一株临沧野生黄鸡㙡的鉴定与生长条件研究
周会明1,2, 张焱珍1,2, 柴红梅2,*, 杨荣情1, 谭莹1, 张萍萍1, 白玉英1, 赵一莲1, 金玉洁1
1.滇西科技师范学院 生物技术与工程学院,云南 临沧 677000
2.云南省农业科学院 生物技术与种质资源研究所,云南 昆明 650221
*通信作者,柴红梅,E-mail: chm621@aliyun.com

作者简介:周会明(1984—),男,甘肃天水人,硕士,讲师,从事大型真菌种质资源的驯化、栽培与遗传研究。E-mail: 632243530@qq.com

摘要

为筛选黄鸡㙡菌丝生长的最优培养条件,为其仿生栽培奠定基础,从采集于云南临沧的野生鸡㙡子实体中分离纯化获得纯培养物LCT10,结合形态学与ITS序列分析鉴定其分类学地位,并设计了不同培养条件,研究不同温度、pH、光照强度、通气性、碳氮源与碳氮比对野生黄鸡㙡菌丝生长的影响。试验表明,采集到的菌株LCT10为黄鸡㙡( Termitomyces aurantiacus),其形态特征与分子鉴定结果一致。该菌菌丝体在5~30 ℃均能生长,最适生长温度为25 ℃;菌丝在pH 4.0~12.0均能生长,当pH为8.0,培养皿在黑纸包裹下培养菌丝生长速度最快;在5种通气处理下均能生长,不做任何通气处理的菌丝生长最快。能利用可溶性淀粉、玉米粉、蔗糖、蜂蜜、葡萄糖作为碳源,蛋白胨、甘氨酸、硝酸铵、尿素作为氮源,其中,在蜂蜜上生长浓密且生长快,最适氮源为蛋白胨,最适C/N为(20~30)∶1。LCT10在最适培养条件下的生长情况与其他处理相比有显著差异( P<0.05)。

关键词: 黄鸡㙡; 形态学; ITS序列分析; 生物学特性
中图分类号:S646.1+9 文献标志码:A 文章编号:1004-1524(2019)10-1655-08
Identification and culture conditions of a wild-type Termitomyces aurantiacus strain from Lincang
ZHOU Huiming1,2, ZHANG Yanzhen1,2, CHAI Hongmei2,*, YANG Rongqing1, TAN Ying1, ZHANG Pingping1, BAI Yuying1, ZHAO Yilian1, JIN Yujie1
1. School of Biotechnology and Engineering, West Yunnan University, Lincang 677000, China
2. Institute of Biotechnology and Germplasmic Resource, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Kunming 650221, China
Abstract

To screen the optimal culture condition for mycelial growth of Termitomyces aurantiacus and lay the foundation for its bionic cultivation, strain LCT10 was isolated from a wild mushroom fruiting body of Termitomyces from Lincang, Yunnan. Taxonomic status was identified based on its morphology and ITS sequence analysis, and the different culture conditions were designed to determine the effect of physical factors (temperature, light intensity and aeration) and chemical factors (pH, carbon resources, nitrogen sources and C/N) on mycelial growth of T. aurantiacus. The result showed that the strain LCT10 was T. aurantiacus, its morphological characteristics were consistent with its molecular identification. Its optimal temperature and pH were 25 ℃ and 8.0. It was able to grow in 5 kinds of ventilation treatments, and the growth of mycelia was the fastest in the treatment of no ventilation. Soluble starch, corn flour, sucrose, honey and glucose were suitable for its growth, honey was the best carbon soure for mycelial growth. Peptone, glycine, ammonium nitrate and urea could be used as nitrogen sources and peptone was the best. The optimum C/N for mycelial growth was (20-30)∶1. The growth of strain LCT10 under the best culture conditions had significant difference at level of 0.05 comparing with other treatments

Keyword: Termitomyces aurantiacus; morphology; ITS analysis; biological characteristics

黄鸡㙡(Termitomyces aurantiacus)隶属于真菌界、担子菌门、层菌纲、伞菌目、口 蘑科、鸡㙡属, 其外观诱人、营养丰富、味道鲜美、具有多种药用价值, 是一种珍稀野生食用菌, 具有较大的开发价值[1, 2]。国内外关于鸡㙡菌的研究历史悠久[3], 但对该菌的基础研究极为缺乏, 大多数研究主要集中于该菌的药用价值与人工驯化栽培方面, 其中, 该菌与白蚁的共生关系[4, 5, 6]、该菌的驯化栽培一直是科研工作者的焦点。尽管国内有关于该菌栽培成功的研究[7, 8], 但存在同名异种或与长根菇(Oudemansiella radicata)混淆的可能, 且至今未见其批量生产的报道[9], 其人工栽培难度较大。因此, 鸡㙡菌的人工栽培仍然存在一定的难度, 问题到底出在哪儿?科研工作者在探索鸡㙡菌与白蚁共生问题时, 应从问题的源头逐一排除, 就必须搞清楚以下3个主要问题:首先, 鸡㙡菌人工栽培失败受哪几种营养因子的限制; 其次, 这些因子是什么?其来源于人工培养料还是白蚁; 最后, 是该因子在鸡㙡菌与白蚁之间的作用机制。生物学特性研究可以了解大型真菌生长发育的特点[10], 也是探究鸡㙡菌人工栽培失败受哪几种营养因子限制的基础。本文以云南临沧野生黄鸡㙡为材料, 在形态学与ITS序列分析的基础上, 试图研究不同环境条件(温度、pH、光照、通气性)与营养条件[碳源、氮源、碳氮比(C/N)]对一株野生黄鸡㙡菌丝生长的影响, 为该菌的地域性新品种筛选、商业化规模栽培提供基础。

1 材料与方法
1.1 材料

1.1.1 供试菌株

供试黄鸡㙡菌株LCT10由云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所提供。

1.1.2 培养基

PDA培养基:马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂15 g、水1 L, pH自然。

碳源基础培养基:蛋白胨3 g、KH2PO4 0.2 g、MgSO4 0.1 g、琼脂15 g、水1 L, pH自然。

氮源基础培养基:葡萄糖20 g、KH2PO4 0.2 g、MgSO4 0.1 g、琼脂15 g、水1 L, pH自然。

碳氮比(C/N)基础培养基:KH2PO4 0.2 g、MgSO4 0.1 g、琼脂15 g、水1 L、pH自然。

1.2 方法

1.2.1 子实体的采集、分离纯化与培养

在云南省临沧市芒角社区绿化带的草坪采集到一株野生幼嫩子实体, 依据其宏观与微观形态特征进行初步鉴定; 在PDA培养基上, 采用菌肉组织分离法, 经25 ℃下遮光培养获得纯培养物, 编号为LCT10。

1.2.2 ITS序列分析

菌株在PDA培养基上25 ℃培养10 d, 采用CTAB法[11]提取野生菌株LCT10菌丝体DNA, 用通用引物ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGG-3')和ITS5(5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3')扩增ITS片段[12]。PCR产物在昆明硕擎生物科技有限公司进行序列测定。将测得的ITS序列通过NCBI在线BLASTN检索, 与GenBank中的ITS基因序列进行同源性比较, 然后利用ClustalX软件对所得序列进行多序列联配分析, 并使用MEGA4.0软件构建系统进化树, 计算遗传距离[13]

1.2.3 菌丝体的活化

将4 ℃冰箱保存的黄鸡㙡菌种取出, 置室温恢复5~7 d, 然后将其转接到PDA培养基上, 25 ℃继续静置黑暗培养5~7 d, 备用[14]

1.2.4 温度试验

在PDA培养基平板中央接入直径为5 mm的菌块, 在温度梯度5、10、15、20、25、30 ℃分别连续恒温黑暗培养22 d, 每温度处理3次重复。采用多次十字交叉法测定菌落直径, 依据生长时间(d)计算菌丝生长速度(mm· d-1), 根据菌丝浓密程度记录生长势[15]

1.2.5 pH试验

用1 mol· L-1 HCl或1 mol· L-1 NaOH调节PDA培养基pH至4、5、6、7、8、9、10、11、12。在不同pH的平板中央接入直径5 mm的菌块饼各1块, 3个重复, 在(25± 3)℃黑暗培养20 d。菌落直径、菌丝生长速度、生长势测定方法同1.2.4节。

1.2.6 光照试验

PDA培养基平板上接种黄鸡㙡菌后, 以室内散射光为对照, 分别做黑纸包裹和1层报纸处理, 每处理3皿, 25 ℃培养22 d。菌落直径、菌丝生长速度、生长势测定方法同1.2.4节。

1.2.7 通气性试验

接种后于25 ℃恒温黑暗连续培养20 d, 培养期间共分成处理1(不处理)、处理2(每隔10 d在酒精灯火焰下通风5 s)、处理3(每隔5 d在酒精灯火焰下通风5 s)及处理4(每隔1 d在酒精灯火焰下通风5 s)4组处理, 每处理3个重复。菌落直径、菌丝生长速度、生长势测定方法同1.2.4节。

1.2.8 碳氮源试验

在碳源基础培养基上, 分别用2%的蜂蜜、可溶性淀粉、玉米粉、蔗糖代替葡萄糖做碳源试验; 同样的方法, 分别用0.3%的尿素、甘氨酸、硝酸铵代替蛋白胨做氮源试验。菌落直径、菌丝生长速度、生长势测定方法同1.2.4节。

1.2.9 C/N试验

在C/N基础培养基上, 以葡萄糖为碳源, 甘氨酸为氮源, 配制C/N分别为10∶ 1、20∶ 1、30∶ 1、40∶ 1、50∶ 1、60∶ 1的6种培养基。菌落直径、菌丝生长速度、生长势测定方法同1.2.4节。

1.3 统计方法

试验数据均用SPSS 19.0软件进行统计分析[16]

2 结果与分析
2.1 野生菌株LCT10子实体形态特征

子实体中等至较大型, 菌盖圆锥形至平展, 土黄色且中部凸起, 放置一段时间后, 因水分蒸发导致中部凸起不明显, 边缘开裂, 直径5.5~15.5 cm; 菌肉白色或污白色; 菌柄纤维质、内实且光滑, 基部稍粗, 长度7~16 cm, 直径0.5~1.5 cm; 菌褶稍稀、白色、离生且不等长, 其上着生担子, 担子顶部又着生担孢子, 担孢子近无色、光滑、卵圆形。从形态学来看, 初步鉴定菌株LCT10为黄鸡㙡(Termitomyces aurantiacus)(图1)。

图1 野生黄鸡㙡子实体Fig.1 Fruiting bodies of a wild Termitomyces aurantiacus LCT10

2.2 基于ITS序列系统发育分析

将获得的ITS正反向序列使用DNAStar软件包中的SeqMan进行拼接、编辑获得的完整ITS序列(序列长度693 bp)。以菌株LCT10鸡㙡菌基因序列为基础, 与GenBank中的13个鸡㙡菌属菌株的ITS基因序列进行同源性比较, 利用ClustalX软件对所得序列进行多序列联配分析, 并使用MEGA 4.0软件构建系统进化树(图2)。结合其形态学特征, 将菌株LCT10鉴定为黄鸡㙡。

图2 基于ITS序列的黄鸡㙡与其他鸡㙡菌属种的邻接法系统发育分析(1 000次重复)Fig.2 Neighbor joining method analysis (1 000 repeats) of Termitomyces aurantiacus and other Termitomyces species based on ITS sequences

2.3 温度对黄鸡㙡菌丝生长的影响

结果表明, 黄鸡㙡菌丝体在温度5~30 ℃均能生长(图3)。当温度为15 ℃时, 菌丝生长速度加快; 在温度为5~25 ℃时, 其生长速度与温度成正比; 在25~30 ℃时, 其生长速度迅速下降。菌丝最适生长温度为25 ℃, 此时菌丝生长速度为(0.68± 0.01) mm· d-1, 该温度下菌丝体健壮浓密, 且极显著(P< 0.01)快于其他处理。

图3 温度对黄鸡㙡菌丝生长的影响
数据为菌丝生长速度的3次重复的平均值和标准差。柱上无相同大写字母表示差异极显著(P< 0.01), 柱上无相同小写字母表示差异显著(P< 0.05)。菌丝生长势:+++表示浓密, ++表示较浓密, +表示稀疏; -表示不生长。下同。
Fig.3 Effects of temperature on mycelial growth of Termitomyces aurantiacus
Values represent x̅± s of 3 replicates of mycelial growth rate. Data on the bars marked without the same uppercase letter indicated significant differences at P< 0.01, Data on the bars marked without the same lowercase letter indicated significant differences at P< 0.05. “ +++” indicated that mycelia grew vigorously, “ ++” indicated that mycelia grew ordinarily, “ +” indicated that mycelia grew weakly, “ -” indicated that mycelia didn't grow. The same as below.

2.4 pH对黄鸡㙡菌丝生长的影响

黄鸡㙡菌丝在pH 4~12条件下均能生长, 但菌丝长势较弱(图4)。pH为4~8时, 菌丝生长与酸碱度成正比; pH为8~12时, 菌丝生长与酸碱度成反比; pH为8时菌丝生长最快[(0.69± 0.06) mm· d-1]。

图4 pH对黄鸡㙡菌丝生长的影响
2.5 光照对黄鸡㙡菌丝生长的影响
黄鸡㙡菌丝在3种不同光照强度下均能生长, 散射光下菌丝生长极慢、长势弱(图5)。不同光照强度下菌丝生长速度依次是:黑纸> 1层报纸> 散射光, 其中, 黑纸包裹处理下菌丝生长最快[(0.69± 0.04) mm· d-1], 且极显著(P< 0.01)快于其他处理。
Fig.4 Effects of pH on mycelial growth of Termitomyces aurantiacus

图5 光照强度对黄鸡㙡菌丝生长影响的比较Fig.5 Effects of light intensity on mycelial growth of Termitomyces aurantiacus

2.6 通气性对黄鸡㙡菌丝生长的影响

黄鸡㙡菌丝在4种通气处理下均能生长且长势浓密(图6)。随着通气增加, 菌丝体生长速度减弱, 其中, 处理4生长最慢, 处理1菌丝生长最快[(0.68± 0.02) mm· d-1]且显著(P< 0.05)快于与其他处理。

图6 通气性对黄鸡㙡菌丝生长的影响Fig.6 Effects of aeration on mycelial growth of Termitomyces aurantiacus

2.7 碳源对黄鸡㙡菌丝生长的影响

试验结果表明, 该黄鸡㙡在供试的5种碳源上均能生长(图7), 不同碳源下菌丝生长速度为蜂蜜> 葡萄糖> 蔗糖> 可溶性淀粉> 玉米粉, 以蜂蜜为碳源时菌丝生长最快[(0.72± 0.01) mm· d-1]且长势浓密, 极显著(P< 0.01)快于其他处理。

图7 碳源对黄鸡㙡菌丝生长影响的比较Fig.7 Effects of carbon sources on mycelial growth of Termitomyces aurantiacus

2.8 氮源对黄鸡㙡菌丝生长的影响

试验结果显示, 该黄鸡㙡在供试的4种氮源上均能生长(图8)。不同氮源下菌丝生长速度为蛋白胨> 硝酸铵> 甘氨酸> 尿素, 以蛋白胨为氮源时菌丝生长最快[(0.69± 0.02) mm· d-1]且长势浓密, 极显著(P< 0.01)高于其他处理。

图8 氮源对黄鸡㙡菌丝生长影响的比较Fig.8 Effects of nitrogen sources on mycelial growth of Termitomyces aurantiacus

2.9 碳氮比(C/N)对黄鸡㙡菌丝生长的影响

黄鸡㙡在供试的6种C/N培养基上均能生长长(图9)。不同C/N下该菌菌丝生长速度为20∶ 1> 30∶ 1> 40∶ 1> 50∶ 1> 10∶ 1> 60∶ 1, C/N为20∶ 1时菌丝生长最快[(0.68± 0.01) mm· d-1]且长势浓密, 极显著高于其他处理, 其次为30∶ 1。因此, 黄鸡㙡菌丝体最适C/N为(20~30)∶ 1。

图9 碳氮比对黄鸡㙡菌丝生长影响的比较Fig.9 Effects of C/N on mycelial growth of Termitomyces aurantiacus

3 结论与讨论

栽培环境与培养条件的限制已成为众多珍贵食用菌推广受阻的重要因素之一[17, 18], 鸡㙡菌也不例外。黄鸡㙡菌丝体固体培养结果表明, 该菌菌丝体在温度为5~30 ℃, pH 4~12条件下均能生长, 其最适温度为25 ℃。这与曾先富等[19]的研究结果基本一致, 但与熊亚等[20]的结果(最适温度为20~22 ℃)不相符; pH为8时该菌菌丝生长最快, 该结果与熊亚等[20]的结果(pH为5~6)存在差异。光照强度对该菌的生长影响也较大, 黑纸包裹处理下菌丝生长最快, 这与其他大型真菌相同, 如花脸香蘑[15]。该菌在供试的碳氮源上均能生长, 最适碳氮源分别为蜂蜜、蛋白胨, 以葡萄糖、甘氨酸为碳氮源时, 最适C/N为(20~30)∶ 1, 此结果与胡尚勤等[21]以葡萄糖、氨基酸为碳氮源时, 得出的最适C/N为(12~14)∶ 1不相符。黄鸡㙡起源于非洲[22], 在地理上存在物种的多样性[23], 不同地理环境下该菌在生长特性方面存在差异是导致上述研究结果不相符的主要原因。总之, 野生黄鸡㙡的地域性较强, 对环境与营养条件的要求多样化, 成为其广泛栽培限制因子之一, 有必要针对不同生境的菌株进行胞外酶活性、矿质营养、呼吸作用等生理特性研究。

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