甜高粱生物学性状与SSR分子标记遗传多样性
赵文杰1, 徐薇1, 张景龙2, 程爽1, 郑甲成1, 刘言龙1, 殷世霞1, 李杰勤1, 詹秋文1,*
1.安徽科技学院 农学院,安徽 凤阳 233100
2.南京农业大学 草业学院,江苏 南京 210095
*通信作者,詹秋文,E-mail: qwzhan@163.com

作者简介:赵文杰(1992—),女,河南巩义人,硕士研究生,主要从事高粱分子遗传研究。E-mail: 930076160@qq.com

摘要

为探讨甜高粱的遗传多样性,选取31份甜高粱品种资源,通过生物学性状的方差分析、相关分析、主成分分析、聚类分析和SSR分子标记试验,获得如下结果:13个生物学性状在品种资源间存在显著差异,说明品种资源间的产量和品质差异真实存在;生物学性状之间存在一定相关性,其中株高与茎粗、鲜质量和叶片数呈极显著正相关,茎粗与鲜质量、粗蛋白和粗脂肪呈极显著正相关;分蘖数与茎粗呈极显著负相关,茎粗与粗纤维呈极显著负相关。主成分分析可以将前4个主成分作为品质主因子、产量主因子、糖分和产量次因子,以及产量辅助因子;基于生物学性状的聚类分析可以将全部品种资源分成6大类群,其中第Ⅰ类属于高产型,第Ⅱ类属于高产低质型,第Ⅲ类属于高含糖量型,第Ⅳ、Ⅴ类群利用价值不大,第Ⅵ类属于高分蘖型。根据SSR分子标记分析结果计算得到甜高粱品种资源每个位点的多态信息含量(PIC)为0~0.757,基于SSR分子标记的聚类分析将全部品种资源聚为6大类群,这与生物学性状聚类结果相类似,但又不完全一致。

关键词: 甜高粱; 生物学性状; SSR标记; 遗传多样性; 聚类分析
中图分类号:S514 文献标志码:A 文章编号:1004-1524(2019)12-1945-10
Genetic diversity of sweet sorghum as revealed by biological characters and SSR markers
ZHAO Wenjie1, XU Wei1, ZHANG Jinglong2, CHENG Shuang1, ZHENG Jiacheng1, LIU Yanlong1, YIN Shixia1, LI Jieqin1, ZHAN Qiuwen1,*
1. College of Agriculture, Anhui Science and Technology University, Fengyang 233100, China
2. College of Prataculture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
Abstract

In order to explore the genetic diversity of sweet sorghum, 31 varieties of sweet sorghum were selected in this experiment. Through variance analysis, correlation and principal component analysis, cluster analysis of biological traits and SSR molecular marker test, the following results were obtained. Thirteen biological traits had significant differences among varieties, indicating there were differences in yield and quality of varieties. There was certain correlation between biological traits. Plant height was positively correlated with stem diameter, fresh weight and leaf number, and stem diameter was positively correlated with fresh weight, crude protein and ether extract at 0.01 level. There were significant negative correlations between tiller number and stem diameter, and between stem diameter and coarse fiber at 0.01 level. Principal component analysis could take the first four principal components as principal components factor of quality, main factor of yield, sugar content and secondary factor of yield, auxiliary factor of yield. Cluster analysis based on biological characteristics could divide all varieties into six groups. Group Ⅰ belonged to high yield type. Group Ⅱ belonged to high yield but low quality type. Group Ⅲ belonged to high sugar content type. Group Ⅳ and Ⅴ had little utilization value, and Group Ⅵ belonged to high tillering type. According to the results of SSR molecular marker analysis, the polymorphism information content (PIC) of sweet sorghum cultivar resources was 0-0.757. All varieties were divided into six groups based on SSR molecular marker analysis, and this was similar to the clustering results of biological traits, but it was not exactly the same.

Keyword: sweet sorghum ( Sorghum bicolor L. Moench); biological characters; SSR marker; genetic diversity; cluster analysis

随着经济快速发展, 资源短缺, 生态环境日益恶化, 以天然草地为主的草原畜牧业已没有优势可言, 畜牧业迅速发展与饲料短缺的矛盾日益突出。因此, 人类亟需探索新的可再生资源, 来缓解人类消费与生态环境失衡、资源短缺间的矛盾。甜高粱(Sorghum bicolor)属于禾本科高粱属, 为粒用高粱的一个变种[1], 是一种高大、靠种子繁殖、茎中富含糖汁、生长速度快、生物量大、光能转化效率高的C4作物[2]。甜高粱除了可产出2.25~6.00 t· hm-2的籽粒外, 其茎秆含糖量丰富, 是生产乙醇的最佳原料之一[3]。甜高粱耐涝、耐旱、耐盐碱、耐肥、适应性强、茎秆鲜嫩、叶片柔软、适口性好, 在pH为5.0~8.5的土壤中均可种植[4, 5], 其合成的碳水化合物为玉米的3.2倍[1]。甜高粱既可做饲草喂养牲畜, 又可用于燃料乙醇、制糖、酿酒等产业。近年来, 甜高粱作为青贮饲料和生物质能源作物受到国内外广泛关注[6, 7, 8], 并得到作物育种和农业生产部门的高度重视。合理开发利用甜高粱资源, 对于保障粮食安全, 解决能源危机, 促进畜牧业发展具有重要意义。

作物的遗传多样性研究可以了解不同作物品种的遗传背景与遗传关系并拓宽其遗传基础。以往遗传多样性分析多采用数值分类方法[9, 10], 但随着分子生物技术的发展, 随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphism DNA, RAPD)、限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)、简单重复序列(simple sequence repeat, SSR)等分子标记技术得到广泛的应用[3, 11], 其中SSR是一种共显性标记, 操作方法简单, 具有很好的稳定性和重复性, 可为作物遗传多样性分析提供比显性标记更为丰富的信息[11]。我国的甜高粱品种资源丰富, 表型多样, 遗传差异较大, 大多数地区甜高粱栽培品种混杂, 生长优势弱, 单产低下, 限制了农民种植甜高粱的积极性[12]。目前, 甜高粱资源的研究主要依靠农艺性状观察, 甜高粱育种中亲本的选配和组合配置中都存在很大盲目性。Ali等[13]用SSR标记分析了72个甜高粱材料, 得到的聚类结果与已知的家谱和遗传背景信息相吻合。本研究选取31份甜高粱品种资源, 通过方差分析、相关分析、主成分分析、聚类分析与SSR分子标记分析, 旨在探讨甜高粱的遗传多样性, 为甜高粱资源利用与遗传育种提供理论依据。

1 材料与方法
1.1 试验材料

供试材料见表1。其中, 1~30号由中国农业科学院国家种质库提供, 31号从美国引进。

表1 供试材料的序号、名称与地理来源 Table 1 Experimental number, name and sources of materials used in the study
1.2 试验方法

1.2.1 试验设计与指标测定

全部试验材料于2015年5月8日播种于安徽科技学院种植科技园, 完全随机设计, 3次重复。在本地甜高粱青贮能源收获期(8月21日), 每份材料随机抽取3株, 调查分蘖数、叶片数、株高、倒2叶长、倒2叶宽、茎粗, 并称量茎叶全株鲜质量, 采用日本ATAGO PAL-1手持数显折光仪测定茎秆含糖量(糖锤度, BX, %)。取全株样本带回实验室, 进行品质分析[14], 其中粗蛋白含量(以干质量计, %)测定采用凯氏定氮法, 粗脂肪含量(以干质量计, %)测定采用油重法, 粗纤维(以干质量计, %)测定采用酸洗涤法, 粗灰分含量(以干质量计, %)测定采用马福炉灼烧法。

1.2.2 DNA提取与SSR分子标记检测

甜高粱DNA的提取采用CTAB法[11]。DNA提取后, 利用核酸测定仪测定DNA浓度, 测得D260/D280为1.78~1.97, 表明所提取的DNA纯度较高, 质量较好, 可以用于后续试验。SSR引物序列来源于http://www.gramene.org/markers/index.html, 选取276对SSR引物, 由宝生物工程(大连)有限公司合成。PCR扩增采用10 μ L反应体系, 扩增程序与扩增产物电泳方法参照文献[11]

1.2.3 数据分析

各生物学性状取全部观察个体的平均值。采用SPSS软件进行方差分析、相关分析、主成分分析, 其中对于品质性状数据, 除无氮浸出物外其余指标均反正弦转换后再进行方差分析; 采用NTSYSpc 2.10e数据软件, 先对各性状数据标准化后聚类分析, 运算函数选择EUCLID[15]

每个SSR位点以1和0记录等位基因的有和无。根据多态信息含量(polymorphism information content, PIC)的计算公式VPIC=1- Pij2, 计算每个位点的多态信息含量。其中, VPIC是PIC的值, Pij是根据第i个位点所有等位基因计算出的第j个等位基因的频率。用NTSYSpc 2.10e软件计算相似性系数, 并获得DICE相似系数矩阵, 采用SAHN程序和UPGMA方法进行聚类分析。

2 结果与分析
2.1 甜高粱生物学性状的方差分析

方差分析结果表明, 13个生物学性状在31份甜高粱品种间存在显著差异(表2表3), 说明此甜高粱群体品种间有真实差异, 需要进一步分析。在产量性状中(表2), 株高的变异系数为20.35%, 最高者为29号品种(贵州甜高粱, 381.67 cm), 但与13号(英山甘蔗粱)、17号(墨江高粱蔗)、18号(镇雄甜高粱)、21号(甜选153)、25号(三峡甜高粱01)、26号(三峡甜高粱02)、27号(海南甜高粱)、28号(凤山甜高粱)品种间无显著差异; 其次是22号(四川甜高粱01)、24号(贵州甜秆高粱)和30号(平兴甜黍秆)品种, 以上这些品种株高均在300 cm以上; 最小为2号品种(黑龙江甜秆, 178.00 cm)。茎粗的变异系数为15.23%, 最粗者为24号品种(贵州甜秆高粱, 21.60 mm), 但与28号(凤山甜高粱)品种无显著差异, 且茎粗都在20 mm以上; 最细为2号品种(黑龙江甜秆, 9.98 mm)。分蘖数的变异系数最大, 为56.15%, 最多者为1号(怀德甜高粱)和2号(黑龙江甜秆)品种, 均有6个分蘖, 且两者间无显著差异; 最少为4号品种(武乡甜秆茭, 0.33个)。鲜质量的变异系数达49.86%, 最大为28号品种(凤山甜高粱, 2.32 kg), 但与23号(四川甜高粱02)、24号(贵州甜秆高粱)、27号(海南甜高粱)、29号(贵州甜高粱)和31号(M-81E)品种间无显著差异; 最小为8号品种(新宾甜高粱, 0.35 kg)。

表2 三十一份甜高粱产量性状的多重比较结果 Table 2 Multiple comparison results of yield characters of 31 sweet sorghum varieties
表3 三十一份甜高粱品质性状的多重比较结果 Table 3 Multiple comparison results of quality characters of 31 sweet sorghum varieties

在品质性状中(表3), 含糖量的变异系数为14.59%, 最高者为26号品种(三峡甜高粱02, 18.53%), 但与1号(怀德甜高粱)、3号(屯留甜茭子)、4号(武乡甜秆茭)和31号(M-81E)等品种无显著差异, 最低者为2号(黑龙江甜秆)和30号(平兴甜黍秆), 均为10.87%。粗蛋白含量的变异系数最高, 为20.84%, 含量最高者为28号品种(凤山甜高粱, 5.13%), 但与5号(阿鲁甜高粱01)、19号(甜选7)、20号(甜选43)、24号(贵州甜秆高粱)和26号(三峡甜高粱02)品种之间无显著差异, 最低者为9号品种(肇东甜高粱, 2.27%)。粗脂肪的变异系数为14.39%, 含量最高者为24号品种(贵州甜秆高粱, 2.05%), 但与5号(阿鲁甜高粱01)、6号(阿鲁甜高粱02)、9号(肇东甜高粱)、14号(辉南甜高粱)、15号(宁陕小甜高粱)、16号(商南甘芝甜高粱)、17号(墨江高粱蔗)、19号(甜选7)、20号(甜选43)、21号(甜选153)、22号(四川甜高粱01)、23号(四川甜高粱02)、26号(三峡甜高粱02)、27号(海南甜高粱)和28号(凤山甜高粱)品种之间无显著差异, 最低者为12号品种(竹山小甜秆, 1.21%)。

2.2 甜高粱生物学性状的相关分析

由13个生物学性状相关分析可知(表4), 株高与茎粗、鲜质量和叶片数呈极显著正相关, 茎粗与鲜质量、粗蛋白和粗脂肪呈极显著正相关, 含糖量仅与无氮浸出物呈极显著正相关, 这是因为无氮浸出物越高, 可溶性单糖和双糖等含量越多所致。鲜质量与粗蛋白、株高、叶片数, 以及茎粗呈极显著正相关, 说明在一定范围内, 株高、叶片数和茎粗对鲜质量有极显著正向贡献。分蘖数与茎粗呈显著负相关, 说明随着分蘖数的增多, 主茎中的营养物质分流, 导致主茎变细; 茎粗与粗纤维呈极显著负相关, 表明甜高粱茎越细, 植株自身为了支撑直立生长, 抵抗倒伏, 茎秆内粗纤维含量升高。

表4 甜高粱各生物学性状间的相关系数 Table 4 Correlation coefficient of biological characters of sweet sorghum
2.3 甜高粱生物学性状的主成分分析

对全部生物学性状进行主成分分析, 得到各性状前4个主成分的特征向量(表5)。前4个成分的累计贡献率达81.12%(> 80%), 基本可代表全部生物学性状指标。

表5 各生物学性状前4个主成分的特征向量 Table 5 Eigenvectors of the first 4 principal component factors of each trait

主成分1的特征值为5.07, 占原始数据变异的38.99%, 其中粗蛋白、粗脂肪和粗灰分的正值较大, 粗纤维负值最大, 说明该主成分主要决定甜高粱的品质, 可将该主成分称为“ 品质因子” 。

主成分2的特征值为2.57, 占原始数据变异的19.74%, 其中株高、倒2叶长、倒2叶宽、叶片数和鲜质量正值较大, 含糖量、粗脂肪、无氮浸出物均为较高负值, 说明该主成分主要体现在甜高粱的产量性状上。因此, 可将第2主成分称为“ 产量因子” 。

主成分3的特征值为1.59, 占原始数据变异的12.25%, 其中株高、含糖量和叶片数的正值居前三位, 可称为“ 糖分和产量次因子” 。

主成分4的特征值为1.32, 占原始数据变异的10.14%, 其中分蘖数、鲜质量和叶片数的正值较大, 因此可将该主成分称为“ 产量辅助因子” 。

2.4 甜高粱基于生物学性状的聚类分析

对31份甜高粱进行聚类分析, 结果见图1, 其中13号(英山甘蔗粱)与25号品种(三峡甜高粱01)间的EUCLID距离最小(1.305), 两品种均来自湖北; 2号(黑龙江甜秆)与来自广西的28号品种(凤山甜高粱)距离最大(10.379), 平均EUCLID距离4.839。在UCLID距离为4.250处可将31份品种分成6大类。

图1 基于生物学性状的甜高粱品种聚类分析结果
编号131同表1
Fig.1 Clustered results of 31 sweet sorghum varieties based on biological characters
No. 1-31 were the same as table 1.

第Ⅰ 类包括2份品种, 即24号(贵州甜秆高粱)和28号品种(凤山甜高粱)。2份品种的产量核心指标鲜质量和茎粗居前列, 叶片数、粗蛋白和粗脂肪含量均高于其他类群的平均值, 但品质核心指标含糖量偏低。因此, 第Ⅰ 类属于高产型。

第Ⅱ 类仅包括1份品种, 即29号品种(贵州甜高粱), 其株高、叶片数在6个类群中最高, 鲜质量也居前列, 但无氮浸出物含量最低, 粗蛋白偏低, 含糖量不高, 且粗纤维含量偏高。因此, 第Ⅱ 类属于高产低质型。

第Ⅲ 类包括5号(阿鲁甜高粱01)、6号(阿鲁甜高粱02)、14号(辉南甜高粱)、15号(宁陕小甜高粱)、16号(商南甘芝甜高粱)、19号(甜选7)、20号(甜选43)、21号(甜选153)、22号(四川甜高粱01)、26号(三峡甜高粱02)和27号(海南甜高粱)共11份品种, 集中了大部分含糖量高的材料。因此, 第Ⅲ 类属于高含糖量型。

第Ⅳ 类包括14份品种。该类可以进一步细分为2亚类, 第1亚类包括3号(屯留甜茭子)、4号(武乡甜秆茭)、7号(法库甜秆)、8号(新宾甜高粱)、10号(泗县甜秆秫秫)、12号(竹山小甜秆)、13号(英山甘蔗粱)和25号(三峡甜高粱01)共8份品种, 这些品种在鲜质量上表现最差, 却在含糖量上表现较好; 第2亚类包括11号(定远甜到稍)、30号(平兴甜黍秆)、17号(墨江高粱蔗)、18号(镇雄甜高粱)、23号(四川甜高粱02)和31号(M-81E)共6个品种, 这些品种鲜质量较高, 但含糖量较低。

第Ⅴ 类只含1份品种, 即9号品种(肇东甜高粱), 其无氮浸出物含量最高, 分蘖较多, 但是茎秆纤细、植株矮、鲜质量偏低, 鲜质量和含糖量一般。综上, 第Ⅳ 、Ⅴ 类利用价值不大。

第Ⅵ 类包括2份品种, 即1号(怀德甜高粱)和2号品种(黑龙江甜秆)。2份材料分蘖最多, 但茎秆纤细、植株较矮、叶片数偏少, 鲜质量和含糖量均不高。因此, 本类属于高分蘖型。

2.5 高粱SSR遗传多态性分析

用276对SSR引物在31份甜高粱材料中筛选, 获得条带清晰、多态性丰富的46对SSR引物, 其扩增片段大小为180~300 bp, 多态性比率为100%(图2)。46对引物共扩增出114个等位基因, 每对引物的等位基因变幅为1~6, 平均2.478个。

图2 引物S182在31份甜高粱品种的扩增结果
M, DL 600 marker; 编号1~31同表1
Fig.2 Amplification of primer S182 in 31 sweet sorghum varieties
M, DL 600 marker; No. 1-31 were the same as table 1.

多态信息含量(PIC)分析表明, SSR标记PIC变幅较大, 最小值为0, 最大值为0.757, 平均为0.334(表6), 说明不同SSR引物检测出的多态性差异较大。

表6 四十六对引物在31份甜高粱品种中检测到的等位基因数目与PIC值 Table 6 Number of alleles and PIC values detected in 31 sweet sorghum varieties by using 46 pairs of primer
2.6 甜高粱基于SSR分子标记的聚类分析

根据31份甜高粱扩增谱带的0、1数据, 计算两两品种间的DICE遗传相似系数, 最大为0.93(来自山西的4号与来自吉林的14号品种), 最小为0.08(来自黑龙江的9号与来自四川的22号品种), 平均相似系数为0.656。根据相似系数构建的31份品种的聚类图见图3。以相似系数0.678作为分类临界值, 可将31份材料分成6大类。

图3 基于SSR分子标记的甜高粱品种聚类分析结果Fig.3 Clustered results of 31 sweet sorghum varieties base on SSR markers

第Ⅰ 类只包含9号品种(肇东甜高粱), 正好对应于生物学性状聚类获得的第Ⅴ 类; 第Ⅱ 类只含有31号品种(M-81E), 系本试验唯一从美国引进的甜高粱推广品种; 第Ⅲ 类只含有29号品种(贵州甜高粱), 正好对应于生物学性状聚类分析的第Ⅱ 类; 第Ⅳ 类包括27号(海南甜高粱)和30号品种(平兴甜黍秆), 分别位于生物学性状聚类结果的第Ⅲ 、Ⅳ 类群; 第Ⅴ 类共3个品种, 即11号(定远甜到稍)、23号(四川甜高粱02)和24号(贵州甜秆高粱)品种, 其中11号(定远甜到稍)和23号(四川甜高粱02)品种属于生物学性状聚类分析第Ⅳ 类中的第2亚类, 但是24号品种(贵州甜秆高粱)却属于生物学性状聚类中的第Ⅰ 类; 第Ⅵ 类为剩余的23个品种, 分布在生物学性状聚类结果的第Ⅰ 、Ⅲ 、Ⅳ 、Ⅵ 类, 却正好涵盖了生物学性状聚类结果的第Ⅵ 类。因此, 2种分析结果具有一定相似性, 但又不完全一致。

3 讨论
3.1 方差分析对甜高粱聚类分析中生物学性状指标重要性的确认

通过生物学性状的数值分析, 可以评价不同作物品种间的相似性[9, 10]。本文正是基于这一观点开展了31份甜高粱材料的遗传多样性研究, 并通过聚类分析获得全部甜高粱品种间的遗传距离。冯国郡等[4]利用24个质量和数量性状对新疆的甜高粱种质资源多样性表现进行了分析。然而, 聚类分析结果是否正确, 必须通过方差分析予以确认。本研究结果表明, 7个产量性状和6个品质性状在甜高粱品种间差异均显著, 说明所选取的13个生物学性状指标能够准确反映供试品种间的差异, 这为甜高粱育种工作中亲本的选配和后代组合的鉴定提供了理论依据。

3.2 生物学性状和SSR分子标记2种聚类结果的比较

为了准确揭示不同甜高粱品种的亲缘关系, 本研究进一步采用SSR分子标记进行分析, 发现基于生物学性状和SSR分子标记的聚类分析结果类似, SSR聚类中的第Ⅰ 类正好对应于生物学性状聚类的第Ⅴ 类, 第Ⅱ 类包含在生物学性状聚类第Ⅳ 类的第2亚类中, 第Ⅲ 类对应于生物学性状聚类分析中的第Ⅱ 类, 第Ⅵ 类涵盖了生物学性状聚类结果的第Ⅵ 类等。然而, 2种聚类结果又不完全一致, 如SSR聚类中的第Ⅳ 类、第Ⅴ 类在生物学性状聚类中找不到完全对应的分类群。主要原因是2种聚类分析依赖的基础数据不同, 31份甜高粱种质材料生物多样性丰富, 可能易受环境条件和基因显隐性的影响, 遗传表达不稳定; 而SSR分子标记检测的目标是基因组中的非功能区域, 检测结果相对比较稳定。金伟栋等[15]在粳稻上也获得了类似结果, 其利用SSR标记证明了太湖流域粳稻地方品种具有丰富的遗传多样性。但是, 国内外关于生物遗传多样性研究要么单一从分子标记入手[3], 要么单独从表观生物学性状进行分析[4, 9, 10]。本试验分别从分子水平和表型性状进行综合研究, 以便获得准确的结果。

本研究选取的31份甜高粱品种, 无论从产量还是品质来看, 都难以满足新时代的甜高粱生产需求, 比如24号品种(贵州甜秆高粱)、28号品种(凤山甜高粱)的鲜质量、粗蛋白和粗脂肪含量较高, 但含糖量却偏低, 因此, 这些品种资源只能作为育种材料利用。相关分析表明, 鲜质量与株高、茎粗、叶片数与粗蛋白含量均呈极显著正相关, 说明青贮型甜高粱育种时可以通过选择植株较高、茎秆粗壮、叶片数多、品质性状优良的材料杂交, 从而选育出产量高、品质好的甜高粱品种; 在选育能源型甜高粱时, 因含糖量性状与鲜质量和茎粗等生物学性状均无显著正相关, 说明难以保证含糖量与产量均处于较高水平, 需要根据具体育种目标区别选育策略。主成分分析表明, 在开展高产优质青贮型甜高粱选育工作时, 应重点考虑主成分1(品质因子)和主成分2(产量因子); 若开展能源型甜高粱育种, 则建议重点考虑主成分3的作用。本研究目的主要在于了解甜高粱材料品种资源的青贮或能源利用价值, 所以未对籽粒产量进行单独收获和比较分析, 若需要比较各品种的籽粒产量, 尚待进一步试验。

致谢:中国农业科学院陆平研究员提供试验材料, 谨致谢忱。

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