用碘酊对患病马匹未破溃的脓包进行消毒, 再用消毒棉签蘸取脓汁保存备用; 20只20 g左右小白鼠由内蒙古民族大学动物实验室提供。酵母浸粉、氯化钠、蛋白胨、琼脂粉、牛肉膏购自青岛海博生物技术有限责任公司; 细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根公司; DL 1 000 DNA Marker、DL 2 000 DNA Marker、PCR Mastermix、6× DNA Loading Buffer购自TaKaRa公司。

将无菌采集的脓汁及死亡马匹的肝脏分别接种于营养琼脂平板和血琼脂平板上, 37 ℃培养24 h后, 挑取血琼脂平板上生长的细菌菌落进行革兰氏染色和显微镜检查; 再挑取细菌菌落接种于普通液体LB培养基中, 150 r· min^-1 37 ℃振荡培养16 h。收集菌体进行后续实验。

将小白鼠分为实验组及对照组, 其中实验组分为3个小组, 每组5只小鼠, 这3个小组的小鼠分别腹腔注射10⁴、10⁶、10⁸ CFU· mL^-1的分离菌, 每只注射0.5 mL; 对照组的5只小鼠分别腹腔注射0.5 mL生理盐水。注射后每3 h观察并记录一次结果, 将死亡小鼠进行剖检, 再次分离致病菌进行鉴定。

使用BD Phoenix^TM100全自动微生物及药敏分析系统对菌株进行生化特性鉴定和药物敏感性测试, 吸取25 μ L 0.6个麦氏单位的菌液加入到AST肉汤, 将肉汤倒入革兰氏阳性鉴定药敏复合检测板, 再将检测板放入仪器中, 反应结束后仪器自动读卡并显示结果。

利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取分离菌的DNA作为模板。PCR扩增引物使用16S rRNA基因扩增通用引物, 由吉林省库美生物有限公司合成, 上游引物27f序列为:5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ , 下游引物1492r序列为:5’ -ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’ 。PCR扩增反应的总体系为25 μ L:PCR Mastermix 11 μ L, ddH₂O 11 μ L, DNA模板 2 μ L, 上下游引物各0.5 μ L。反应条件:94 ℃ 3 min; 95 ℃ 30 s, 58 ℃ 30 s, 72 ℃ 33 s, 35个循环; 72 ℃ 10 min, PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。

16S rRNA PCR产物由北京生工生物工程有限公司测序, 测序结果在GenBank进行BLAST比对。选取同源性相近的几条序列, 用MEGA 5.0软件对选取的序列进行编辑, 并构建系统进化树分析结果。

根据文献^[4], 设计肠毒素FM基因(entFM)、细胞毒素K基因(cytK)、溶血型肠毒素基因(hbl)、非溶血型肠毒素基因(nhe)等8种潜在毒力基因的引物, 引物由吉林省库美生物有限公司合成, 引物信息见表1。PCR反应体系及条件参照1.5节所述, PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 毒力基因PCR扩增引物 Table 1 Virulence gene PCR amplification primers 目的基因 Target gene 引物名称 Primer name 引物序列 Primer sequence(5'-3') 产物长度 PCR product/bp 参考文献 References entFM entFM F GTTCGTTCAGGTGCTGGTAC 486 [5] entFM R AGCTGGGCCTGTACGTACTT cytK cytK F CGACGTCACAAGTTGTAACA 565 [5] cytK R CGTGTGTAAATACCCCAGTT nheA nheA F TACGCTAAGGAGGGGCA 500 [6] nheA R GTTTTTATTGCTTCATCGGCT nheB nheB F CAAGCTCCAGTTCATGCGG 935 [6] nheB R GATCCCATTGTGTACCATTG nheC nheC F ACATCCTTTTGCAGCAGAAC 618 [6] nheC R CCACCAGCAATGACCATATC hblA hblA F GCAAAATCTATGAATGCCTA 884 [6] hblA R GCATCTGTTCGTAATGTTTT hblC hblC F CCTATCAATACTCTCGCAA 695 [6] hblC R TTTCCTTTGTTATACGCTGC hblD hblD F AATCAAGAGCTGTCACGAAT 430 [6] hblD R CACCAATTGACCATGCTAAT

表1 毒力基因PCR扩增引物 Table 1 Virulence gene PCR amplification primers

病原菌在营养琼脂平板上37 ℃培养12 h, 形成较大、灰白色、不透明、圆形、凸起的菌落, 边缘呈毛玻璃状, 迎光呈白蜡状; 在血琼脂平板上37 ℃培养12 h形成浅灰色、似毛玻璃状菌落; 革兰氏染色镜检为阳性大杆菌, 菌体单个或长链状排列, 有椭圆形芽孢, 位于菌体中央或近端(图1)。培养特性初步表明分离菌株为蜡样芽孢杆菌菌群。

图1

Fig.1

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	图1 分离菌株在显微镜下的形态(400× )Fig.1 Morphology of the isolates under the microscope(400× )

对照组的小鼠在实验期内一直未发病; 试验组中, 注射10⁴ CFU· mL^-1菌液的小鼠6 h后接连出现食欲减退、被毛粗乱、精神萎靡、全身颤抖的现象, 注射10⁶ CFU· mL^-1菌液的小鼠12 h后全部死亡, 而注射10⁸ CFU· mL^-1菌液的小鼠6 h内全部死亡。剖杀死亡的小鼠, 从心脏及肝脏中都分离到蜡样芽孢杆菌, 该菌在动物体内呈败血症感染。动物试验结果表明, 本研究中分离到的蜡样芽孢杆菌具有很强的致病性。

利用Phoenix TM 100全自动微生物及药敏分析系统对分离菌株进行检测, 结果显示, 该菌能分解葡萄糖、果糖、海藻糖等, 不分解尿素、塔格糖、七叶酸乙酸等(表2), 表明分离菌符合蜡样芽孢杆菌的生化特性。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 分离菌株生化试验结果 Table 2 Biochemical test results of isolated strains 生化试验Biochemical tests 结果Results 生化试验Biochemical tests 结果Results Β -龙胆二糖 B-gentiobiose - 甲基乙二酸 Methyl oxalic acid + 葡萄糖 Dextrose + 多粘菌素B Polymyxin B - D-果糖 D-fructose + 脱氧核苷 Thymidine + D-葡萄糖酸 D-gluconic acid + 4MU-AD-葡萄糖苷 Glucoside - 蔗糖 Sucrose - 4MU-BD-纤维二糖苷 Fibrous diglycoside + D-甘露醇 D-mannitol + 4MU-AD-半乳糖苷 Galactose glucoside - 多粘菌素E Polymyxin E + 七叶酸乙酸 Heptafolate acetic acid - L-色氨酸-AMC L-tryptophan-AMC - 4MU-磷酸盐 Phosphate + L-焦谷氨酸-AMC L-pyrol-glutamate-AMC - 4MU-磷酸盐(海藻糖) Trehalose + L-脯氨酸-AMC L-proline-AMC - 丙氨酸-PNA Alanine-PNA - L-苯丙氨酸-AMC L-phenylalanine-AMC + L-脯氨酸-PNA L-proline-PNA - 4MU-N-乙酰-BD-氨基葡糖 Glucosamine - 缬氨酸-丙氨酸-PNA Valine-alanine-PNA - ALPHA-酮戊二酸 ALPHA-ketoglutarate + PNP-磷酸盐 PNP-phosphate - L-亮氨酸-AMC L-leucine-AMC + 麦芽三糖 Maltotriose + 尿素 Urea - N-乙酰-氨基葡萄糖 N-acetyl-glucosamine + PNP-BD-葡糖苷 PNP-BD-glucoside - D-塔格糖 D-tagatose - 亚氨基二乙酸 Iminodiacetic acid + D-海藻糖 D-trehalose + 蛋氨酸-AMC Methionine-AMC + 麦芽糖 Maltose + 甲基戊二酸 Methyl glutaric acid + 甲基-α -D-葡萄糖苷 Methyl-α -D-glucoside - +, Positive; -, Negative. +, 阳性; -, 阴性。

表2 分离菌株生化试验结果 Table 2 Biochemical test results of isolated strains

药敏结果显示, 分离菌株对克林霉素、庆大霉素等药物敏感, 对红霉素、米诺环素等药物中度敏感, 对头孢他啶、氨曲南等药物耐药(表3)。药敏试验结果为有针对性地选择药物防治蜡样芽孢杆菌引起的疾病提供了参考。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 分离菌株药物敏感性试验结果 Table 3 Drug susceptibility test of the isolates 抗生素 Antibiotic 结果 Results 抗生素 Antibiotic 结果 Results 克林霉素Clindamycin S 阿米卡星Amikacin S 哌拉西林Piperacillin S 四环素Tetracycline S 氯霉素Chloramphenicol S 庆大霉素Gentamicin S 米诺环素Minocycline I 多粘菌素Polymyxin I 红霉素Erythromycin I 头孢西丁Cefoxitin I 环丙沙星Ciprofloxacin I 万古霉素Vancomycin I 氨苄西林Ampicillin R 青霉素Penicillin R 氨曲南Aztreonam R 阿莫西林Amoxicillin R 新诺明New Nomin R 头孢噻呋Ceftiofur R 头孢唑林Cefazolin R 头孢他啶Ceftazidime R R, Drug resistance; I, Moderate resistance; S, Sensitive. R, 耐药; I, 中度耐药; S, 敏感。

表3 分离菌株药物敏感性试验结果 Table 3 Drug susceptibility test of the isolates

16S rRNA的PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳后, 获得目的基因产物与预期目的基因大小相符, 测序产物大小为1 402 bp, 表明分离菌株为蜡样芽孢杆菌(图2)。8种毒力基因PCR扩增再经琼脂糖凝胶电泳后均获得与预期大小相符的产物, 毒力基因PCR结果表明分离菌株具有该8种毒力基因(图3)。

图2

Fig.2

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	图2 分离菌株16S rRNA PCR扩增结果 1, 16S rRNA PCR扩增产物; M, DNA marker DL 2 000。Fig.2 16S rRNA PCR amplification results of isolates 1, Product of 16S rRNA by PCR; M, DNA marker DL 2 000.

图3

Fig.3

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	图3 毒力基因PCR扩增结果 M, DL 1 000 DNA marker; 1— 8, 毒力基因entFM, cytK, nheA, nheB, nheC, hblA, hblC, hblD的扩增结果。Fig.3 PCR amplification of virulence genes M, DL 1 000 DNA marker; 1-8, Virulence gene of entFM, cytK, nheA, nheB, nheC, hblA, hblC, hblD.

将分离菌株的测序序列命名为“ X” , 测序结果在NCBI的GenBank中进行BLAST比较分析, 结果与序列号为KR999918.1(中国新疆株)的蜡样芽孢杆菌同源性达到100%。选取比对结果中同源性相近的序列做系统进化树分析, 结果显示, 测序序列“ X” 与序列号为KR999918.1(中国新疆株)的蜡样芽孢杆菌遗传距离最近(图4), 表明该分离菌株为蜡样芽孢杆菌。

图4

Fig.4

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	图4 分离菌株16S rRNA基因系统进化树Fig.4 Phylogenetic tree of the isolate 16S rRNA gene