青海省部分地区马铃薯Y病毒<em> cp</em>基因序列分析

引用本文

程亮. 青海省部分地区马铃薯Y病毒 cp基因序列分析 [J]. 浙江农业学报, 2019,31(11): 1888-1895.
CHENG Liang. Analysis on cp gene sequences of potato virus Y from some places in Qinghai Province [J]. ACTA AGRICULTURAE ZHEJIANGENSIS, 2019,31(11): 1888-1895.
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Doi: 10.3969/j.issn.1004-1524.2019.11.15
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青海省部分地区马铃薯Y病毒 cp基因序列分析

程亮^1,²

1.青海省农林科学院植物保护研究所,青海省农业有害生物综合治理重点实验室,青海西宁 810016

2.青海大学,省部共建三江源生态与高原农牧业国家重点实验室,青海西宁 810016

作者简介:程亮(1978—),男,河南林州人,硕士,研究方向为植物病理学。E-mail: liangcheng1979@163.com

收稿日期: 2019-04-08

基金资助: 青海省自然科学基金( 2018-ZJ-917); 青海大学中青年科研基金 (2014-QNY-7)

摘要

马铃薯Y病毒(PVY)是危害我国马铃薯的主要病毒之一,其在自然条件下极易发生基因变异而产生株系分化现象。为揭示青海马铃薯Y病毒分离物 cp基因的分子变异,利用RT-PCR方法扩增获得了16个马铃薯Y病毒分离物的 cp基因序列,采用SDT、DANMAN、RDP和MEGA软件对其进行分子变异分析。序列一致率结果表明,16个分离物的核苷酸序列均为801个碱基,一致率为98.0%~100%,编码267个氨基酸,一致率为94.8%~100%。重组分析表明,16个分离物未发生基因重组。系统发育分析发现,11个分离物与PVY^N-Wi株系相聚成簇,表明其在系统发育关系上与PVY^N-Wi株系的亲缘关系最近,占被检出病毒分离物的68.7%;另外5个分离物与PVY^O株系相聚成簇,表明其在系统发育关系上与PVY^O株系亲缘关系最近;未发现PVY^C株系、PVY^N株系、PVY^E株系和PVY^NTN株系存在。

关键词: 马铃薯Y病毒; cp基因; 序列分析; 最大似然法; 青海

中图分类号:S432.1 文献标志码:A 文章编号:1004-1524(2019)11-1888-08

Analysis on cp gene sequences of potato virus Y from some places in Qinghai Province

CHENG Liang^1,²

1. Key Laboratory of Agricultural Integrated Pest Management in Qinghai Province, Institute of Plant Protection, Qinghai Provincial Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Xining 810016, China

2. State Key Laboratory of Plateau Ecology and Agriculture, Qinghai University, Xining 810016, China

Abstract

Potato virus Y(PVY)is one of the main viruses, which can cause serious losses in potato production. PVY is prone to gene mutation and plant differentiation under natural conditions. To understand the sequence variation of cp gene in PVY, cp gene of 16 isolates from Qinghai was amplified by RT-PCR. SDT, DNAMAN, RDP, and MEGA software were used for analysis. In multiple sequence alignments of cp gene, 16 isolates contained 801 base pairs with the identity of 98.0%-100% and encoded 267 amino acides with the identity of 94.8%-100%, respectively. Recombinant analysis indicated that no gene recombination was found in 16 isolates. Phylogenetic analysis showed that 11 isolates was clustered with isolates belonging to PVY^N-Wi strains, suggesting that the 11 PVY isolates shared high homology with PVY^N-Wi strain and accounting for 68.7% of total isolates. 5 PVY isolates were in the same branch with the reference PVY^O strains, indicating 5 PVY isolates were closer to PVY^O. PVY^C, PVY^N, PVY^E and PVY^NTN strains were not detected.

Keyword: potato virus Y; cp gene; sequences analysis; maximum likelihood method; Qinghai

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马铃薯在保障我国粮食安全, 促进农业增效、农民增收、振兴农业经济方面具有重要意义^[1]。青海省位于黄土高原和青藏高原交汇地带, 生态类型复杂, 海拔较高, 气候冷凉, 秋季雨多, 作物生长周期长, 日照充足, 昼夜温差大, 土壤疏松富含钾, 无污染, 有着适宜马铃薯生长的得天独厚的气候资源^[2]。在马铃薯生长过程中, 常受到多种病害的侵扰^{[3, 4]}, 其中, 马铃薯Y病毒(Potato virus Y, PVY)是目前青海省感染马铃薯并造成最严重经济损失的病毒之一^[5]。PVY是马铃薯Y病毒属(Potyvirus)的代表成员^{[6, 7]}, 其寄主范围十分广泛, 自然条件下超过9个科包括茄科在内的14个属^[8], 能够引起马铃薯花叶、黄化、矮缩等病症, 导致产量和品质下降。

马铃薯Y病毒的基因组全长约9.7 kb, 是一种正义单链RNA病毒^[9]。作为RNA病毒, PVY具有明显的株系分化现象, PVY株系原本有PVY^O株系、PVY^N株系和PVY^C株系3种, 又产生了PVY^NTN株系^{[10, 11]}、PVY^NW株系^{[12, 13]}、PVY^{N∶ O}株系^[14]、PV ${Y^{NA}}^{- NTN}$ 株系^[15]、PVY^Z株系^[16]等新株系。关于对PVY新分离物株系检测, 目前研究人员一般通过个别基因(和/或其编码产物)^[17]或全基因组序列^[18]的同源度比对结果来确定其株系类别, 或通过血清型^[19]、基因组重组与否^[20]、马铃薯块茎坏死环斑病效应^[21]、过敏反应互作基因^[22]这些标准来确定其株系类别。鉴于PVY株系群体的复杂性, 而上述PVY株系分类方法都无法完全区分所有PVY株系类别, 存在这样或那样的缺陷^[23]。近年来, 随着测序技术的成熟, 通过基因组差异区段的短序列测序来鉴定PVY株系是目前最接近基序测序分类法的思路, 其中一个差异区段位于外壳蛋白产物中, 外壳蛋白(coat protein, cp)是PVY10个重要的结构蛋白之一^{[24, 25]}, 由801个核苷酸组成, 编码267个氨基酸。通过焦磷酸测序法进行短序列测序, 从马铃薯病株上鉴定了一些PVY株系^{[26, 27]}。因此, cp基因序列分析在一定程度上对阐明PVY分类具有一定的参考作用。目前已报道的PVY在自然条件下极易发生基因重组或突变而产生具有不同致病力的新株系, 而青海省的PVY株系的组成是什么, 是否已经产生了新的株系, 尚未见到系统的研究报道, 因此, 研究青海马铃薯Y病毒的株系类别有助于了解该病毒的变异类型和流行区域的形成。本研究以青海地区流行的马铃薯Y病毒的cp基因进行测序分析, 研究其分子变异, 有助于掌握该病毒的类型和分布, 为制定PVY的综合防控策略提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

2016年5月— 8月, 在马铃薯生长期对青海省的马铃薯主产区进行田间调查, 调查方法为随机取样, 采集带有皱缩、重度花叶、黄化等明显症状的马铃薯叶片, 新鲜样本置于密封袋中, 保存于-80 ℃超低温冰箱。调查县区包括乐都、民和、互助、湟中、湟源、平安、大通和西宁(表1)。

表1 样品来源 Table 1 Sources of samples

1.2 试剂

Trizol、DEPC、TransScript First-Strand cDNA购于Sigma公司; DNA Marker、Gel Purification Kit购于天根生化科技(北京)有限公司; EcoRⅠ 限制性内切酶购于Promega公司; RNase抑制剂、T4 DNA连接酶、琼脂糖凝胶回收试剂盒、pGM-T easy PCR产物克隆试剂盒、质粒小提试剂盒购于北京天为时代科技有限公司; 引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成; 其他化学试剂均为分析纯。

1.3 引物设计与合成

PVY的cp基因在不同的PVY株系中具有高度保守性, 因此根据GenBank已公布的PVY常见株系cp基因的序列保守区, 用DNAMAN软件进行引物设计, 上游引物YCP1:5'-AACATAGGCTTGAGGCGA-3'; 下游引物YCP2:5'-ATGACGAAATCACCCTGC-3'。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4 马铃薯总RNA的提取

按照Trizol(Invitrogen)试剂盒提取样品总RNA。提取试验的所有离心操作均在4 ℃下完成, 用微量核酸测定仪(NanoDrop One)测定RNA浓度及纯度, 用电泳法检测RNA完整性, 然后-70 ℃超低温冰箱保存。

1.5 RT-PCR扩增PVY cp基因

1.5.1 cDNA第一链的合成

以感染PVY的马铃薯叶片总RNA为模板, 逆转录反应体系为20 μ L, 取植物总RNA提取液3 μ L(0.4 μ g· 样品^-1), 72 ℃变性后立即置于冰上, 加入下述反应混合液:M-MLV RT-Buffer 4 μ L, 10 mmol· L^-1 dNTPs 4 μ L, 40 U· μ L^-1 RNasin 1 μ L, 10 pmol· μ L^-1 PVY下游引物1 μ L, 200 U· μ L^-1 M-MLV反转录酶0.5 μ L, DEPC处理水6.5 μ L, 混合后42 ℃保存1 h, 95 ℃处理5 min。

1.5.2 RNA质量和马铃薯PVY病毒的RT-PCR检测

PCR反应扩增总体系为50 μ L∶ cDNA模板3 μ L, 10× PCR Buffer(Mg²⁺ free)5 μ L, 10 mmol· L^-1 dNTPs 3 μ L, 25 mmol· μ L^-1 MgCl₂ 2 μ L, 10 pmol· μ L^-1上下游引物各1 μ L, Taq DNA聚合酶0.5 μ L, ddH₂O 34.5 μ L。反应条件:94 ℃ 2 min; 94 ℃ 30 s, 55 ℃ 1 min, 72 ℃ 2 min, 35个循环; 72 ℃ 5 min, 4 ℃存放。

PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。PCR产物纯化后克隆至pGM-T载体上, 并转化至DH5α 感受态细胞中。经菌落PCR鉴定获得阳性重组质粒, 随机选择阳性克隆委托生工生物工程(上海)股份有限公司测序, 并通过测序峰图及序列比对分析排除由PCR扩增引起的突变。

1.6 序列分析与同源性比对

获得的序列利用SDT及DNAMAN 8.0软件进行序列比对, 获得序列一致率。从GenBank中选取已知株系的PVY cp基因序列作为参考, 利用MEGA 6.0软件中的最大似然法(maximum likelihood, ML)对分离获得的分离物构建系统进化树, 并分组。同时, 利用重组分析软件RDP4.0进行重组分析。

2 结果与分析

2.1 cp基因的扩增与克隆

将表现花叶、皱缩、黄化等症状的叶片进行病毒总RNA的提取、扩增, 1%的琼脂糖凝胶电泳结果显示, 样品得到了特异PCR条带, 阴性对照无扩增片段(图1)。测序结果表明, 该条带大小为1 157 bp, 与PVY的cp全序列预期结果一致, 表明克隆的条带为马铃薯Y病毒(PVY)基因。该基因序列包括NIb部分核苷酸序列(1~281 bp)、cp基因核苷酸序列(282~1 082 bp)和3'-UTR苷酸(1 083~1 157 bp)。该目的基因的开放阅读框有801个核苷酸, 编码一个由267个氨基酸组成的PVY外壳蛋白。

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	图1 PVY马铃薯分离物cp基因RT-PCR检测结果 M, 2 000 bp DNA marker; 1, 阴性对照; 2~4, 马铃薯分离物。Fig.1 RT-PCR products of PVY cp gene amplified from potato leaf total RNA M, 2 000 bp DNA marker; 1, Negative control; 2-4, Samples from potato.

2.2 cp基因序列一致率分析

PVY病毒cp基因的PCR扩增产物经测序后, 使用SDT和DANMAN软件将获得的16个PVY的cp基因序列和推导的氨基酸序列进行两两比对。结果表明, 16个分离物的核苷酸一致率为98.0%~100%, 氨基酸一致率为94.8%~100%。其中, Y5和Y36, 以及Y8、Y19、Y25之间核苷酸和氨基酸一致率最高, 均为100%。Y13与Y3、Y9、Y45、Y54核苷酸和氨基酸一致率最低, 分别为98.0%和94.8%(图2)。16个分离物的核苷酸一致性很高, 801个核苷酸中共有19个突变位点, 其中Y-7、Y-11、Y-13、Y-16和Y-41分离物中, 在第173处, 碱基C变成了A, 表示为g.173 C> A, 依次类推, g.577 A> G、g.792 T> C。Y-25、Y-45、Y-54和Y-19分离物中g.105 T> C。从采集样品的区域来看, 发生碱基突变的Y-7、Y-11、Y-13 、Y-16和Y-41的采集地分别是平安县石灰窑乡下滩村、互助县蔡家堡严下村、大通县朔北乡麻家庄、大通县东峡镇田家沟和民和县满平镇浪塘村。这说明青海省的PVY的分布有遗传因素的影响, 来自于地域的自然环境的影响很小, 没有规律可循。

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	图2 十六个分离物核苷酸一致率分析Fig.2 Nucleotide sequence identity matrix generated from coat protein gene of 16 isolates

16个分离物的氨基酸相对比较保守, 267个氨基酸共有9个突变位点, 分别为第70位的酪氨酸Y突变为谷氨酸E, 表示为Y70E, 依次类推, S83N、R88K、T130K、G176E、V200I、N210D、S343Y和A357V, 所有的核苷酸变异都是替换, 不存在碱基插入/缺失现象。

2.3 cp基因的重组分析

通过RDP4.0软件的重组分析, 结果发现, 本研究获得的16个分离物中没有发现重组位点。但来自波兰的分离物AJ890343检测到2个重组位点, 分别位于cp基因的594和792处(图3), 该重组体亲本一个来源于本实验分离的Y13(作为主要亲本), 另一个来源于GenBank中的加拿大Mb112(AY745491)分离物(作为次亲本)。RDP4软件中RDP、GENECONV、BootScan、MaxChi、Chimaera、SiScan这6种算法的平均P值分别为1.048× 10^-5、3.164× 10^-4、2.820× 10^-4、1.247× 10^-3、8.556× 10^-5和4.796× 10^-5。

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	图3 青海分离物cp基因潜在的重组事件Fig.3 Potential recombination events in cp gene of Qinghai isolate of PVY

2.4 cp基因的系统发育分析

将比对后的序列, 使用ML法建立的系统发育树(图4), 将GenBank中已知PVY分离物cp序列27个(表2)与本次实验中测定的PVY青海分离物16个cp序列一同构建进化树。分析结果表明, 在系统进化树中, 所有的序列可分为4个大的株系群, 分别为PVY^N-Wi株系群、PVY^O株系群、PVY^C株系群和PVY^N株系群, 其中, PVY^N-Wi株系群中包含了来自于我省所测定样品的11个样品, 分别是Y-19、Y-25、Y-8、Y-54、Y-45、Y-36、Y-35、Y-26、Y-9、Y-5和Y-3, 占所测样品的68.7%。这11个PVY马铃薯分离物的cp与来自欧洲波兰的08-rol菌株(登录号:JF804783)和斯洛伐克的SL16菌株(登录号:KX713170 )PVY^N-Wi株系遗传较近(表2)。另外的Y-7、Y-11、Y-16、Y-41和Y-13共5个分离物的cp属于PVY^O株系群, 其中前4个分离物与GQ20083相对较近, 而Y-13与U05509相对较近, 5个分离物占所测样品的31.3%, Y-7、Y-11、Y-16、Y-41这4个分离物虽然具有PVY^O株系的分子特征, 但在系统进化树中, 它们与来自美洲的4个PVY^O株系分离物也具有一定的距离, 说明来自中国的PVY^O株系具有明显的地域分子特征。而PVY^C株系和PVY^N株系群的样品则没有发现。青海省内不同县域的分离物地域间差异微小, 同源性很高, 说明PVY的种群基因较稳定。

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	图4 试验样品与各地样品的cp序列构建进化树Fig.4 Phylogenetic tree of cp sequences from the test samples and others

表2 各地的不同来源PVY cp基因序列 Table 2 PVY cp gene sequences from different sources around world

3 讨论

目前, 马铃薯Y病毒是造成马铃薯减产和品质下降的主要病害之一, 各地发生普遍且不同的地区生产条件和自然环境不同, 导致植物的症状也有差别, 从而对生产造成了严重的危害^{[3, 28]}。国内外学者利用植物病毒的保守区域对植物病毒进行株系鉴定等大量的研究, 生产上采用血清学方法和单克隆抗体对马铃薯Y病毒株系进行检测的方法容易造成漏检, 无法对株系进行准确鉴定^{[29, 30]}, 会对下一步工作造成影响。

以PCR为主要手段的分子检测能从核苷酸水平准确检测其基因型, 这对快速掌握和防控PVY流行趋势具有一定的指导意义^[26]。本研究设计的引物为扩增PVY cp基因全长序列, 其能提供更多的分型位点, 在一定程度上弥补血清学检测的不足。本试验对青海各地区的受PVY侵染的cp基因序列样品进行了RT-PCR扩增和测序。试验目的是检测青海省的马铃薯Y病毒是否存在有cp基因序列测序出现重组或突变的个体及群体, 并通过与世界其他地区PVY的cp基因进行比对分析, 进而对青海PVY种群的现状进行分子生物学评价。结果表明, 本次扩增的样品的cp基因全长801 bp。利用SDT和DNAMAN软件对16个分离物的cp基因序列进行分析, 发现cp核苷酸和氨基酸序列一致率较高, 分别达到98%和94.8%以上, 基因保守性高, 这与大多数研究的结果相同^[27]。

通过MAGA6.0对实验样品cp序列与GenBank中已知来自于国内外26个PVY cp基因序列进行进化分析发现, 16个分离物中的基因区段有11个与PVY^N-Wi株系较近, 说明该基因在病毒的生存和繁殖中起着十分重要的作用。前人研究表明, 在PVY全基因组上, PVY^{N∶ O}、PVY^N-Wi株系和PVY^O株系序列高度相似, 只是在P1和HC-Pro重组了PVY^N株系的序列^[30], 因此, 图4中PVY^{N∶ O}和PVY^N-Wi二者优先相聚成簇。虽然PVY cp基因高度保守, 但不同地区分离物也存在一定的分子变异, 16个 PVY 分离物共发现有26个碱基多态性位点发生突变。这些突变体都是通过核苷酸碱基置换形成的, 没有出现序列插入或缺失现象, 说明点突变在PVY进化中起着重要的作用。目前青海省的马铃薯田间PVY已经发生基因变异现象。

青海地区11个PVY马铃薯分离物与PVY^N-Wi株系的亲缘关系最近, 故而推断这11个分离物可能归属于PVY^N-Wi株系, 说明青海省的PVY群体可能以PVY^N-Wi株系为主, 高芳銮等^[30]通过对福建省17个PVY分离物的检测鉴定, 表明PVY在马铃薯主要种植区普遍发生的多为重组株系。这和笔者的观点相似。但由于PVY株系分化严重, 重组频繁, 单独使用cp基因序列为分子标记进行系统发育分析, 可能无法对PVY全部株系种类进行准确鉴定, 应该开展多基因联合方法鉴定。笔者联合P1和cp基因, 以及多重PCR等多种方法进一步验证后, 得到了与本文基本一致的系统发育分析结果(未发表数据)。16个样品PVY分离物多为PVY^N-Wi株系, 重组株系被认为可能比非重组株系具有更强的致病力^[31], 并已在世界各马铃薯种植区越来越流行, 因此, 生产上需要密切关注这些重组株系的发展动态。5个来自青海的PVY的cp与来自中国GQ200836(O)同属于有发生重组的PVY^O株系。虽然青海省大部分PVY有可能是随着国外品种资源的引进进入, 同时PVY也随着国内不同区域间的资源交流和种薯调运发生了重组, 但仍然有约30%的株系没有发生重组变异, 这些没有变异的株系以PVY^O株系为主。在本实验中未发现PVY^C株系、PVY^N株系、PVY^E株系和PVY^NTN株系。但由于可供分析的分离物样品数量有限, 不排除有PVY的其他株系的存在。或者通过种薯的区域间的相互调运, 不排除未来其他重组株系的发生。因此, 青海马铃薯PVY重组株系的发展趋势值得关注。

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[23]	梁五生, 温雪玮, 刘洪义, 等. 马铃薯Y病毒株系分类及中国大田马铃薯感染的马铃薯Y病毒株系谱研究进展[J]. 中国农学通报, 2015, 31(21): 136-143. LIANG W S, WEN X W, LIU H Y, et al. Progress of potato virus Y strain classification and analysis of profile of potato virus Y strains infecting potato in China[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2015, 31(21): 136-143. (in Chinese with English abstract) [本文引用:1]
[24]	李向东, 于晓庆, 古勤生, 等. 马铃薯Y病毒属病毒基因功能研究进展[J]. 山东科学, 2006, 19(3): 1-6. LI X D, YU X Q, GU Q S, et al. Advances on functional genomics of potyviruses[J]. Shand ong Science, 2006, 19(3): 1-6. (in Chinese with English abstract) [本文引用:1]
[25]	刘金亮. 四种马铃薯 Y 病毒属病毒的分子变异及HC-Pro结构对抑制RNA沉默的影响[D]. 泰安: 山东农业大学, 2007. LIU J L. Molecular variability of four potyviruses and the effect of HC-Pro structure on suppressing RNA silencing[D]. Tai'an: Shand ong Agriculture University, 2007. [本文引用:1]
[26]	刘洪义, 梁五生, 刘忠梅, 等. 应用焦磷酸测序鉴定马铃薯感染的马铃薯Y病毒株系[J]. 中国农学通报, 2013, 29(36): 140-146. LIU H Y, LIANG W S, LIU Z M, et al. Identification of potato virus Y strains in infected potato plants by pyrosequencing[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2013, 29(36): 140-146. (in Chinese with English abstract) [本文引用:2]
[27]	刘洪义, 梁五生, 刘忠梅, 等. 黑龙江省部分地区马铃薯Y病毒株系检测[J]. 东北农业大学学报, 2014, 45(1): 47-52. LIU H Y, LIANG W S, LIU Z M, et al. Identification of Potato virus Y strains in infected potato plants from some places of Heilongjiang Province[J]. Journal of Northeast Agricultural University, 2014, 45(1): 47-52. (in Chinese with English abstract) [本文引用:2]
[28]	HU X J, KARASEV A, BROWN C, et al. Sequence characteristics of potato virus Y recombinants[J]. Journal of General Virology, 2009, 90(12): 3033-3041. [本文引用:1]
[29]	WRÓBEL S. Modification of ELISA by replacing incubation of microtiter plates in an incubator with their shaking in PVY, PVM and PLRV detection[J]. American Journal of Potato Research, 2014, 91(4): 354-362. [本文引用:1]
[30]	高芳銮, 沈建国, 史凤阳, 等. 中国马铃薯Y病毒的检测鉴定及CP基因的分子变异[J]. 中国农业科学, 2013, 46(15): 3125-3133. GAO F L, SHEN J G, SHI F Y, et al. Detection and molecular variation of potato virus Y CP gene in China[J]. Scientia Agricultura Sinica, 2013, 46(15): 3125-3133. (in Chinese with English abstract) [本文引用:3]
[31]	史凤阳, 高芳銮, 沈建国, 等. 马铃薯Y病毒福建分离物P1基因的分子变异和结构特征[J]. 遗传, 2014, 36(7): 713-722. SHI F Y, GAO F L, SHEN J G, et al. Sequence variation of P1 gene in potato virus Y isolated from Fujian Province[J]. Hereditas, 2014, 36(7): 713-722. (in Chinese with English abstract) [本文引用:1]

2008

0.0

谢开云, 屈冬玉, 金黎平, 等. 中国马铃薯生产与世界先进国家的比较[J]. 世界农业, 2008(5): 35-38.

XIE K

, QU D

, JIN L

, et al. Comparison of potato production between China and the advanced countries in the world[J]. World Agriculture, 2008 (5): 35-38. (in Chinese)

马铃薯在提供营养全面的食物、保证粮食安全、提高能源安全、帮助农民脱贫致富、促进冬季农业发展等方面发挥了巨大作用,因此马铃薯能够得到世界各国,特别是发展中国家的重视,在农业和农村经济中发挥更大的作用.为了进一步发挥马铃薯的多功能作用、提高薯农种植效益、保证马铃薯产业健康发展,有必要了解中国马铃薯生产与国外先进国家的差距,采取相应的解决措施,缩小与先进国家的差距,提升中国马铃薯的生产水平.

... 马铃薯在保障我国粮食安全,促进农业增效、农民增收、振兴农业经济方面具有重要意义^[1] ...

2018

0.0

... 青海省位于黄土高原和青藏高原交汇地带,生态类型复杂,海拔较高,气候冷凉,秋季雨多,作物生长周期长,日照充足,昼夜温差大,土壤疏松富含钾,无污染,有着适宜马铃薯生长的得天独厚的气候资源^[2] ...

2011

0.0

... 在马铃薯生长过程中,常受到多种病害的侵扰^[3,4],其中,马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)是目前青海省感染马铃薯并造成最严重经济损失的病毒之一^[5] ...

... 3 讨论目前,马铃薯Y病毒是造成马铃薯减产和品质下降的主要病害之一,各地发生普遍且不同的地区生产条件和自然环境不同,导致植物的症状也有差别,从而对生产造成了严重的危害^[3,28] ...

2013

0.0

... 在马铃薯生长过程中,常受到多种病害的侵扰^[3,4],其中,马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)是目前青海省感染马铃薯并造成最严重经济损失的病毒之一^[5] ...

2019

0.0

... 在马铃薯生长过程中,常受到多种病害的侵扰^[3,4],其中,马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)是目前青海省感染马铃薯并造成最严重经济损失的病毒之一^[5] ...

2005

0.0

... PVY是马铃薯Y病毒属(Potyvirus)的代表成员^[6,7],其寄主范围十分广泛,自然条件下超过9个科包括茄科在内的14个属^[8],能够引起马铃薯花叶、黄化、矮缩等病症,导致产量和品质下降 ...

2003

0.0

2010

0.0

2006

0.0

... 7 kb,是一种正义单链RNA病毒^[9] ...

1984

0.0

... 作为RNA病毒,PVY具有明显的株系分化现象,PVY株系原本有PVY^O株系、PVY^N株系和PVY^C株系3种,又产生了PVY^NTN株系^[10,11]、PVY^NW株系^[12,13]、PVY^{N#cod#x02236 ...}

2004

0.0

2009

0.0

2011

0.0

2010

0.0

... O株系^[14]、PV YNA-NTN株系^[15]、PVY^Z株系^[16]等新株系 ...

1991

0.0

... O株系^[14]、PV YNA-NTN株系^[15]、PVY^Z株系^[16]等新株系 ...

1994

0.0

... O株系^[14]、PV YNA-NTN株系^[15]、PVY^Z株系^[16]等新株系 ...

2014

0.0

... 关于对PVY新分离物株系检测,目前研究人员一般通过个别基因(和/或其编码产物)^[17]或全基因组序列^[18]的同源度比对结果来确定其株系类别,或通过血清型^[19]、基因组重组与否^[20]、马铃薯块茎坏死环斑病效应^[21]、过敏反应互作基因^[22]这些标准来确定其株系类别 ...

2017

0.0

2007

0.0

2003

0.0

2013

0.0

2008

0.0

2015

0.0

... 鉴于PVY株系群体的复杂性,而上述PVY株系分类方法都无法完全区分所有PVY株系类别,存在这样或那样的缺陷^[23] ...

2006

0.0

... 近年来,随着测序技术的成熟,通过基因组差异区段的短序列测序来鉴定PVY株系是目前最接近基序测序分类法的思路,其中一个差异区段位于外壳蛋白产物中,外壳蛋白(coat protein,cp)是PVY10个重要的结构蛋白之一^[24,25],由801个核苷酸组成,编码267个氨基酸 ...

2007

0.0

2013

0.0

... 通过焦磷酸测序法进行短序列测序,从马铃薯病株上鉴定了一些PVY株系^[26,27] ...

... 以PCR为主要手段的分子检测能从核苷酸水平准确检测其基因型,这对快速掌握和防控PVY流行趋势具有一定的指导意义^[26] ...

2014

0.0

... 通过焦磷酸测序法进行短序列测序,从马铃薯病株上鉴定了一些PVY株系^[26,27] ...

... 8%以上,基因保守性高,这与大多数研究的结果相同^[27] ...

2009

0.0

2014

0.0

... 国内外学者利用植物病毒的保守区域对植物病毒进行株系鉴定等大量的研究,生产上采用血清学方法和单克隆抗体对马铃薯Y病毒株系进行检测的方法容易造成漏检,无法对株系进行准确鉴定^[29,30],会对下一步工作造成影响 ...

2013

0.0

高芳銮, 沈建国, 史凤阳, 等. 中国马铃薯Y病毒的检测鉴定及CP基因的分子变异[J]. 中国农业科学, 2013, 46(15): 3125-3133.

GAO F

, SHEN J

, SHI F

, et al. Detection and molecular variation of potato virus Y CP gene in China[J]. Scientia Agricultura Sinica, 2013, 46(15): 3125-3133. (in Chinese with English abstract)

【Objective】 The objectives of this study are to investigate the occurrence of Potato virus Y (PVY) disease in China, to develop fast and accurate PVY detection methods and to understand sequence variations in PVY CP gene.【Method】ELISA method was used to detect the infected leaf samples randomly collected from 14 provinces (municipalities) in China during 2011 and 2012. A subsample of the infected leaves was examined using a transmission electron microscope. CP gene of PVY was amplified by reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) using a pair of degenerate primers designed from the conserved regions of published CP gene sequences. Sequence variation was analyzed and phylogenetic tree was re-constructed using Bayesian inference method.【Result】ELISA revealed that 220 out of the 691 samples assayed were infected with PVY. The pin-wheel inclusion bodies were visualized clearly under the transmission electron microscope in the subsamples of ELISA-positive leaves. RT-PCR amplifications of the 14 ELISA-positive subsamples randomly selected from different provinces (municipalities) all generated an expected fragment of ≈800 bp in size. CP genes in the selected 14 subsamples shared more than 88% nucleotide identity with the reported sequences in other PVY strains. Among the 14 CP gene sequences in the subsamples, 29 polymorphic sites were detected, including 6 parsimony informative and 23 singleton variable sites. Some of the sequence variations were geography-specific. Bayesian inference of phylogenetic trees revealed that 14 PVY isolates were in the same branch with reference PVYN:O strains, suggesting that the 14 PVY isolates analyzed in this study shared high homology with PVYN:O strain.【Conclusion】CP gene in PVY is highly conserved but some geographical variation in sequences exists. The results reported in this manuscript provide useful insights in understanding the evolution of PVY, the epidemiology and control of PVY disease in potato.

1.Key Laboratory of Plant Virology of Fujian Province, Institute of Plant Virology, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002 2.Inspection & Quarantine Technology Center, Fujian Exit-Entry Inspection and Quarantine Bureau, Fuzhou 350001

【目的】查明马铃薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）病在中国的发生情况，及时、准确地鉴定出PVY并对其分子变异进行分析。【方法】采用ELISA 方法对采自中国14个省（直辖市）马铃薯种植区疑似受PVY感染的样品进行了检测，并对其中的部分材料镜检验证，然后根据CP基因序列设计1对简并引物针对随机选择感染PVY的14个省（直辖市）代表样品进行CP基因扩增克隆，将测序得到的序列进行分子变异分析，并使用贝叶斯法（Bayesian inference，BI）重建系统发育关系。【结果】ELISA检测结果表明，691份样品中220个样品与PVY抗体呈阳性反应，其余呈阴性反应；ELISA检测的阳性材料在透射电镜下均可观察到明显的风轮状内含体，14个PVY分离物均成功扩增出预期大小（约800 bp）的特异性片段，CP基因的核苷酸序列与已报道PVY不同株系的核苷酸序列一致性均在88%以上；在14个PVY分离物CP基因中共发现有29个多态性位点，其中6个简约信息位点，23个单一变异位点。系统发育分析结果显示，14个PVY分离物与PVYN:O株系相聚成簇，表明其在系统发育关系上，与PVYN:O株系的亲缘关系最近。【结论】PVY CP基因高度保守，但不同地区分离物也存在一定的分子变异，本研究可为今后了解PVY病毒病流行、变异趋势及其防治提供依据。

... O、PVY^N-Wi株系和PVY^O株系序列高度相似,只是在P1和HC-Pro重组了PVY^N株系的序列^[30],因此,图4中PVY^{N#cod#x02236 ...}

... 青海地区11个PVY马铃薯分离物与PVY^N-Wi株系的亲缘关系最近,故而推断这11个分离物可能归属于PVY^N-Wi株系,说明青海省的PVY群体可能以PVY^N-Wi株系为主,高芳銮等^[30]通过对福建省17个PVY分离物的检测鉴定,表明PVY在马铃薯主要种植区普遍发生的多为重组株系 ...

2014

0.0

史凤阳, 高芳銮, 沈建国, 等. 马铃薯Y病毒福建分离物P1基因的分子变异和结构特征[J]. 遗传, 2014, 36(7): 713-722.

SHI F

, GAO F

, SHEN J

, et al. Sequence variation of P1 gene in potato virus Y isolated from Fujian Province[J]. Hereditas, 2014, 36(7): 713-722. (in Chinese with English abstract)

To understand the sequence variation and the putative protein structure of P1 gene in Potato virus Y (PVY) and to identify the sources of the variation, P1 gene in PVY isolated from Fujian Province was amplified by reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) using a pair of degenerate primers designed from the conserved regions of published sequences. Sequence variation and putative protein structure were analyzed, and phylogenetic tree was reconstructed using Bayesian inference method. Expected fragments of 915 bp in size were amplified from 12 samples collected from Fujian Province by RT-PCR. The 12 sequences shared 73%-99% nucleotide identity with the reference sequences from GenBank. A strong recombination signal was identified at position 309 in sequences of isolates QK44, XT02, XT08 and LH05. Among the 12 sequences, 85 amino acid variants were detected, indicating high sequence variation in the P1 protein. However, positions 41-275 in the protein were highly conserved, especially in three active sites (H 192 , D 201 and V 235 ). Phylogenetic analysis grouped the sequences into three clades, each with different Coiled-coil domains and 3D-structures, suggesting divergent phylogenetic relationship among the groups. The above results show P1 gene in PVY is highly variable but contains 3 conserved active sites (H 192 , D 201 , V 235 ) and the high genetic variation in the gene is primarily due to mutation and recombination.

1. Key Laboratory of Plant Virology of Fujian Province, Institute of Plant Virology, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China; 2. Inspection & Quarantine Technology Center, Fujian Exit-Entry Inspection and Quarantine Bureau, Fuzhou 350001, China

为揭示马铃薯Y病毒(Potato virus Y, PVY)P1基因的分子变异及结构特征, 并查明福建分离物P1基因的变异来源。文章设计一对简并引物从感染PVY的马铃薯病叶扩增、克隆获得福建分离物P1基因的cDNA全长序列, 分析其核苷酸序列和氨基酸序列的特征, 并采用贝叶斯法重建P1基因的系统发育树。结果显示, 12个福建分离物均成功扩增出预期大小(约915 bp)的特异性片段, P1基因的核苷酸序列与已报道的PVY不同株系的核苷酸序列一致性为73%~99%; QK44、XT02、XT08、LH05分离物的309 nt位置均检测到一个强烈的重组信号。12个PVY分离物中, P1蛋白有85个变异的氨基酸位点, 表明其高度变异; P1蛋白的第41~275位是一个高度保守的结构功能域, 含有3个保守的活性位点(H 192 、D 201 、V 235 ); 系统发育分析显示, 福建分离物形聚为3种不同的簇, 其对应的卷曲结构(Coiled-coil domain)和空间结构也不相同, 表明不同株系型的P1基因在系统发育关系上分化较大。该研究结果表明PVY P1基因在核苷酸序列、氨基酸序列以及空间结构具有高度变异性, 但行使P1蛋白功能的活性位点所在的氨基酸(H 192 、D 201 和V 235 )均高度保守; 福建分离物P1基因的变异源主要来自碱基突变和基因重组。

... 16个样品PVY分离物多为PVY^N-Wi株系,重组株系被认为可能比非重组株系具有更强的致病力^[31],并已在世界各马铃薯种植区越来越流行,因此,生产上需要密切关注这些重组株系的发展动态 ...