利用⁶⁰Co-γ 射线(剂量1 200 Rad, 剂量率100 Rad· min^-1)照射普通小麦-大赖草二体异附加系DA7Lr开花期麦穗, 取其辐射花粉与普通小麦中国春杂交, 让其后代种子自交, 鉴定出纯合易位系。抗赤霉病对照品种苏麦3号和感赤霉病品种中国春由河南科技大学农学院小麦遗传育种研究室引进保存。

1.2.1 根尖细胞有丝分裂中期

将小麦种子放入垫有湿滤纸的培养皿内发芽(23 ℃), 待根长至1.0~2.0 cm时, 剪取1~2条种子根在冰水中处理20~24 h。用无水乙醇冰醋酸混合液(体积比3∶ 1)固定, 4 ℃冰箱中保存3 d后于45%醋酸中进行根尖压片, 相差显微镜下染色体观察, 放入-70 ℃冰箱或液氮中冷冻揭去盖玻片, 脱水备用。

1.2.2 花粉母细胞减数分裂中期Ⅰ

挑取处于减数分裂中期Ⅰ 的花药, 用上述固定液固定, 按根尖细胞有丝分裂中期制片方法压片。

参照Gill等^[14]的方法进行染色体C-分带。荧光原位杂交参照Mukai等^[15]的方法稍加修改进行。参照Zhang等^[16]的方法顺次原位杂交, 首先以荧光素Fluorescein-l2-dUTP标记的大赖草基因组DNA为探针进行基因组原位杂交, 通过SPOT CCD(charge coupled device)获取FISH图像, 然后将信号洗脱, 再以红色荧光标记的B组专化探针Oligo-pSc119.2-2(其寡核苷酸重复序列为6-FAM-5'-TTCCA CGATT GACGATTCCG GGGGT GCGTTTACGT GTCCG TCGTC-3')和绿色荧光标记的D组专化探针Oligo-pAs1-2(其寡核苷酸重复序列为Tamra-5'-CATTT CATCC ACATAGCATG TGCAA GAAAT TTGAGAGGGT TACGG CAAAA ACTGGAT-3')进行双色荧光原位杂交, 用DAPI(4’ , 6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)染色。SPOT CCD(charge coupled device)获取图像。图像结果参照Tang等^[17]的标准FISH图谱进行分析。实验过程中采用的绿色荧光素和两种专化探针分别由上海英俊生物科技有限公司提供和合成。

植物DNA提取参照Sharp等^[18]的SDS法。采用10 μ L PCR反应体系, 模板DNA 20 ng、1.5 mmol L^-1 MgCl₂、1× buffer、200 mmol L^-1 dNTP、终浓度各为0.2 μ mol L^-1的左右引物、0.5 U Taq DNA聚合酶。PCR反应程序为94 ℃预变性3 min; 94 ℃变性30 s, 50~60 ℃退火40 s, 72 ℃延伸50 s, 34个循环; 72 ℃延伸10 min, 4 ℃保存。扩增产物经8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳, 硝酸银染色后照相分析。

抗性鉴定在河南科技大学开元校区农场进行, 试验按照随机区组设计。采用王裕中等^[19]的单花滴注法接种禾谷镰刀菌(菌种由河南科技大学林学院植物病理系徐建强博士提供), 接种后早晚2次喷雾, 保证禾谷镰刀菌的发病湿度。2015— 2017年连续3年均使用编号为LHLY-2高强毒菌株分生孢子悬浮液。每小区接种10穗, 接种21 d后, 调查接种穗的发病小穗数和总小穗数, 计算病小穗率。调查结果采用SPSS软件进行统计分析。

利用电离辐射处理普通小麦大赖草异附加系DA7Lr开花期的穗子, 取其辐射花粉授予已去雄的普通小麦中国春, 对其辐射后代种子, 进行根尖细胞染色体荧光原位杂交(FISH)分析, 结果发现一株编号为NGH-03单株具有1条普通小麦-大赖草易位染色体, 从自交后代种子中得到了1株含有2条易位染色体的单株, 根尖细胞有丝分裂中期染色体制片, 相差显微镜下观察。

以绿色荧光标记大赖草基因组DNA和以红色荧光标记的小麦B组专化探针Oligo-pSc119.2-2作为探针, 对分裂相较好的NGH-03纯合种子根尖染色体制片进行双色荧光原位杂交(GISH-FISH)。结果显示:在荧光显微镜下, 可以观察到易位染色体的大赖草片段端部处有很强的绿色荧光杂交信号, 易位染色体的小麦片段未出现红色Oligo-pSc119.2-2杂交信号(图1-a)。该易位染色体为大赖草7Lr短臂端部片段与小麦某染色体的部分片段发生的顶端易位。

图1

Fig.1

Figure Option ViewDownloadNew Window

图1 易位系T3AS· 3AL-7Lr#1S荧光原位杂交 a图中绿色信号为Fluorescein-12-dUTP标记的大赖草基因组DNA; b图中的红色信号为Tamra标记的Oligo-pSc119.2-2, 绿色信号为6-FAM标记的Oligo-pAs1-2; 箭头指示易位染色体。Fig.1 Fluorescence in situ hybridization (FISH) of translocation line T3AS· 3AL-7Lr#1S In panel a, L. racemosus genomic DNA was labeled with fluorescein-12-dUTP and visualized with green signals. In panel b, Oligo-pSc119.2-2 was labeled with Tamra and visualized with red signals, and Oligo-pAs1-2 was labeled with 6-FAM and visualized with green signals. The arrows showed translocation chromosomes.

为了进一步确定易位染色体中小麦染色体片段的身份, 将双色杂交信号洗脱, 再以绿色荧光标记的小麦D组专化探针Oligo-pAs1-2进行原位杂交。结果显示:在易位小麦染色体近着丝粒处有两个明显的绿色Oligo-pAs1-2杂交位点(图1-b)。参照Tang等^[17]的原位杂交图谱, 发现D组的7对染色体, 在其长臂和短臂的端部和近端部均有较强的杂交信号, 因此可排除D组染色体。B组染色体只有3B染色体的长臂、6B染色体的短臂以及7B染色体的两臂端部和近端部有杂交信号, 这3对染色体也可排除。A组染色体中, 1A和2A短臂的端部, 4A染色体长臂的端部有明显的杂交信号, 7A染色体两臂端部有弱的杂交信号; 1A和5A染色体长臂的近中部有明显杂交信号, 只有3A染色体短臂在近着丝粒处有明显的杂交信号。C-分带结果发现易位的小麦染色体臂上近着丝粒处有2个较清晰的点状带纹, 着丝粒处C带不强, 也符合3A染色体的C带特点(图2), 因此可推测易位涉及的小麦染色体为3A。

对其花粉母细胞减数分裂中期Ⅰ 染色体制片进行DAPI染色, 荧光显微镜下镜检分析其染色体构型, 发现其易位染色体正常配对, 形成了稳定的环状二价体(图3), 该易位系命名为T3AS· 3AL-7Lr#1S。

图2

Fig.2

Figure Option ViewDownloadNew Window

图2 易位染色体T3AS· 3AL-7Lr#1S的C分带及荧光原位杂交 从左至右依次为:C分带的3A, C分带的T3AS· 3AL-7Lr#1S, 荧光原位杂交的T3AS· 3AL-7Lr#1S, Oligo-pAs1-2(绿色)杂交的T3AS· 3AL-7Lr#1S, Oligo-pAs1-2(红色)杂交的3A, 荧光原位杂交的7Lr, C分带的7Lr。Fig.2 C-banding and FISH of the translocation chromosomeT3AS· 3AL-7Lr#1S The pictures from left to right showed C-banded 3A, C-banded T3AS· 3AL-7Lr#1S, FISH T3AS· 3AL-7Lr#1S, T3AS· 3AL-7Lr#1S with Oligo-pAs1-2(green), 3A with Oligo-pAs1-2 (red), FISH 7Lr and C-banded 7Lr, respectively.

图3

Fig.3

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图3 易位系T3AS · 3AL-7Lr#1S的花粉母细胞减数分裂中期Ⅰ 染色体的荧光原位杂交 图中红色信号为荧光素CY3-dUTP 标记的大赖草基因组DNA, 箭头指示配对的二价体易位染色体T3AS· 3AL-7Lr#1S。Fig.3 Chromosome FISH at MⅠ of PMC of translocation line T3AS· 3AL-7Lr#1S L. racemosus genomic DNA was labeled with CY3-dUTP and visualized with red signals. The arrow showed the ring bivalent formed by a pair of translocation T3AS· 3AL-7Lr#1S.

根据小麦第7部分同源群不同区段的EST序列合成了81对EST-STS引物。其中有3对引物发现在大赖草、DA7Lr和易位系T3AS· 3AL-7Lr#1S上有特异扩增, 它们是BE591127、BQ168298和BE591737, 均定位在第7同源群的7DS、7AS和7BS上, 扩增出的3条特异条带, 大小分别约1 000、1 733和398 bp(图4)。因此, 可以利用这3对特异引物追踪大赖草染色体片段, 鉴定含有该大赖草染色体片段的易位染色体。

图4

Fig.4

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图4 三对引物的PCR扩增结果 M, Marker; 1, 中国春; 2, 大赖草; 3, DA7Lr; 4, T3AS· 3AL-7Lr#1S。Fig.4 Amplification results of three pairs of primers M, Marker; 1, Chinese Spring; 2, L. racemosus; 3, DA7Lr; 4, T3AS · 3AL-7Lr#1S.

经过连续3年的赤霉病接种鉴定, 结果表明, 易位系T3AS· 3AL-7Lr#1S的病小穗率显著低于感病亲本中国春和感病对照绵阳85-45, 但稍高于抗病对照苏麦3号(表1、图5), 表现出了较好的赤霉病抗性。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 T3AS· 3AL-7Lr#1S的赤霉病病小穗率 Table 1 Evaluation of scab resistance of T3AS· 3AL-7Lr#1S 材料 Material 大田鉴定病小穗率 Scab resistance identified in field/% 2015年 2016年 2017年 T3AS· 3AL-7Lr#1S 9.13 13.16± 6.52* * 10.36± 9.28* * 苏麦3号Sumai 3 3.90 6.35± 3.12* * 5.69± 2.14* * 中国春 35.27 39.58± 7.96 30.90± 8.92 Chinese Spring 绵阳85-45 49.23 56.32± 11.26* * 47.83± 13.25* * Mianyang 85-45 * * 表示试验材料与中国春在0.01概率水平上有显著差异。 * * indicated the significant difference at P< 0.01 between the material and Chinese Spring.

表1 T3AS· 3AL-7Lr#1S的赤霉病病小穗率 Table 1 Evaluation of scab resistance of T3AS· 3AL-7Lr#1S

图5

Fig.5

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图5 易位系T3AS· 3AL-7Lr#1S的赤霉病抗性鉴定 从左到右依次为:T5AS-7LrL· 7LrS、中国春、绵阳85-45、苏麦3号。Fig.5 Evaluation of scab resistance of translocation line T3AS· 3AL-7Lr#1S The pictures from left to right showed T3AS· 3AL-7Lr#1S, Chinese Spring, Mianyang 85-45 and Sumai 3, respectively.