作者简介:白俊艳(1975—),女,内蒙古赤峰人,副教授,研究方向为动物遗传育种。E-mail: junyanbai@163.com
为了探讨雌激素受体( ESR1)基因的多态性及其与鹌鹑蛋品质的关系,采用PCR-RFLP和直接测序法对中国黄羽鹌鹑、朝鲜鹌鹑、北京白羽鹌鹑3个群体的 ESR1基因与鹌鹑蛋品质性状进行关联分析。结果表明:鹌鹑 ESR1基因外显子1、外显子4、外显子8在北京白羽鹌鹑、中国黄羽鹌鹑、朝鲜鹌鹑3个群体中都检测到了CC、CT、TT三种基因型。外显子1在3个鹌鹑群体中均表现为CC基因型频率最高;外显子8在3个鹌鹑群体中均表现为TT基因型频率最高;外显子4在中国黄羽鹌鹑、朝鲜鹌鹑中TT基因型频率最高,分别为0.409、0.617,而北京白羽鹌鹑以CC基因型频率最高(0.667)。相关性分析结果显示,在3个检测群体中,外显子4的CC基因型和CT基因型的蛋黄高度和蛋黄指数显著高于TT基因型( P<0.05),TT基因型的蛋黄宽度显著高于CC基因型和CT基因型( P<0.05),CT基因型和TT基因型的蛋壳厚度显著高于CC基因型( P<0.05)。外显子8在蛋黄指数上,CC基因型显著高于CT基因型和TT基因型( P<0.05);CT基因型和TT基因型的蛋黄宽度显著高于CC基因型( P<0.05)。 ESR1基因可以作为有价值的候选基因应用于蛋用鹌鹑的分子标记辅助选择。
In order to investigate the relationship between the polymorphism of estrogen receptor ( ESR1) gene and quail egg quality, the polymorphism of ESR1 gene was detected by PCR-RFLP in three populations, including Chinese yellow quail, Korean quail and Beijing white quail, and the correlation between the polymorphism of ESR1 gene and quail egg quality traits was analyzed. The results showed that CC, CT and TT genotypes were detected in exon 1, exon 4 and exon 8 of quail ESR1 gene in Beijing white quail, Chinese yellow quail and Korean quail. Exon 1 showed the highest frequency of CC genotype in all three quail populations, Exon 8 showed the highest frequency of TT genotype in all three quail populations, Exon 4 showed the highest frequency of TT genotype in Chinese yellow quail and Korean quail, 0.409 and 0.617, respectively, while Beijing white quail had the highest frequency of CC genotype (0.667).The results of correlation analysis showed that the yolk height and yolk index of CC genotype and CT genotype in exon 4 were significantly higher than TT genotype ( P<0.05), the yolk width of TT genotype was significantly higher than CC genotype and CT genotype ( P<0.05), and the shell thickness of CT genotype and TT genotype was significantly higher than CC genotype ( P<0.05). In exon 8, the yolk index of CC genotype was significantly higher than that of CT genotype and TT genotype ( P<0.05), and the yolk width of TT genotype of CT genotype was significantly higher than that of CC genotype ( P<0.05). ESR1 gene can be used as a valuable candidate gene for molecular marker-assisted selection in egg quails.
雌激素受体(estrogen receptor, ESR)是核受体超家族的一员, 拥有ESRα 和ESRβ 两种亚型, 作为媒介来转导雌激素的多向性效应。ESRα 对生殖系统(子宫、乳腺)的影响是关键性的, 而ESRβ 主要影响中枢神经系统、免疫系统、心血管系统、泌尿系统, 以及肾脏、肺部、骨骼的相关机制[1]。Green等[2]首先克隆获得人的ESRα cDNA序列, 长2 092 bp, 可编码595个氨基酸。Krust等[3]克隆了鸡的ESRα cDNA序列, 大小为2 085 bp, 能够对589个氨基酸进行编码。Kuiper等[4]和Mosselman等[5]分别进行了鼠和人的ESRβ cDNA序列的克隆。Ichikawa等[6]克隆出ESR1基因的cDNA, 从此其他一些物种的ESRα 和ESRβ 的cDNA都渐渐被克隆出来。Rothschild等[7]研究发现, ESR基因是影响母猪产仔性状中起关键作用的一个基因。猪的ESR1基因与母猪产仔数存在相关性[8]。由此可见, ESR基因对畜禽繁殖性状具有重要的影响。
鹌鹑因体型小、产蛋大而多、饲料消耗少、生长速度快、培育时间短、生产成本低、经济效益高等优点, 具有较强的竞争力和发展前途。鹌鹑蛋中还含有较高的卵磷脂、脑磷脂、维生素和铁等[9], 鹌鹑肉和蛋对于哮喘、结核、代谢障碍以及神经衰弱等疾病还具有一定的治疗作用, 具有比较高的药用价值[10]。以上研究表明, ESR基因对畜禽繁殖性状有一定的影响, 考虑到基因一般具有一因多效的作用。为此, 本实验以北京白羽鹌鹑、中国黄羽鹌鹑、朝鲜鹌鹑这3个鹌鹑品种为研究对象, 采用PCR-RFLP方法分析鹌鹑ESR1基因的遗传多态性, 并对鹌鹑蛋品质进行关联分析, 以探讨ESR1基因对鹌鹑蛋品质的影响。
本研究所取用的实验动物是北京白羽鹌鹑50羽、中国黄羽鹌鹑50羽、朝鲜鹌鹑50羽, 采用心脏采血法进行采血, 取血后将血液储存在含有EDTA抗凝剂的真空采血管中, 放至-20 ℃的冰箱进行冷冻保存以备使用。
1.2.1 基因组DNA及引物合成
采集鹌鹑心脏血样, 采血后做好标记放入-20 ℃冰箱保存。对血液采用酚/氯仿法提取了基因组DNA, 该试验中所使用的引物序列参考蒲跃进[11]的方法, ESR1基因外显子4引物由北京鼎国昌盛生物技术有限公司合成, ESR1基因引物信息见表1。
1.2.2 目的片段的PCR扩增
扩增反应体系为:去离子水5.3 μ L, 2× Taq PCR Green Mix为7.5 μ L, 上游引物0.6 μ L, 下游引物0.6 μ L, DNA模板1.0 μ L。扩增反应条件为:95 ℃预变性5 min; 95 ℃变性30 s, 58 ℃退火40 s, 72 ℃延伸40 s, 30个循环; 72 ℃延伸10 min。
1.2.3 PCR-RFLP分析
限制性内切酶PvuⅡ 为ESR1-E1引物扩增的PCR产物进行酶切, 酶切反应体系为15 μ L:ddH2O 5 μ L, PCR产物8 μ L, 限制性内切酶PvuⅡ (10 U· μ L-1)0.5 μ L, 10× buffer 1.5 μ L。混合均匀后置于37 ℃水浴消化4 h。限制性内切酶AccⅠ 为ESR1-E8引物扩增的PCR产物进行酶切, 酶切反应体系为10 μ L:ddH2O 0.5 μ L, PCR产物8 μ L, 限制性内切酶PvuⅡ (10 U· μ L-1)0.5 μ L, 10× buffer 1.0 μ L。混合均匀后置于37 ℃水浴消化4 h。酶切产物使用2.0%浓度的琼脂糖凝胶电泳进行检测, 跑胶结束后使用凝胶成像系统进行拍照记录。
1.2.4 扩增产物的测序及序列的比对分析
序列比对主要采用NCBI网站上的BLAST系统对所测基因序列进行对比, 通过对比的结果来确认该序列是否为目的序列。测序图谱用Chromas程序进行观察分析以查找潜在的突变位点, 并做记录统计。
1.2.5 数据统计分析
多态信息含量(PIC)、杂合度(He)和有效等位基因数(Ne)用Dispan软件计算。ESR1基因与鹌鹑蛋品质的关联分析统计模型为
yijk=μ +Pi+Mj+eijk。 (1)
式(1)中:yijk为性状表型值; μ 为总体均值; Pi为品种效应(i=1, 2, 3); Mj为第j种基因型效应; eijk为残差效应; 结果用平均值± 标准差来表示。
鹌鹑ESR1基因的外显子1、外显子4、外显子8的PCR产物检测结果如图1所示, 可以看出检测结果均为单一条带, ESR1基因的外显子1、外显子4、外显子8与目的片段大小一致, 表明PCR扩增产物质量达标效果较好。
鹌鹑ESR1基因外显子1和外显子8的多态性检测结果如图2所示, 可以看出外显子1和外显子8中均检测到3种基因型, ESR1基因外显子1检测到3种基因型分别为TT基因型(370 bp)、CC基因型(330 bp/40 bp)和CT基因型(434 bp/330 bp/40 bp)。ESR1基因外显子8检测到的3种基因型为TT基因型(212 bp)、CC基因型(121 bp)和CT基因型(212 bp/121 bp)。
鹌鹑ESR1基因外显子4的SNP位点测序峰图见图3, 可以看出在3个鹌鹑群体中检测到ESR1基因外显子4有1个SNP位点为C50T, 检测到3种基因型即CC、CT和TT基因型。
由表2可以看出, ESR1基因外显子1在3个鹌鹑群体中均表现为CC基因型频率最高; ESR1基因外显子8在3个鹌鹑群体中均表现为TT基因型频率最高; ESR1基因外显子4在中国黄羽鹌鹑和朝鲜鹌鹑中均表现为TT基因型频率最高, 而在北京白羽鹌鹑中则以CC基因型频率最高。ESR1基因外显子1、外显子4、外显子8在中国黄羽鹌鹑中的杂合度(0.409、0.491、0.464)、有效等位基因数(1.690、1.964、1.860)、多态信息含量(0.326、0.370、0.356)为最高, 可见中国黄羽鹌鹑的遗传多态性丰富。
由表3可以看出, ESR1基因外显子4的CC基因型和CT基因型的蛋黄高度和蛋黄指数要显著高于TT基因型(P< 0.05)。TT基因型的蛋黄宽度要显著高于CC基因型和CT基因型(P< 0.05)。CT基因型和TT基因型的蛋壳厚度要显著高于CC基因型(P< 0.05)。除此之外, ESR1基因外显子4对其他蛋品质无显著影响(P> 0.05)。ESR1基因外显子8在蛋黄指数上, CC基因型显著高于CT基因型和TT基因型(P< 0.05), CT基因型和TT基因型之间不存在显著性差异(P> 0.05)。CT基因型和TT基因型的蛋黄宽度显著高于CC基因型(P< 0.05)。除此之外, ESR1基因外显子8对其他蛋品质无显著影响(P> 0.05)。ESR1基因外显子1对所有蛋品质均无显著影响(P> 0.05)。
季华员等[12]研究发现, ESR1基因在东乡绿壳蛋鸡群体中的外显子1有5个突变位点, 外显子4和8各有1个突变位点。王洪才等[13]研究庄河大骨鸡ESR基因发现了CC、CD和DD这3种基因型。张舒等[14]研究发现, 在肉鸽中存在两种ESR基因型AA和AB。本研究中, 使用ESR1基因的外显子1、外显子4、外显子8在3个品种的鹌鹑群体中进行多态性检测, 均检测到3种基因型, ESR1基因外显子4上均有1处SNP突变位点(C50T), 且外显子4在中国黄羽鹌鹑、朝鲜鹌鹑两个群体的T等位基因频率均高于C等位基因频率, 等位基因T为该两个群体的优势等位基因。这与蒲跃进[11]对我国神丹Ⅰ 号鹌鹑的H系、L系及野生鹌鹑3个群体的ESR1基因C50T位点的研究结果相似。
ESR基因与繁殖性能的关联分析在其他畜禽的研究中报道较多, 如徐小波等[15]研究表明, 二花脸猪的ESR基因BB型初产及经产总产仔数(TNB)和产活仔数(NBA)均高于AB型(P< 0.05)和AA型(P< 0.01)。唐现文等[16]研究表明, ESR基因在苏姜猪的3个世代中BB型基因的第2~4胎总产仔数显著高于AA和AB的第2~4胎总产仔数。于吉英等[17]研究发现, ESR基因与文昌鸡的300日龄的产蛋数之间存在显著相关(P< 0.05), 而与文昌鸡个体的连产天数存在极显著相关(P< 0.01)。季华员等[12]对东乡绿壳蛋鸡的ESR1基因的多态性研究发现, ESR1基因外显子4的突变位点(C267T)产生的3种基因型与东乡绿壳蛋鸡300日龄的平均产蛋量存在明显相关(P< 0.05)。王洪才等[13]对庄河大骨鸡的ESR基因的CC基因型的产蛋数和料蛋比等性状指标显著高于该位点其他基因型(P< 0.05)。陈燕等[18]在对文昌鸡和巴布考克蛋鸡研究时, 在2个群体鸡ESRα 基因的5'端检测到了4个突变位点(A34G、T76C、T79C、C102T), 但这4个突变位点对鸡的产蛋性状并没有显著影响。涂小璐[19]对皖西白鹅研究发现, ESR1基因内含子上的A105G突变位点所含有的几个基因型与鹅的产蛋量、开产蛋重和开产体重等产蛋性状不存在相关性。谢三磊等[20]研究发现, ESRβ 基因与黑羽鹌鹑的产蛋性能存在一定相关性。
而ESR基因与家禽蛋品质关联分析报道较少, 仅见韦雄等[21]研究发现, 在长顺绿壳蛋鸡群体中ESR1基因外显子5前有一个SNP位点-999 bp(上有A、C两个等位基因), 该突变位点上的3种基因型(AA、AC、CC)与长顺绿壳蛋鸡产蛋的蛋壳厚度存在相关; 蒲跃进[11]研究发现, ESR基因外显子8与鹌鹑的20周蛋质量之间存在相关(P< 0.05)。本研究表明, ESR1基因外显子4和外显子8主要对蛋黄高度、蛋黄宽度、蛋黄指数、蛋壳厚度有显著影响(P< 0.05), 这一结果与蒲跃进[11]、韦雄等[21]的研究结果相似。因此, 推测ESR1基因可能为蛋用鹌鹑的蛋品质相关的候选基因, 可以作为有价值的候选基因应用于蛋用鹌鹑的分子标记辅助选择。
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