38份供试材料取自湖南省林业科学院试验林场紫薇种质资源圃(表1)。编号1~30为美国引进品种, 其中编号1为不育品种, 编号19~23叶色紫红色, 编号24花复色。编号31~38为国内品种, 其中, 编号31为抗寒品种, 在北京地区可安全过冬, 编号32为完全不育品种, 这2个品种已通过国家植物新品种审定; 编号36为速生紫薇, 编号38为矮化品种。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 供试材料 Table 1 Experiment material 代码 Code 名称 Name 品种来源 Sources 品种特性 Characteristics 1 Double Feature 美国America 花深红色, 育性低 Flowers are dark red, low fertility 2 Bradberry Wine 美国America 花深紫红色 Flowers are deep red-purple 3 Catawba 美国America 花深紫色 Flowers are deep purple 4 Siren Red 美国 America 花深红色, 嫩叶紫红色 Flowers are dark red and young leaves are red-purple 5 Burgundy Cotton 美国 America 花白色、略带红色, 嫩叶紫红色 Flowers are white, slightly reddish and young leaves are red-purple 6 Red Rooste 美国 America 花大红色 Flowers are deep red 7 Red Filli 美国 America 花大红色, 嫩叶紫红色 Flowers are deep red and young leaves are red-purple 8 Rhapsody in Pink 美国 America 花浅粉红色, 叶片紫色 Flowers are light pink and leaves are purple 9 Royalty 美国 America 花紫色 Flowers are purple 10 Victor 美国 America 花深红色 Flowers are deep red 11 Centennial Spirit 美国 America 花深红色 Flowers are deep red 12 Violet Filli 美国 America 花紫蓝色 Flowers are violet blue 13 Cherry Dazzle 美国 America 花大红色 Flowers are deep red 14 Berry Dazzle 美国 America 花玫红色 Flowers are rose red 15 Shawberry Dazzle 美国 America 花玫红色 Flowers are rose red 16 Miami 美国 America 花粉红色, 嫩叶红色 Flowers are pink and young leaves are red 17 Purple Magic 美国 America 花紫色 Flowers are purple 18 Coral Magic 美国 America 花粉红色, 嫩叶红色 Flowers are pink and young leaves are red 19 Best Red 美国 America 花大红色, 叶片紫红色 Flowers are deep red and leaves are red-purple 20 Crimson Red 美国 America 花大红色, 叶片紫红色 Flowers are deep red and leaves are red-purple 21 Blush 美国 America 花白色、略带粉红, 叶片紫红色 Flowers are white, slightly pink and leaves are red-purple 22 Pure White 美国 America 花纯白色, 叶片紫红色 Flowers are white and leaves are red-purple 23 Red Hot 美国 America 花大红色, 叶片紫红色 Flowers are deep red and leaves are red-purple 24 Peppermint 美国 America 花复色, 玫红色略带白边 Flowers are rose red with white edges 25 Moonlight Magic 美国 America 花白色, 叶片紫红色 Flowers are white and leaves are red-purple 26 Midnight Magic 美国 America 花粉红色, 叶片紫红色 Flowers are pink and leaves are red-purple 27 Snow White 美国 America 花纯白色 Flowers are white 28 Red Rocket 美国 America 花大红色 Flowers are deep red 29 Dynamite 美国 America 花大红色、略带白边 Flowers are deep red with white edges 30 pink velour 美国 America 花深粉红色, 嫩叶紫红色 Flowers are deep pink and young leaves are red-purple 31 晓明1号Xiaoming No. 1 湖南 Hunan 花大红色, 嫩叶紫红色 Flowers are deep red, young leaves are red-purple 32 湘韵 Xiangyun 湖南 Hunan 花粉红色, 完全不育 Flowers are pink and complete infertility 33 紫云 Ziyun 浙江 Zhejiang 花紫红色 Flowers are red-purple 34 温州红叶Wenzhou Hongye 浙江 Zhejiang 花浅粉红色, 嫩叶紫红色 Flowers are light pink and young leaves are red-purple 35 温江大红Wenjiang Dahong 四川 Sichuan 花深粉红色 Flowers are deep pink 36 淮南速生Huainan Susheng 江苏 Jiangsu 花浅粉红色, 叶片大 Flowers are light pink and leaves are large 37 淮南红叶Huainan Hongye 江苏 Jiangsu 花浅粉红色, 嫩叶红色 Flowers are light pink and young leaves are red 38 深紫红矮化Deep purple dwarf 浙江 Zhejiang 花深紫红色, 矮化品种 Flowers are deep red-purple and plant is dwarf

表1 供试材料 Table 1 Experiment material

样品采集方法:在选定的植株上随机采集数片嫩叶, 用冰袋带回实验室, 用双蒸水冲洗干净, 保存于-80 ℃冰箱备用。

采用改良的CTAB法^[13](4% CTAB, 1.4 mol· L^-1 NaCl, 0.1 mol· L^-1 Tris-HCl、pH 8.0, 0.02 mol· L^-1 EDTA、pH 8.0, 2% β -巯基乙醇)提取紫薇叶片中的基因组DNA, 样品研磨过程中加入2% PVP粉末。使用0.8%琼脂糖凝胶电泳和核酸蛋白测定仪检测DNA的质量和浓度。

所用引物参照加拿大哥伦比亚大学(UBC primer set No. 9, University of British Columbia, Canada, http:// www. ubc. ca)公布的植物通用ISSR引物, 由生工生物工程(上海)有限公司合成。从100条引物中筛选出扩增条带清晰、多态性好的10条引物(表2)。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 筛选出的ISSR引物及其扩增结果 Table 2 Selected ISSR primers and their amplification results 引物编号 Primer number 引物序列 Primer sequence(5’ -3’ ) 扩增总条带数 Total number of bands amplified 多态性条带数 Polymorphism bands 多态性比率 Polymorphism ratio/% UBC814 CTCTCTCTCTCTCTCTA 6 6 100.00 UBC824 TCTCTCTCTCTCTCTCG 9 9 100.00 UBC826 ACACACACACACACACC 10 8 80.00 UBC840 GAGAGAGAGAGAGAGAYT 10 9 90.00 UBC844 CTCTCTCTCTCTCTCTRC 8 5 62.50 UBC845 CTCTCTCTCTCTCTCTRG 8 7 87.50 UBC846 CACACACACACACACART 7 5 71.43 UBC847 CACACACACACACACARC 9 9 100.00 UBC879 CTTCACTTCACTTCA 7 6 85.71 UBC899 CATGGTGTTGGTCATTGTTCCA 7 6 85.71

表2 筛选出的ISSR引物及其扩增结果 Table 2 Selected ISSR primers and their amplification results

PCR反应体系(20 μ L):30 ng DNA模板(1 μ L), 1.5 U Taq DNA聚合酶(0.2 μ L), 0.60 μ mol· L^-1引物(1 μ L), 0.20 mmol· L^-1 dNTPs(2 μ L), 10× PCR buffer Mg²⁺ free (4 μ L)、2.0 mmol· L^-1 MgCl₂(1.4 μ L), ddH₂O补足至20 μ L。反应程序:94 ℃预变性5 min, 94 ℃变性30 s, 47~59 ℃退火(不同引物有其特异退火温度)30 s, 72 ℃延伸2 min, 35个循环; 72 ℃延伸10 min; 4 ℃保存。1× TAE缓冲液、1.2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR反应引物, 使用BIO RAD凝胶成像系统进行拍照记录。所有实验重复3次。

选择清晰度高、重复性好的扩增条带进行分析, 把每条带作为1个等位基因, 有条带记1, 无条带记0^[14], 建立原始数据矩阵。使用分析软件NTsys2.10e进行遗传相似性分析和UPGMA聚类分析。用Popgene32计算不同品种间的基因多样性、Shannon信息指数、总体基因多样性等。用NTsys2.10e软件^[15]进行遗传相似系数分析。采用Nei-Li相似系数法^[16], 计算各个材料间的遗传相似系数I和遗传距离D, I=2m_xy· mx-1+m_y, D=1-I, 其中m_xy为第x个材料和第y个材料共有的条带数, m_x和m_y分别为第x个材料和第y个材料各自的总扩增带数, 并用UPGMA法进行聚类分析。

琼脂糖凝胶电泳检测结果表明, 提取的紫薇叶片基因组DNA浓度高, 完整性好, 基本无蛋白质和RNA污染。

用筛选出来的10条引物对38个紫薇材料进行PCR扩增, 共扩增出81条分子量在200~2 800 bp的条带, 其中, 多态性条带数量为70条, 多态性位点百分率(PPB)为86.42%(表2), 每条引物可以扩增出6~10个DNA条带, 平均8.1个。通过PopGen32软件计算出各位点的有效等位基因数(Ne)为1.408 0, Nei's基因多样性指数(H)为0.249 6, Shonnon's信息指数(S)为0.386 4。

通过PopGen32软件进行样品间遗传相似性系数的计算, 得出38个紫薇品种间的Nei's遗传相似性系数介于0.543 2~0.988 7, 平均为0.788 2。淮南速生与淮南红叶之间遗传相似性系数最大(0.988 7), 表明两者亲缘关系比较近。Shawberry Dazzle与温州红叶之间遗传相似性系数最小(0.543 2), 表明两者之间遗传差异较大。

基于ISSR扩增结果, 按UPGMA法分析38个紫薇品种间的遗传关系, 得到不同品种间的遗传关系树状图(图1)。在遗传相似性系数0.736处可将38个紫薇品种分为3类群(表3)。

图1

Fig.1

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	图1 基于ISSR标记的38个紫薇品种的UPGMA聚类图Fig.1 UPGMA dendrogram of 38 Lagerstroemia indica cultivars based on ISSR marker

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 38个紫薇品种的ISSR分类 Table 3 Classification of 38 Lagerstroemia indica cultivars based on ISSR 类群 Groups 品种名 Variety name 类群Ⅰ GroupⅠ A Double Feature、Royalty、Cherry Dazzle、Violet Filli、Purple Magic、Victor、Berry Dazzle、Shawberry Dazzle、Centennial Spirit、 Catawba、 Red Rooste B Siren Red、 Burgundy Cotton、 Red Filli、 Rhapsody in Pink、 Miami、Best Red C Bradberry Wine 、Coral Magic 类群Ⅱ GroupⅡ D Crimson Red、Red Hot、Blush、Pure White、湘韵 Xiangyun、Dynamite、pink velour、晓明1号 Xiaoming No. 1、深紫红矮化Deep purple dwarf、Peppermint、Midnight Magic、Red Rocket E Snow White F 紫云Ziyun、淮南速生Huainan Susheng、淮南红叶Huainan Hongye、温江大红 Wenjiang Dahong 类群Ⅲ GroupⅢ Moonlight Magic、温州红叶Wenzhou Hongye

表3 38个紫薇品种的ISSR分类 Table 3 Classification of 38 Lagerstroemia indica cultivars based on ISSR

类群Ⅰ 均为美国引进品种, 在相似性系数0.760处又可分为3个亚类, 亚类A为红色系和紫色系品种, 包括Double Feature、Royalty、Cherry Dazzle、Violet Filli、Purple Magic、Victor、Berry Dazzle、Shawberry Dazzle、Centennial Spirit、Catawba、Red Rooste, 在相似性系数0.858处2个紫色品种(Violet Filli、Purple Magic)和2个玫红色品种(Berry Dazzle、Shawberry Dazzle)分别聚为一类; 亚类B包括Siren Red、Burgundy Cotton、Red Filli、Rhapsody in Pink、Miami、Best Red, 嫩叶全部为紫红色; 亚类C包含2个花色和叶色均不同的紫薇品种(Bradberry Wine、Coral Magic)。

类群Ⅱ 包括10个美国引进品种和7个国内培育品种, 在相似性系数为0.778处又可分为3个亚类, 其中亚类D包括Crimson Red、Red Hot、Blush、Pure White、Dynamite、pink velour、Peppermint、Midnight Magic、Red Rocket等9个美国引进品种和湘韵、晓明1号、深紫红矮化等3个国内培育品种, 在相似性系数0.844处3个紫叶品种(Crimson Red、Red Hot、Blush)聚在一起, 矮化品种(深紫红矮化)单独聚为一类; 亚类E只包含1个纯白色品种(Snow White); 亚类F包含4个花色不同的国内培育品种(紫云、淮南速生、淮南红叶、温江大红)。

类群Ⅲ 包含1个白色引进品种(Moonlight Magic)和1个粉红色国内培育品种(温州红叶)。