引用本文
刘士力, 蒋文枰, 程顺, 迟美丽, 郑建波, 贾永义, 赵金良, 顾志敏. 翘嘴鲌生长激素基因侧翼2个微卫星位点与生长性状的关联分析[J]. 浙江农业学报, 2019,31(1): 62-68.
LIU Shili, JIANG Wenping, CHENG Shun, CHI Meili, ZHENG Jianbo, JIA Yongyi, ZHAO Jinliang, GU Zhimin. Correlation analysis of growth traits and two microsatellite polymorphisms in flanking region of growth hormone gene in topmouth culter ( Culter alburnus Basilewsky) [J]. ACTA AGRICULTURAE ZHEJIANGENSIS, 2019,31(1): 62-68.
  
Doi: 10.3969/j.issn.1004-1524.2019.01.08
Permissions
Copyright©2019, 《浙江农业学报》编辑部
《浙江农业学报》编辑部 所有
翘嘴鲌生长激素基因侧翼2个微卫星位点与生长性状的关联分析
刘士力1,2,3,4, 蒋文枰1, 程顺1, 迟美丽1, 郑建波1, 贾永义1,*, 赵金良2,3,4, 顾志敏1
1.浙江省淡水水产研究所 农业农村部淡水渔业健康养殖重点实验室/浙江省淡水水产遗传育种重点实验室,浙江 湖州 313001
2.上海海洋大学 农业农村部淡水水产种质资源重点实验室,上海 201306
3.上海海洋大学 上海水产养殖工程技术研究中心,上海 201306
4.上海海洋大学 水产科学国家级实验教学示范中心,上海 201306
*通信作者,贾永义,E-mail: yongyi_jia@163.com

作者简介:刘士力(1985—),男,湖北洪湖人,博士,助理研究员,主要从事水生动物遗传育种研究。E-mail:liushili1212@126.com

收稿日期: 2018-06-27
基金资助: 浙江省农业新品种选育重大科技专项(2012C12907-7,2016C02055-1); 浙江省淡水水产研究所开放课题(ZJK201508)
摘要

通过120尾同塘养殖翘嘴鲌体长和体质量的测定,以及生长激素基因( GH)侧翼的2个微卫星位点Cal-GH01和Cal-GH02基因型检测,分析了翘嘴鲌 GH基因侧翼的2个微卫星多态性与生长性能的相关性。结果表明:Cal-GH01共检测到3个等位基因(404、407和410 bp)和6种基因型,等位基因407 bp是优势等位基因,407/407 bp是优势基因型;该微卫星位点多态信息含量为0.420,观测杂合度为0.207 2,属中度多态性位点。Cal-GH02共检测到6个等位基因(366、375、378、381、384和387 bp)和11种基因型,等位基因381 bp是优势等位基因,381/381 bp是优势基因型;该微卫星座位多态信息含量为0.450,观测杂合度为0.466 1,属中度多态座位。微卫星位点Cal-GH01的分析结果表明,404/407型个体占样本数的13.3%,其体长最长。407/410型个体占样本数的5%,其体质量最大。Cal-GH01不同基因型个体体长和体质量均有差异,但差异均不显著( P>0.05)。在微卫星位点Cal-GH02中,366/381型个体占样本数的3.3%,其体长和体质量均最大,其体质量显著大于其他基因型个体( P<0.05)。384/387型个体占样本数的2.5%,其体长和体质量均最小,其体长显著小于其他基因型个体( P<0.05)。翘嘴鲌 GH基因多态性与生长性状存在关联,推测相关变异位点可作为翘嘴鲌生长的候选辅助标记。

关键词: 翘嘴鲌; 生长激素基因; 微卫星; 生长性状; 性状关联
中图分类号:S965.116;Q959.46+8 文献标志码:A 文章编号:1004-1524(2019)01-0062-07
Correlation analysis of growth traits and two microsatellite polymorphisms in flanking region of growth hormone gene in topmouth culter ( Culter alburnus Basilewsky)
LIU Shili1,2,3,4, JIANG Wenping1, CHENG Shun1, CHI Meili1, ZHENG Jianbo1, JIA Yongyi1,*, ZHAO Jinliang2,3,4, GU Zhimin1
1. Key Laboratory of Healthy Freshwater Aquaculture/Key Laboratory of Freshwater Aquatic Animal Genetic and Breeding of Zhejiang Province, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Zhejiang Institute of Freshwater Fisheries, Huzhou 313001, China
2. Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China
3. Shanghai Engineering Research Center of Aquaculture, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China
4. National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China
Abstract

The body length and weight of 120 topmouth culter ( Culter alburnus Basilewsky) cultured in the same pond were measured. The polymorphism information and correlation with growth traits of two microsatellite loci, Cal-GH01 and Cal-GH02, located in the flanking regions of the growth hormone ( GH) gene were analyzed. The results showed that three Cal-GH01 alleles (404, 407 and 410 bp) and six genotypes could be detected. The 407 bp allele was the dominant allele, and 407/407 bp was the dominant genotype. The polymorphic information content of the microsatellite locus was 0.420, and the heterozygosity was 0.207 2. A total of six alleles (366, 375, 378, 381, 384 and 387 bp) and 11 genotypes were detected for Cal-GH02. The 381 bp allele was the dominant allele, and 381/381 bp was the dominant genotype. The polymorphic information content of the microsatellite locus was 0.450, and the heterozygosity was 0.466 1, which made it a moderately polymorphic locus. The associations between the polymorphisms of the two loci and growth traits were analyzed using general linear models. The analysis results for microsatellite locus Cal-GH01 showed that 404/407-type individuals accounted for 13.3% of the sample size and had the longest body length. The 407/410-type individuals accounted for 5% of the sample weight and were the heaviest. There were some differences in body length and body weight among the Cal-GH01 genotypes; however, the differences were not significant ( P>0.05). For microsatellite locus Cal-GH02, 366/381-type individuals accounted for 3.3% of the number of samples, and their body length and body weight were the highest. Their weight was significantly higher than that of the other genotypes ( P<0.05). 384/387-type individuals accounted for 2.5% of the sample size, and their body length and weight were the lowest. Their body length was significantly lower than that of other genotypes ( P<0.05). In conclusion, we studied the genetic characteristics of two microsatellite loci in 120 fish sampled from the same pond. The correlation analysis for body length and body weight provided a scientific basis for marker-assisted selection for growth traits. Overall, there were associations between polymorphisms in the GH gene and the growth traits of C. alburnus. Therefore, the two microsatellite loci in GH gene could be used as markers for practical breeding programs for growth traits in C. alburnus.

Keyword: Culter alburnus; growth hormone; microsatellite; growth trait; genetic association

生长激素基因(growth hormone, GH)是影响动物生长性状的主效基因[1], 具有提高饲料转化率[2]、促进肌肉中的蛋白质合成[3]、加速鱼类骨骼纵向生长[4]等重要作用。作为生产性能的候选基因, 已经有不少学者在黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)[5]、猪(Sus scrofa)[6]、牛(Bos taurus)[7]、鸡(Gallus gallus)[8]等物种上做过研究, 并发现了一些与重要经济性状相关的多态位点。微卫星和小卫星存在于数种鱼GH基因的启动子或内含子中, 包括尖吻鲈(Lates calcarifer)[9]、牙鲆(Paralichthys olivaceus)[10]和金头鲷(Sparus aurata)[11]等。当串联重复序列位于基因的调控区域时, 它们可以直接影响其表达, 从而引起这些基因数量性状的变化[12]。正是这些序列重复数目和长度的不同导致了GH基因的多态性。

翘嘴鲌(Culter alburnus Basilewsky)是鲌亚科中体型最大的一种鱼类, 其肉白而细嫩, 味美而不腥, 具有重要的经济价值。翘嘴鲌又称翘嘴红鲌、白条鱼、大白鱼等, 广泛分布于中国各大水系[13]。此外, 翘嘴鲌是以活鱼为主食的凶猛肉食性鱼类, 对维持淡水水域生态系统的稳定具有重要作用。采用分子标记技术为辅助手段可以提供育种效率, 已开发了一些翘嘴鲌微卫星引物[14, 15], 但对于明确的重要功能基因的遗传标记研究较少, 暂未发现与生长性状显著相关的标记[16]。关于翘嘴鲌GH基因与侧翼区的序列已被报道[17], 翘嘴鲌GH基因内含子中不包含微卫星序列, 但在其侧翼两端各包含1个微卫星序列。本实验通过引物设计、PCR扩增、片段分型和数据分析, 研究这2个微卫星位点的遗传多样性, 并将微卫星基因型和翘嘴鲌的体长、体质量进行相关性分析, 以期为翘嘴鲌的微卫星特征研究提供理论依据。

1 材料与方法
1.1 材料

实验用翘嘴鲌采自浙江省淡水水产研究所综合实验基地, 为同塘养殖的翘嘴鲌个体, 且苗种来源于同一批次繁殖的后代。剪取少量尾鳍, 用无水乙醇消毒后于-20 ℃保存备用。

主要试剂:PCR反应试剂购自宝日医生物技术(北京)有限公司; 用于DNA提取的试剂购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

采用苯酚-氯仿法提取样本DNA。用1%琼脂糖凝胶检测提取DNA完整性, DNA原液于-20 ℃保存备用。

1.2.2 引物设计

根据GenBank公布的翘嘴鲌GH基因及其侧翼DNA序列(登录号:KX925976.1), 利用Primer 6.0软件设计2对特异性引物用于2个微卫星位点的扩增, 上游引物的5端加上Tail A碱基序列[18], 通用引物Tail A 5端用FAM进行修饰。具体引物序列见表1, 引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 翘嘴鲌GH 基因侧翼微卫星引物序列 Table 1 Primer sequences used for microsatellite amplification in the flanking regions of Culter alburnus GH gene

1.2.3 PCR反应体系

PCR反应体系20 μ L: PCR Mix 10 μ L, 模板DNA (10 ng· μ L-1) 1 μ L, 通用引物Tail A、上游和下游引物(10 μ mol· L-1)分别为0.2 μ L、0.2 μ L和0.4 μ L, 灭菌超纯水补足体系。

PCR反应程序:94 ℃ 5 min; 94 ℃ 30 s, 60 ℃ 90 s, 72 ℃ 30 s, 共35个循环; 60 ℃30 min; 4 ℃保存。

1.2.4 微卫星分型

PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行微卫星分型。

1.2.5 数据分析

采用POPGENE 1.3.1计算2个微卫星座位在该群体内的观测等位基因数(observed number of alleles, Na)、有效等位基因数(effective number of alleles, Ne)、观察杂合度(observed heterozygosity, Ho)、期望杂合度(expected heterozygosity, He)和多态信息含量(polymorphism information content, PIC)。运用SPSS 13.0的一般线性模型(general linear model, GLM)程序分析2个微卫星位点与翘嘴鲌体质量、体长的关系。显著性分析用单因素方差分析(ANOVA)的Duncan氏法进行多重比较, P< 0.05为差异显著。结果以平均值± 标准误表示。统计模型如下:

Yij =μ +Gi+eij

其中:Yij为生长性状第i个基因型第j尾个体的观测值, μ 为实验观测所有个体的平均值, Gi为微卫星标记第i种基因型的固定效应, eij为对应于观测值的随机误差。

2 结果与分析
2.1 翘嘴鲌GH基因侧翼微卫星位点

PCR扩增产物的电泳条带清晰、无杂带, 片段长度为300~500 bp, 其大小与预期结果一致。根据原始序列(GeneBank登录号:KX925976.1)设计的原始引物扩增PCR产物大小分别为392、366 bp, 加上使用的接头Tail A为15 bp, 预计扩增的产物大小为407、381 bp。2个微卫星位点在24个样本中的微卫星分型结果表明, 位点Cal-GH01检测到404、407和410共3种等位基因, 位点Cal-GH02检测到366、375、378、381、384和387共6种等位基因(图1)。这2个微卫星位点均为3碱基重复, 同一位点的不同等位基因之间的长度差异为3个碱基或其整数倍。因此, 判断PCR结果准确, 据此可初步确定获得正确的目的片段, 可用于后续分析。

图1 翘嘴鲌GH基因侧翼2个微卫星位点Cal-GH01和Cal-GH02的分型图
A-1和A-2为Cal-GH01; B-1和B-2为Cal-GH02。Fig.1 Genotyping map of microsatellite loci Cal-GH01 and Cal-GH02 in flanking regions of Culter alburnus GH gene
A-1 and A-2, Cal-GH01; B-1 and B-2, Cal-GH02.

2.2 等位基因频率和基因型频率

120尾翘嘴鲌GH基因侧翼2个微卫星位点上共检测到9个等位基因(表2)。微卫星座位Cal-GH01检测到3个等位基因, 分别为404、407和410 bp, 对应的微卫星核心重复次数分别是7、8和9次。其中, 等位基因407 bp的频率最高, 达到了70.8%, 等位基因404、410 bp的频率分别为16.2%和5.4%。微卫星座位Cal-GH02共检测到6个等位基因, 分别为366、375、378、381、384和387 bp, 对应的微卫星核心重复次数分别是7、10、11、12、13和14次。其中, 等位基因381 bp的频率最高, 达到了70.4%, 其次为等位基因384和387 bp, 其频率分别为12.5%和10.0%, 这3个等位基因为优势等位基因, 共占92.9%; 频率最小的为375 bp等位基因, 仅为0.4%。

表2 翘嘴鲌GH基因侧翼2个微卫星位点的等位基因频率 Table 2 Allele frequency of two microsatellite loci in flank regions of Culter alburnus GH gene

微卫星座位Cal-GH01中共发现6种基因型(表3), 其中407/407基因型的频率最高, 达到了61.7%, 其次为404/407和404/404基因型, 其值分别为13.3%和9.2%。404/410基因型的频率最低, 仅观察到1次。

表3 翘嘴鲌微卫星位点Cal-GH01和Cal-GH02不同基因型与生长性状的关联分析 Table 3 Association analysis between growth traits and different genotypes of Cal-GH01 and Cal-GH02 locus in Culter alburnus

微卫星座位Cal-GH02中共发现11种基因型(表3), 其中381/381基因型的频率最高, 达到了50.0%, 其次为381/384和381/387基因型, 其值分别为19.2%和14.2%。除了表格中列举的基因型外, 366/387和384/384基因型仅观察到2次, 366/378、375/381和387/387基因型仅观察到1次。

2.3 遗传多态性参数

遗传特性分析结果表明:翘嘴鲌GH基因Cal-GH01位点的期望杂合度(He)为0.381 0, 观测杂合度(Ho)为0.207 2, 其有效等位基因数(Ne)为1.611 1, 多态信息含量(PIC)为0.420 (0.250< PIC< 0.500), 属中度多态位点。Cal-GH02位点的期望杂合度(He)为0.461 3, 观测杂合度(Ho)为0.466 1, 其有效等位基因数(Ne)为1.849 6, 多态信息含量(PIC)为0.450 (0.250< PIC< 0.500), 属中度多态位点。

2.4 二个微卫星位点与翘嘴鲌体长和体质量的关联分析

除去基因型数目小于3的数据后进行单因素方差分析。微卫星位点Cal-GH01与体长的分析结果表明:404/407型个体占样本数的13.3%, 其体长最长; 410/410型个体占样本数的2.5%, 其体长最短。微卫星位点Cal-GH01与体质量的分析结果表明, 407/410型个体占样本数的5.0%, 其体质量最大, 410/410型个体同时也是体质量较轻的基因型。Cal-GH01不同基因型个体体长和体质量均有差异, 但差异均不显著(P> 0.05)(表3)。

微卫星位点Cal-GH02中, 366/381型个体占样本数的3.3%, 其体长和体质量均表现最大, 其体质量显著(P< 0.05)大于其他基因型个体。384/387型个体占样本数的2.5%, 其体长和体质量均表现最小, 其体长小于其他基因型个体(表3)。

3 讨论

虽然高通量测序技术发展迅速, 但对于少量特定微卫星位点的检测, 仍然需要进行PCR判别条带大小。现在较为流行的方法是基于激光检测系统的荧光标记, 但需要用荧光染料标记特异的微卫星引物。采用荧光标记进行自动分型虽然方便快捷, 但需对每对微卫星引物的1条引物进行荧光标记。如果实验需要采用较多引物的话, 实验成本较高。很多实验室先用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及银染技术在8~12个个体中筛选多态性微卫星引物, 再将扩增良好的多态性引物用荧光修饰。这样可以节省成本, 但8~12个个体的样本量较小, 有可能漏掉一些多态性较低的微卫星引物, 使得对微卫星特性的研究存在偏差。而且PAGE费时费力, 操作不规范也可能对实验人员健康造成影响。Steffens等[19]最早提出采用荧光标记的M13通用引物检测DNA基因型的方法。随后, Schuelke[20]通过实验将这种方法的原理及具体操作流程更细致化, 并将这种方法称之为巢式PCR(nested PCR)。本研究将其应用于翘嘴鲌GH基因侧翼微卫星的检测, 取得了良好的效果, 表明采用该方法可以较精确地进行微卫星分型, 值得在水产动物中推广。

生长激素基因是物种进化中相对保守的基因, 近缘物种GH基因的多态性主要集中在内含子中。Almuly等[11, 21]发现金头鲷GH基因非编码区内存在小卫星和微卫星的重复序列, 其对于内含子1中小卫星saGHFIM的研究表明, 具有长内含子的片段会抑制GH基因表达的活性。虽然在翘嘴鲌内含子中未发现微卫星和小卫星, 但在侧翼发现了(AAT)8、(CTT)5和(TAA)7微卫星序列。本研究发现的2个微卫星位点有其自身的特点:Cal-GH01位点的404、407和410对应的重复次数分别为7、8和9次, 重复次数均为连续的, 而且重复次数为8次的占70.8%, 推测重复次数为8的是其原始类型, 由于Taq酶的滑动, 增加或减少了1个重复而变得具有多态性。在同属鲤科的团头鲂(Megalobrama amblycephala)中也发现了(AAT)11微卫星序列, 鲁双庆等[22]在鳜属(Siniperca)3种鱼GH第二内含子的相同位置均发现了“ AG” 微卫星序列。因此, 在相近物种中, 微卫星较为保守, 可以对该位点在鲌亚科物种分化过程中的变化进行研究。Cal-GH02位点的366、375、378、381、384和387对应的重复次数分别为7、10、11、12、13和14次。除了重复次数为7的基因型, 其余5种基因型均是连续的, 而且重复次数为12次的占70.4%, 重复13和14次占的比例分别为12.5%和10.0%。推测重复次数为12的是其原始类型, 复制过程中倾向于重复次数的增加。

黄颡鱼的GH基因内含子中存在4个微卫星位点, 且都具有较高的遗传多样性; 其中, 3个位点GA、TCTT和AC都与生长性状有显著或极显著的关联性, 对于分子育种实践具有十分重要的意义[5], 本研究没有得到如此显著的结果。鱼类的生长是受多个基因调控的结果, 个体之间GH基因的差别也不只存在于微卫星。采用分子标记辅助育种也不会局限于某几个位点, 而是需要科学的数学模型进行综合评价。本实验中同塘养殖的120尾翘嘴鲌生长激素基因侧翼区微卫星位点Cal-GH01中, 不同基因型个体体长和体质量均有差异, 但差异均不显著(P> 0.05); Cal-GH02中, 366/381型个体占样本数的3.3%, 其体长和体质量均表现最大, 其体质量显著大于其他基因型个体(P< 0.05), 384/387型个体占样本数的2.5%, 其体长和体质量均最小, 其体长小于其他基因型个体。这2个微卫星位点中优势等位基因所占的比例较高, 可在翘嘴鲌不同地理种群或者近缘物种中做进一步研究。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] MØLLER N, COPELAND K C, NAIR K S. Growth hormone effects on protein metabolism[J]. Endocrinology and Metabolism Clinics of North America, 2007, 36(1): 89-100. [本文引用:1]
[2] CAVARI B, FUNKENSTEIN B, CHEN T T, et al. Effect of growth hormone on the growth rate of the gilthead seabream ( Sparus aurata), and use of different constructs for the production of transgenic fish[J]. Aquaculture, 1993, 111(1/4): 189-197. [本文引用:1]
[3] SAKAMOTO T, SHEPHERD B S, MADSEN S S, et al. Osmoregulatory actions of growth hormone and prolactin in an advanced teleost[J]. General and Comparative Endocrinology, 1997, 106(1): 95-101. [本文引用:1]
[4] FORSYTH I A, WALLIS M. Growth hormone and prolactin: molecular and functional evolution[J]. Journal of Mammary Gland Biology & Neoplasia, 2002, 7(3): 291-312. [本文引用:1]
[5] 李美娟. 黄颡鱼生长激素基因多态性与生长性状的关联性研究[D]. 广州: 华南农业大学, 2016.
LI M J. Correlation between the polymorphism of growth hormone gene with the growth traits in the yellow catfish ( Pelteobagrus Fulvidraco) [D]. Guangzhou: South China Agricultural University, 2016. (in Chinese with English abstract) [本文引用:2]
[6] 王文君, 陈克飞, 任军, 等. 中外不同猪品种生长激素基因遗传多态性检测[J]. 农业生物技术学报, 2003, 11(1): 103-104.
WANG W J, CHEN K F, REN J, et al. Detection of the polymorphisms of growth hormone gene in Chinese and European pig breeds[J]. Journal of Agricultural Biotechnology, 2003, 11(1): 103-104. (in Chinese with English abstract) [本文引用:1]
[7] CHUNG E R, LEE C S. A previously unreported DraI polymorphism within the regulatory region of the bovine growth hormone gene and its association with growth traits in Korean Hanwoo cattle[J]. Animal Genetics, 2004, 35(2): 152-158. [本文引用:1]
[8] 聂庆华, 张细权, 杨关福, 等. 鸡生长激素基因的 PCR-RFLPs分析[J]. 农业生物技术学报, 2001, 9(3): 282-285.
NIE Q H, ZHANG X Q, YANG G F, et al. PCR-RFLPs analysis of chicken growth hormone gene[J]. Journal of Agricultural Biotechnology, 2001, 9(3): 282-285. (in Chinese with English abstract) [本文引用:1]
[9] YOWE D L, EPPING R J. A minisatellite polymorphism in intron III of the barramundi ( Lates calcarifer) growth hormone gene[J]. Genome, 1996, 39(5): 934-940. [本文引用:1]
[10] KANG J, LEE S, PARK S, et al. DNA polymorphism in the growth hormone gene and its association with weight in olive flounder Paralichthys olivaceus[J]. Fisheries Science, 2010, 68(3): 494-498. [本文引用:1]
[11] ALMULY R, CAVARI B, FERSTMAN H, et al. Genomic structure and sequence of the gilthead seabream ( Sparus aurata) growth hormone-encoding gene: identification of minisatellite polymorphism in intron I[J]. Génome, 2000, 43(5): 836-845. [本文引用:2]
[12] KASHI Y, KING D, SOLLER M . Simple sequence repeats as a source of quantitative genetic variation[J]. Trends in Genetics, 1997, 13(2): 74-78. [本文引用:1]
[13] 乐佩琦, 罗云林. 鲌亚科鱼类系统发育初探(鲤形目: 鲤科)[J]. 水生生物学报, 1996, 20(2): 182-185.
YUE P Q, LUO Y L. Preliminary studies on phylogeny of subfamily Cultrinae (Cypriniformes: Cyprinidae)[J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 1996, 20(2): 182-185. (in Chinese) [本文引用:1]
[14] LIU S L, GU Z M, JIA Y Y, et al. Isolation and characterization of 32 microsatellite loci for topmouth culter ( Culter alburnus Basilewsky)[J]. Genetics and Molecular Research, 2014, 13(3): 7480-7483. [本文引用:1]
[15] LIU S L, GU Z M, ZHAO J L, et al. Characterization of microsatellites and repetitive flanking sequences (ReFS) from the topmouth culter ( Culter alburnus Basilewsky)[J]. Biochemical Systematics and Ecology, 2015, 63(5): 127-135. [本文引用:1]
[16] 刘士力, 程顺, 蒋文枰, 等. 翘嘴鲌胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-I)基因的克隆及序列分析[EB/OL]. (2018-12-24) [2019-01-04]. http: //ssswxb. ihb. ac. cn/article/id/fb324b22-122f-48a6-8c63-65fcbd8ccb3c.
LIU S L, CHENG S, JIANG W P, et al. Cloning and sequence analysis of insulin-like growth factor I gene in topmouth culter (Culter alburnus Basilewsky) [EB/OL]. (2018-12-24) [2019-01-4]. http://ssswxb.ihb.ac.cn/article/id/fb324b22-122f-48a6-8c63-65fcbd8ccb3c. [本文引用:1]
[17] 刘士力, 贾永义, 蒋文枰, 等. 翘嘴鲌生长激素(GH)基因与侧翼区的克隆及分析[J]. 浙江农业学报, 2017, 29(8): 1281-1289.
LIU S L, JIA Y Y, JIANG W P, et al. Cloning and sequence analysis of growth hormone gene and its flanking region in topmouth culter ( Culter alburnus Basilewsky)[J]. Acta Agriculturae Zhejiangensis, 2017, 29(8): 1281-1289. (in Chinese with English abstract) [本文引用:1]
[18] BLACKET M J, ROBIN C, GOOD R T, et al. Universal primers for fluorescent labelling of PCR fragments: an efficient and cost-effective approach to genotyping by fluorescence[J]. Molecular Ecology Resources, 2012, 12(3): 456-463. [本文引用:1]
[19] STEFFENS D L, SUTTER S L, ROEMER S C. An alternate universal forward primer for improved automated DNA sequencing of M13[J]. Bio Techniques, 1993, 15(4): 580, 582. [本文引用:1]
[20] SCHUELKE M. An economic method for the fluorescent labeling of PCR fragments[J]. Nature Biotechnology, 2000, 18(2): 233-234. [本文引用:1]
[21] ALMULY R, SKOPAL T, FUNKENSTEIN B. Regulatory regions in the promoter and first intron of Sparus aurata growth hormone gene: repression of gene activity by a polymorphic minisatellite[J]. Comparative Biochemistry and Physiology-Part D: Genomics and Proteomics, 2008, 3(1): 43-50. [本文引用:1]
[22] 鲁双庆, 刘峰, 刘臻, 等. 三种鳜鱼( Siniperca)生长激素基因的克隆及序列比较[J]. 海洋与湖沼, 2008, 39(4): 354-361.
LU S Q, LIU F, LIU Z, et al. Comparison in cloning and sequence of growth hormone gene in three species of genus Siniperca[J]. Oceanologia et Limnologia Sinica, 2008, 39(4): 354-361. (in Chinese with English abstract) [本文引用:1]