病鱼采自四川省某锦鲤养殖场, 濒临死亡锦鲤4条, 死亡不久的锦鲤2条, 编号为1~6。

大肠埃希菌DH5α 由四川农业大学动物医学院鱼病研究中心实验室保存提供。克隆载体PMD19-T购自美国Invitrogen公司; 病毒DNA提取试剂盒、小剂量质粒抽提试剂盒、pMD19-T质粒连接试剂盒、组织DNA提取试剂盒、胶回收试剂盒和2× PCR Master Mix购自美国TaKaRa公司。

观察鱼池内患病锦鲤的行为特征, 对病鱼样品的鳃、体表、眼、鳍条、肛门等部位进行表观症状观察。解剖病鱼, 观察内脏器官的变化, 采集鳃和肾脏样品, -20 ℃保存备用。

采集病鱼的鳃、肝脏、脑、脾脏、肾脏等组织样本, 10%中性福尔马林固定, 常规石蜡切片, 苏木精-伊红(HE)染色, 中性树胶封片后置于光学显微镜下观察。

无菌条件下, 从病鱼肝脏、脾脏和肾脏取样于BHIA平板上划线接种, 28 ℃恒温培养24~48 h, 观察细菌生长状况。采集病鱼的鳃丝、血液和体表黏液分别进行鳃丝压片、血液和体表黏液涂片观察, 在光学显微镜低倍镜下进行寄生虫检测。

采集病鱼的鳃和肾脏, 按照组织DNA提取试剂盒操作说明提取基因组DNA。提取的DNA分别用于检测锦鲤疱疹病毒(koi herpes virus, KHV)、鲤浮肿病毒(carp edema virus, CEV)、鲤春病毒血症病毒(spring viremia of carp virus, SVCV)。根据世界动物卫生组织(OIE)推荐检测KHV的Sph基因进行PCR扩增; 参考文献[14]进行CEV引物设计及巢氏PCR反应; 参考文献[15]进行SVCV检测, 使用引物SVCV_F1和SVCV_R2扩增SVCV糖蛋白基因714 bp的DNA片段后, 再用引物SVCV_F1和SVCV_R4经半嵌套式PCR扩增出606 bp的DNA片段。

取病鱼肾脏于2.5%戊二醛磷酸盐缓冲液保存, 用磷酸缓冲液漂洗4 h以上, 再用1%锇酸溶液固定, 梯度乙醇脱水后, 采用环氧树脂包埋剂进行浸透, 并于65 ℃中聚合24~58 h。将聚合好的样本超薄切片, 在透射电镜下观察^[16]。

PCR产物按照DNA纯化试剂盒操作说明书纯化后, 连接到pMD19-T载体上, 转化大肠埃希菌DH5α 感受态细胞中。培养24 h后, 挑取单个菌落进行PCR筛选阳性菌株, 提取质粒送上海生物工程有限公司进行序列测定。根据GenBank收录的CEV英国株和波兰株的P4a基因序列, 使用DNAstar生物学软件Megalign方法进行序列同源性分析, 并通过MEGA6邻接法构建系统进化树进行遗传进化分析。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 PCR扩增引物 Table 1 Primers for PCR amplification 引物名称 Primer name 序列 Sequence(5'-3') 长度 Length/bp KHV_F1 GACACCACATCTGCAAGGAG 292 KHV_R1 GACACATGTTACAATGGTCGC CEV_F1 ATGGAGTATCCAAAGTACTTAG 528 CEV_R1 CTCTTCACTATTGTGACTTTG CEV_F2 GTTATCAATGAAATTTGTGTATTG 478 CEV_R2 TAGCAAAGTACTACCTCATCC SVCV_F1 TCTTGGAGCCAAATAGCTCARRTC 714 SVCV_R1 AGATGGTATGGACCCCAATACATHCANCAY SVCV_F1 TCTTGGAGCCAAATAGCTCARRTC 606 SVCV_R4 CTGGGGTTTCCNCCTCAAAGYTGY

表1 PCR扩增引物 Table 1 Primers for PCR amplification

发病锦鲤主要的临床症状为食欲减退, 嗜睡或在池塘边的水面上缓慢、漫无目的游动, 遇到惊吓后迅速苏醒, 游一段距离后很快陷入沉睡, 鱼体出现身体肿胀, 体表出现溃烂, 眼球、腹部充血, 单侧或双侧眼球浑浊, 鳃丝肿胀、出血甚至坏死, 肝脾肾等器官无明显异常(图1)。

图1

Fig.1

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图1 患病锦鲤临床病变 A, 患病锦鲤出现KSD典型症状, 如嗜睡, 侧身躺着不动; B、C, 患病锦鲤身体肿胀(白色箭头为正常锦鲤, 黑色箭头所指为患病锦鲤); D, 体表出现溃疡; E, 眼睛充血, 眼球浑浊; F, 鳃丝肿胀。Fig.1 Clinical pathological changes of diseased koi carp A, The diseased koi had typical symptoms of KSD, such as lethargy, lying on its side; B and C, The body swelling of the diseased koi (the white arrow was normal koi and the black arrow refered to sick koi); D, Ulcers on the body surface; E, Hyperemia of eyes and turbidity of eyeball; F, Branchial swelling.

通过组织病理学观察, 患病锦鲤鳃小片间上皮细胞大量增生, 呼吸上皮出现脱落和坏死, 鳃小片的间隙消失发生粘连(图2-A); 肝细胞变性肿胀, 部分肝细胞坏死(图2-B); 脑组织可见大量淋巴细胞浸润, 神经元细胞变性坏死(图2-C), 可见管套现象和噬神经元现象, 脑膜发生增厚和充血, 表现为增生性脑膜炎(图2-D); 肾小管上皮细胞肿胀变性, 坏死脱落至管腔中, 肾间质中有大量巨噬细胞和单核细胞浸润(图2-E); 脾脏病变不明显, 有轻微出血现象(图2-F); 心脏和肌肉组织未见明显病理改变。

图2

Fig.2

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图2 患病锦鲤组织病理学观察 A, 鳃小片发生粘连, 细胞增生, 呼吸上皮细胞出现脱落和坏死; B, 肝脏细胞出现空泡变性和坏死; C, 脑组织可见大量淋巴细胞浸润, 毛细血管扩张充血; D, 脑膜发生增厚和充血; E, 肾脏炎性细胞浸润, 细胞出现变性和坏死; F, 脾脏有轻微出血。Fig.2 Histopathological observation of koi infected by CEV A, Adhesion of gill fragments, proliferation of cells, exfoliation and necrosis of respiratory epithelial cells; B, Necrosis and vacuolar degeneration of liver cells; C, A large number of lymphocytes infiltration in the brian tissue, capillary congestion expansion; D, Meningeal thickening and hyperemia; E, Renal inflammatory cell infiltration, cell degeneration and necrosis; F, Slight bleeding in the spleen.

BHIA培养基上培养48 h(28 ℃)上未见菌落生长。鳃丝压片、血液和体表黏液涂片观察均未发现寄生虫。推测患病鲤鱼不是被已知能在BHIA生长的常见致病菌(链球菌、气单胞菌、耶尔森菌、弧菌等)或寄生虫感染而引发死亡。

分别采集1~6组中锦鲤的鳃丝, 通过组织DNA提取试剂盒提取组织DNA, 进行PCR检测。根据临床症状和流行情况, 首先使用OIE推荐的KHV和SVCV引物进行检测, 1~6组样品均为阴性。通过巢氏PCR检测方法, 进行了CEV检测, 第一步PCR反应扩增出528 bp的特异性条带(图3-A), 第二步PCR反应以第一步的PCR产物为模板, 扩增出478 bp DNA片段(图3-B), 检测结果为CEV阳性。基因测序结果显示该序列与CEV同源性高达99%, 因此可诊断该锦鲤养殖区存在CEV感染。

图3

Fig.3

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	图3 CEV巢氏PCR检测结果 M, DL1000 marker; 1, 阴性对照; 2~7, 第1~6号样品。Fig.3 Nested-PCR detection results of CEV M, DL 1000 DNA marker; 1, Negative control; 2-7, Samples of 1 to 6.

透射电镜下观察肾脏超薄切片, 在肾脏组织中可见大量痘病毒样病毒颗粒, 直径为200~240 nm, 有囊膜。病毒大小、形状和结构, 符合痘病毒科的特征(图4)。

图4

Fig.4

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	图4 电子显微镜下的肾组织中的病毒粒子 箭头所示为病毒粒子。Fig.4 Ultrathin sections of the kidney under the electronic microscope The arrow showed viral particles.

对巢氏PCR扩增产物(P4a基因)进行测序并分析, 将序列上传到GenBank得到的序列号为MG787230。根据P4a基因的部分核苷酸序列, 对英国和波兰的19条具有代表性的CEV序列进行了多重比对和系统发育分析。结果表明, 本次试验分离到的病毒株与英国株R083和CyPP-3的同源性最高, 分别为99%和98%(图5)。通过进化树发现现有CEV毒株主要分为2个基因型。

图5

Fig.5

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	图5 基于CEV P4a基因序列构建的系统进化树Fig.5 Phylogenetic tree construction based on CEV P4a gene sequence