玉米 ZmGS5基因的克隆及其对转基因拟南芥种子发育的影响
何春梅, 王娟, 董瑞, 刘春晓, 刘强, 关海英, 汪黎明, 徐相波*, 刘铁山
山东省农业科学院 玉米研究所,小麦玉米国家工程实验室,农业农村部黄淮海北部玉米生物学与遗传育种重点实验室,山东 济南 250100
*通信作者,徐相波,E-mail: xuxbo2008@126.com

作者简介:何春梅(1978—),女,山东莱芜人,博士,副研究员,主要从事玉米遗传育种研究。E-mail: chunmeihe11@163.com

摘要

植物种子发育与产量密切相关,研究发现玉米 ZmGS5基因与其籽粒发育呈显著性正相关。本研究利用同源克隆技术克隆玉米 ZmGS5基因,该基因编码区全长1 491 bp,编码含496个氨基酸的丝氨酸羧肽酶。通过构建 ZmGS5过表达载体,采用花序浸染法遗传转化拟南芥,观察转基因拟南芥植株表型及种子变化,初步解析 ZmGS5在调控种子发育过程中的功能。结果表明,转基因拟南芥植株莲座叶直径增加,叶片增大,生物量、每株角果数和种子千粒重及种子大小均显著增加。该研究结果初步揭示了玉米 ZmGS5基因在调控作物生长发育和产量中发挥重要作用。

关键词: 玉米; ZmGS5; 遗传转化; 拟南芥; 种子大小
中图分类号:S513 文献标志码:A 文章编号:1004-1524(2019)04-0513-06
Cloning and characterization of maize ZmGS5 in regulating seed development of Arabidopsis thaliana
HE Chunmei, WANG Juan, DONG Rui, LIU Chunxiao, LIU Qiang, GUAN Haiying, WANG Liming, XU Xiangbo*, LIU Tieshan
Maize Research Institute, Shandong Academy of Agricultural Sciences, National Engineering Laboratory of Wheat and Maize, Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Maize in Northern Yellow-Huai River Plain, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Jinan 250100, China
Abstract

Seed development is closely related with yield. Genome comparative analysis had revealed that maize ZmGS5 was significantly related with kernel development. In this study, the maize ZmGS5 was cloned, the open reading frame of ZmGS5 was 1 491 bp in length and encoded a 496 aa serine carboxypeptidase. The over-expression construct of ZmGS5 was then transformed into Arabidopsis by floral-dipping method. Through observation of the phenotypic alterations of the transgenic lines, functions of ZmGS5 in regulating growth and seed development was preliminarily revealed. These results showed that the transgenic lines over-expressing ZmGS5 could increase rosette diameter, enlarged leaf size and improved biomass, number of siliques per plant, one-thousand-seed weight and seed size. These results demonstrated that ZmGS5 played important roles in regulating plant growth especially in the seed size.

Keyword: maize; ZmGS5; genetic transformation; Arabidopsis; seed size

玉米是重要的粮食作物和饲料作物, 也是世界上总产量最高的农作物。籽粒大小是产量构成的主要因素之一, 对调控种子大小的基因及其作用机理进行研究, 不仅具有重要的理论价值, 还可指导生产实践。粒型和粒质量是决定籽粒产量的两个重要因素, 目前关于玉米中这两个因素的遗传基础还有待进一步解析。

近年来, 通过基因组比较分析或关联分析的方法, 水稻中一批参与调控粒型与产量性状的基因陆续被克隆, 其分子机制也相继被解析[1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10], 而玉米中相关基因的研究较少。目前, 通过同源克隆的方式, 玉米中一些与水稻产量基因同源的基因已经被克隆和报道, 并表现出水稻中基因保守的功能[11, 12, 13, 14, 15]。控制水稻粒型的GS3和GW2基因在玉米中的同源基因已经被克隆, 且两个基因与玉米籽粒粒型发育和粒质量显著正相关[11, 12]。玉米Mn1和ZmINCW1为水稻灌浆基因OsGIF1的两个同源基因, Mn1基因的过表达增加了玉米籽粒产量[13], 而将玉米ZmINCW1基因转化拟南芥AtcwINV2突变体, 可以互补其千粒重降低的表型, 使种子产量增加[15]

水稻GS5基因是粒型与产量的正向调节因子, 其在启动子区的自然变异使其表达水平提高, 从而提高了水稻粒宽与粒质量[5]。Liu等[14]从玉米中克隆了水稻GS5同源基因, 并将其命名为ZmGS5。比较基因组分析结果表明, 该基因与玉米籽粒发育性状显著正相关。该基因在拟南芥中过表达的研究结果表明, ZmGS5影响拟南芥种子质量和子叶大小的发育。本研究中, 我们将进一步解析过表达ZmGS5对拟南芥营养生长期及成熟期植株整体表型和种子发育的影响, 包括对拟南芥莲座叶大小、株高、一级分枝数、每株角果数和种子大小及千粒重等的影响, 为深入了解玉米ZmGS5的功能提供理论基础, 并为育种实践提供一定的参考依据。

1 材料与方法
1.1 植物材料

实验所用拟南芥为哥伦比亚生态型(Arabidopsis thaliana L. Heynh., Col-0)。转基因拟南芥T1代种子经次氯酸钠消毒后, 播种于含10 mg· L-1草铵膦的1/2 MS培养基(pH 5.8)上进行筛选, 抗性植株进一步移栽至营养土中进行培养, 培养室温度为22 ℃, 光周期为16 h光照/8 h黑暗。

1.2 载体构建

实验所用植物转化双元载体为改进的pCAMBIA3301, 该质粒携带草铵膦抗性基因Bar。以玉米B73 cDNA为模板, 以GS-F: 5'-GAAGATCTGCCTTCTCCTCTTCTTCGCCTTGTAC-3'(下划线为BglⅡ 酶切位点)和GS-R: 5'-CGGGTGACCCAATAACCCTCATCACAATCA-3'(下划线为BstEⅡ 酶切位点)为引物, 利用高保真酶扩增ZmGS5全长编码区。PCR反应体系为25 μ L, 包括如下组分:2× High-fidelity Master Mix 12.5 μ L, 上下游引物(浓度10 μ mol· L-1)各1 μ L, cDNA 2 μ L, 加灭菌水8.5 μ L。PCR程序为:98 ℃预变性1 min; 98 ℃变性10 s, 68 ℃退火15 s, 72 ℃延伸45 s, 循环35次; 72 ℃过度延伸5 min。扩增片段测序正确后, 通过BglⅡ 和BstEⅡ 酶切位点连接到载体pCAMBIA3301中, 得到CaMV35S启动子驱动基因表达的重组质粒35S∶ ∶ ZmGS5。

1.3 农杆菌转化

将以上重组质粒转化AGL1农杆菌感受态细胞, 方法参考感受态说明书。取-70 ℃保存的农杆菌感受态细胞于冰浴中融化, 向100 μ L感受态细胞中加入1 μ g重组质粒, 轻轻混匀, 冰浴30 min后, 液氮速冻5 min; 然后置于37 ℃水浴中孵育5 min, 冰浴2 min; 加入800 μ L YEP(10 g· L-1酵母膏; 10 g· L-1胰蛋白胨; 5 g· L-1氯化钠; pH 7.0)液体培养基, 并于28 ℃摇床上振荡培养2~3 h。收集菌体后, 涂布于含有卡那霉素和利福平的YEP平板上, 于28 ℃培养箱中倒置培养48~72 h。

1.4 浸花法转化拟南芥

将含有重组质粒的农杆菌转接到200 mL YEP液体培养基中, 待D600=0.8~1.2时, 5 000 r· min-1, 离心10 min收集菌体。菌体用200 mL 5%蔗糖溶液(含0.02% Silwet L-77)重悬, 混匀。将花枝浸入菌液中30 s, 轻轻上下摇动。将侵染后的拟南芥置于黑暗中培养24 h, 然后置于光下正常培养3~5 d, 进行第二次转化。成熟期收获种子, 即得到转基因T1代种子。

1.5 转基因拟南芥植株的分子鉴定

采用CTAB法微量提取拟南芥基因组DNA。取50~100 mg新鲜叶片, 液氮研磨成粉末, 加入1× CTAB溶液, 含25 mmol· L-1 Tris-Cl(pH 8.0)、0.35 mol· L-1 NaCl、5 mmol· L-1 EDTA(pH 8.0)、1% CTAB(m/V), 使用前加1%β -巯基乙醇(V/V), 混匀, 65 ℃温育30 min。加入等体积氯仿异戊醇混合液(体积比24∶ 1)抽提10 min, 12 000 r· min-1离心10 min。取上清液, 加入2/3倍体积的异丙醇, 充分混匀, -20 ℃放置20 min。12 000 r· min-1离心10 min, 弃上清液, 用70%乙醇洗涤沉淀2次。待乙醇挥发干净后, 溶解于灭菌双蒸水, 用作PCR模板。

检测转基因植株ZmGS5基因引物为35S-F: 5'-GCTCCTACAAATGCCATCATTGC-3'与GS-MR: 5'-CCTCGTGCTCGTTGTTGTAACCG-3'(扩增产物大小为611 bp)。PCR反应体系为10 μ L, 包括如下组分:2× Taq Plus Master Mix 10 μ L, 上下游引物(浓度10 μ mol· L-1)各0.8 μ L, 基因组DNA(50 ng· μ L-1)2 μ L, 灭菌水6.4 μ L。PCR反应程序为:94 ℃预变性5 min; 94 ℃变性30 s, 56 ℃退火30 s, 72 ℃延伸45 s, 循环35次; 72 ℃过度延伸5 min。

1.6 RNA提取及半定量RT-PCR

按照RNAiso Plus(大连宝生物工程公司)试剂盒说明书提取野生型及转ZmGS5基因拟南芥植株莲座叶总RNA, 参照PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(大连宝生物工程公司)试剂盒说明书进行反转录合成cDNA。用于半定量RT-PCR的ZmGS5引物为GS-QF: 5'-GAGTGTGGCTCTACAGTGGGGA-3'和GS-QR: 5'-ACCAAATGCCCTGCTCC TCT-3'; 内参AtUBQ10引物为UBQ-QF: 5'-CCTTGTATAATCCCTGATGA-3'和UBQ-QR: 5'-AACAGGAACGGAAACATAGT-3'。半定量PCR反应程序为:94 ℃预变性5 min; 94 ℃变性30 s, 56 ℃退火30 s, 72 ℃延伸15 s, 循环28次; 72 ℃过度延伸5 min。

1.7 农艺性状分析

营养生长期测量野生型和转基因植株莲座叶直径大小, 并于成熟期测量株高、生物量、一级分枝数、每株角果数和种子千粒重指标。利用Olympus SZX16体视镜观察成熟期种子大小差异, 观察结果用Olympus DP73系统照相。

1.8 数据处理与统计分析

利用软件Excel和Sigmaplot 12.5进行数据的统计分析, 利用软件ImageJ对拟南芥种子图片进行种子长度测量。实验数据为3次重复的平均值± 标准差, 采用单因素方差分析法分析不同数据组之间的差异显著性。

2 结果与分析
2.1 转基因拟南芥植株的分子鉴定

提取抗除草剂的转基因T1代拟南芥植株的基因组DNA, 根据载体T-DNA区结构图(图1-A), 设计载体CaMV35S启动子上的正向引物和ZmGS5特异反向引物进行PCR鉴定。经过检测, 随机选取的10株抗性植株均扩增出与阳性质粒同等大小的基因片段, 而非转基因野生型对照则未扩增出目的基因片段(图1-B), 说明ZmGS5基因已成功整合到拟南芥基因组中。

图1 重组质粒示意图及转基因拟南芥植株分子鉴定
A, 重组质粒35S: ZmGS5的T-DNA区示意图; B, 转基因拟南芥植株ZmGS5基因检测; M, DNA ladder DL2000; 1, 阳性质粒对照; 2, 非转基因野生型对照; 3~12, 转基因拟南芥植株。
Fig.1 Diagram of the recombinant plasmid and PCR verification of the transgenic lines
A, T-DNA region of the recombinant plasmid 35S: ZmGS5; B, Verification of ZmGS5 in the transgenic lines. M, DNA ladder DL2000; 1, Positive control; 2, Wild type; 3-12, Transgenic lines.

2.2 转基因拟南芥植株中ZmGS5表达丰度鉴定

收集T2代转ZmGS5基因拟南芥种子, 种植后随机选取6个转基因阳性株系(株系2、3、4、8、9和10), 提取营养生长期叶片总RNA并反转录为cDNA, 利用ZmGS5特异引物检测目的基因表达量, 其中AtUBQ10为内参对照(图2)。结果表明, 非转基因野生型对照中无目的基因表达, 而各转基因株系中ZmGS5均有较高表达; 内参基因AtUBQ10在野生型及各株系中表达稳定, 无差异, 说明ZmGS5基因在各个转基因株系中均成功表达。

图2 不同转基因株系中的ZmGS5表达丰度
图中扩增循环数为28个。
Fig.2 Expression levels of ZmGS5 in the transgenic lines
The number of the amplification cycle was 28.

2.3 过表达ZmGS5增加莲座叶直径及叶片大小

对以上6个T2代转基因阳性株系及野生型的表型进行观察发现, 在相同的生长条件下, 过表达ZmGS5基因拟南芥植株的莲座叶增大, 生物量增加, 叶片长度和宽度均增加, 图3所示为转基因株系2和3与野生型的表型对比结果(图3-A、B)。对野生型及转基因株系莲座叶直径大小的统计结果表明, 与非转基因野生型对照相比, 转基因株系2和3的莲座叶直径均增加, 并达到显著差异水平(图3-C)。

图3 野生型及转基因株系营养生长期表型分析
A, 野生型及转基因株系2和3的营养生长期表型, 标尺为5 cm; B, 叶片表型, 标尺为2 cm; C, 莲座叶直径统计。* 代表数值在转基因株系与野生型对照之间达到显著差异水平(P< 0.05)。
Fig.3 Phenotypic analysis of wild type and the transgenic line 2 and 3 at vegetative stage
A, Phenotype of wild type and the transgenic line 2 and 3 at vegetative stage. Bar=5 cm; B, Leaf phenotype. Bar=2 cm; C, Statistic analysis of the rosette diameter. * represented that the values between wild type and the transgenic lines were significantly different (P< 0.05).

2.4 过表达ZmGS5增加生物量及种子大小

待植株生长至成熟期(图4-A), 拟南芥抽薹开花后, 与非转基因野生型对照相比, 转ZmGS5基因拟南芥株系2和3的株高显著增加, 茎秆更加粗壮; 一级分枝数增加, 从而使每株角果数极显著增加, 株系2和3分别比野生型增加了230%和212%(表1); 成熟期收获转基因T3代种子, 经测量, 株系2和3的种子长度均显著增加(图4-B、C), 千粒重也显著增加, 分别比野生型增加了20%和10%; 相比野生型, 转基因植株整体生物量显著增加(表1)。以上结果表明, 过表达ZmGS5基因影响拟南芥植株叶片发育、株高、每株角果数、种子大小及质量。

图4 野生型及转基因株系2和3成熟期表型
A, 野生型及转基因株系2和3成熟期整体表型, 标尺为10 cm; B, 种子表型, 标尺为200 μ m; C, 种子长度统计。* 和* * 分别代表数值在转基因株系与野生型对照之间达到显著差异水平(P< 0.05)和极显著差异水平(P< 0.01)。
Fig.4 Phenotype of wild type and the transgenic line 2 and 3 at mature stage
A, Phenotype of wild type and the transgenic line 2 and 3 at mature stage. Bar=10 cm; B, Seed phenotype. Bar=200 μ m; C, Statistic analysis of the seed length. * and * * represented that the values between wild type and the transgenic lines were significant different (P< 0.05) or extremely significant different (P < 0.01), respectively.

表1ZmGS5基因拟南芥株系2和3与野生型株系生长发育性状比较 Table 1 Comparison of developmental traits between wild type and transgenic line 2 and 3
3 讨论

随着越来越详细的玉米基因组数据库的释放[16], 利用同源克隆的方法来研究玉米基因功能已成为一种快速有效的方法[17]。水稻GS5是籽粒发育和产量的正调控因子, 克隆和研究其在玉米中的同源基因对指导玉米高产育种具有实际意义。本研究利用同源克隆的方法获得玉米ZmGS5, 该基因与水稻GS5同源度最高, 为74%[14]

本研究利用浸花法将ZmGS5过表达载体转化拟南芥并获得转基因阳性植株。对获得的除草剂抗性植株进行PCR鉴定的结果表明, ZmGS5基因成功整合到拟南芥基因组中。半定量RT-PCR的结果进一步表明ZmGS5基因在转基因拟南芥植株中具有高表达。

通过对转ZmGS5基因拟南芥表型进行观测发现, 在营养生长时期, ZmGS5过表达使得转基因拟南芥莲座叶增大, 且成熟期株高、生物量、每株角果数和种子大小及千粒重均显著增加。本研究一方面为玉米ZmGS5在调控植株发育与种子质量中的作用提供了理论基础, 另一方面, 为获得高产转基因玉米新材料提供了潜在的基因资源。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] SONG X J, HUANG W, SHI M, et al. A QTL for rice grain width and weight encodes a previously unknown RING-type E3 ubiquitin ligase[J]. Nature Genetics, 2007, 39(5): 623-630. [本文引用:1]
[2] WANG E T, WANG J J, ZHU X D, et al. Control of rice grain-filling and yield by a gene with a potential signature of domestication[J]. Nature Genetics, 2008, 40(11): 1370-1374. [本文引用:1]
[3] XUE W Y, XING Y Z, WENG X Y, et al. Natural variation in Ghd7 is an important regulator of heading date and yield potential in rice[J]. Nature Genetics, 2008, 40(6): 761-767. [本文引用:1]
[4] HUANG X Z, QIAN Q, LIU Z B, et al. Natural variation at the DEP1 locus enhances grain yield in rice[J]. Nature Genetics, 2009, 41(4): 494-497. [本文引用:1]
[5] LI Y B, FAN C C, XING Y Z, et al. Natural variation in GS5 plays an important role in regulating grain size and yield in rice[J]. Nature Genetics, 2011, 43(12): 1266-1269. [本文引用:2]
[6] WANG S K, WU K, YUAN Q B, et al. Control of grain size, shape and quality by OsSPL16 in rice[J]. Nature Genetics, 2012, 44(8): 950-954. [本文引用:1]
[7] ZUO J R, LI J Y. Molecular genetic dissection of quantitative trait loci regulating rice grain size[J]. Annual Review of Genetics, 2014, 48: 99-118. [本文引用:1]
[8] WANG Y X, XIONG G S, HU J, et al. Copy number variation at the GL7 locus contributes to grain size diversity in rice[J]. Nature Genetics, 2015, 47(8): 944-948. [本文引用:1]
[9] SI L Z, CHEN J Y, HUANG X H, et al. OsSPL13 controls grain size in cultivated rice[J]. Nature Genetics, 2016, 48(4): 447-456. [本文引用:1]
[10] HUANG K, WANG D K, DUAN P G, et al. WIDE AND THICK GRAIN 1, which encodes an otubain-like protease with deubiquitination activity, influences grain size and shape in rice[J]. The Plant Journal, 2017, 91(5): 849-860. [本文引用:1]
[11] LI Q, YANG X H, BAI G H, et al. Cloning and characterization of a putative GS3 ortholog involved in maize kernel development[J]. Theoretical and Applied Genetics, 2010, 120(4): 753-763. [本文引用:2]
[12] LI Q, LI L, YANG X H, et al. Relationship, evolutionary fate and function of two maize co-orthologs of rice GW2 associated with kernel size and weight[J]. BMC Plant Biology, 2010, 10(1): 143. [本文引用:2]
[13] LI B, LIU H, ZHANG Y, et al. Constitutive expression of cell wall invertase genes increases grain yield and starch content in maize[J]. Plant Biotechnology Journal, 2013, 11(9): 1080-1091. [本文引用:2]
[14] LIU J, DENG M, GUO H, et al. Maize orthologs of rice GS5 and their trans-regulator are associated with kernel development[J]. Journal of Integrative Plant Biology, 2015, 57(11): 943-953. [本文引用:3]
[15] LIU J, HUANG J, GUO H, et al. The conserved and unique genetic architecture of kernel size and weight in maize and rice[J]. Plant Physiology, 2017, 175(2): 774-785. [本文引用:2]
[16] JIAO Y P, PELUSO P, SHI J H, et al. Improved maize reference genome with single-molecule technologies[J]. Nature, 2017, 546: 524-527. [本文引用:1]
[17] 瓮巧云, 赵彦敏, 张贺, . 玉米 ZmREM基因的克隆与逆境胁迫后表达分析[J]. 浙江农业学报, 2016, 28(11): 1822-1827.
WENG Q Y, ZHAO Y M, ZHANG H, et al. Cloning of ZmREM and its expression analysis in maize under stress[J]. Acta Agriculturae Zhejiangensis, 2016, 28(11): 1822-1827. (in Chinese with English abstract) [本文引用:1]