关。

黄果柑果实发育过程中AsA-GSH循环系统中抗坏血酸和谷胱甘肽存在的主要形式分别为AsA与GSH。随着果实发育, AsA/DHA氧化还原能力总体呈“ 降— 升— 降” 变化, 这可能是酸、酚类、类黄酮等代谢途径相互作用的结果。在果实发育前期抗坏血酸代谢抗氧化能力和GSH/GSSG氧化还原能力保持相对稳定, 成熟期呈“ 升— 降” 趋势, 说明伴随着果实成熟, AsA-GSH循环系统抗氧化能力逐渐减弱, 这与前人[22, 23]结果相似, 这可能是由果实AsA-GSH循环系统中抗坏血酸和谷胱甘肽的积累特性和遗传基因决定的。

T-AsA与T-GSH之间的相关性不显著, 抗坏血酸与AsA/DHA、GSH/GSSG均呈极显著正相关, 这表明AsA/DHA与GSH/GSSG对T-AsA的积累与维持有重要作用。这与侯长明[24]研究结果不同, 推测是黄果柑果实发育各时期AsA-GSH循环系统中氧化还原酶活性变化对T-AsA含量产生了影响。T-AsA与GSSG含量呈极显著负相关, 这与蒲飞[25]结果不一致, 这可能因为GSH是DHA再生的电子供体, T-AsA含量受DHA的调控, GSH含量变化间接影响T-AsA的含量, 而在谷胱甘肽代谢过程中GSSG与GSH所起的作用相反。T-AsA、AsA、DHA和有机酸中主要组分均呈显著负相关, 说明抗坏血酸和有机酸含量积累成反比, 为果实综合品质的衡量提供了一定的理论依据。

AsA和T-AsA对主成分的影响相对较大, 柠檬酸和草酸对T-GSH的影响较大, 而AsA与草酸呈极显著负相关, 说明有机酸对T-GSH含量的变化起着重要作用, 间接影响AsA含量。因此, 黄果柑果实发育过程中AsA降解可能导致草酸和柠檬酸生成, 这与前人[13, 15]研究结果不完全一致, 可能是因为属种之间的代谢途径不同, 代谢产物存在一定差异。柠檬酸与T-GSH含量的相关性鲜有报道, T-GSH与柠檬酸和草酸的具体互作机理还有待进一步研究。

The authors have declared that no competing interests exist.

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