柑橘黄龙病菌PCR阳性病株空间分布格局与参数特征应用研究

引用本文

孟幼青, 汪恩国, 李艳敏, 明珂, 袁亦文. 柑橘黄龙病菌PCR阳性病株空间分布格局与参数特征应用研究[J]. 浙江农业学报, 2019,31(4): 579-587.
MENG Youqing, WANG Enguo, LI Yanmin, MING Ke, YUAN Yiwen. Study on spatial distribution pattern and parameter characteristics of PCR positive strains of Citrus Huanglongbing[J]. ACTA AGRICULTURAE ZHEJIANGENSIS, 2019,31(4): 579-587. 复制到剪切板

Doi: 10.3969/j.issn.1004-1524.2019.04.10
Permissions

《浙江农业学报》编辑部所有

柑橘黄龙病菌PCR阳性病株空间分布格局与参数特征应用研究

孟幼青¹, 汪恩国², 李艳敏¹, 明珂³, 袁亦文⁴

1.浙江省植物保护检疫局,浙江杭州310020

2.临海市农技推广中心,浙江临海317000

3.台州市植物保护检疫站,浙江椒江318000

4.温州市农业局,浙江温州325000

作者简介:孟幼青(1963—),女,浙江诸暨人,高级农艺师,主要从事柑橘检疫性有害生物研究。E-mail: yqmeng_77@163.com

收稿日期: 2018-10-08

基金资助: 浙江省重点研发计划(2015C02007)

摘要

为了揭示浙江柑橘黄龙病菌PCR阳性病株空间分布信息和染病特征,2017—2018年对7个柑橘黄龙病发生样地2 900株橘树进行黄龙病菌PCR检测,按10株1样方取得290组样本资料,应用聚集度指标法对其空间分布型进行数据测定,结果达到 C>1、 I>0、 K>0、 C_A>0、 M^*/$\bar{x}$>1,均为聚集分布格局,表明柑橘黄龙病菌PCR阳性病株田间分布趋向聚集分布。经Iwao的 M^*-$\bar{x}$线性模型回归检验表明,柑橘黄龙病菌PCR阳性病株空间分布的基本成分是个体群,病株间相互吸引,表现有明显的发病中心;经Taylor的 V-幂法则模型检验分析表明,黄龙病菌阳性病株的空间分布具有密度依赖性,阳性病株密度越高越趋向聚集分布,即聚集强度随阳性率上升而增强。其理论抽样数模型为 N=1.962 /D²[1.6976 /$\bar{x}$ -0.9296]及序贯抽样公式为 T_n=1.6976 /[$D^{2}_{0}$ +0.9296 /n]。应用这些参数特征对提高田间柑橘黄龙病早期预警效率和决策防控具有良好的指导意义。

关键词: 柑橘黄龙病菌; PCR阳性病株; 空间分布型; 抽样技术

中图分类号:S412 文献标志码:A 文章编号:1004-1524(2019)04-0579-09

Study on spatial distribution pattern and parameter characteristics of PCR positive strains of Citrus Huanglongbing

MENG Youqing¹, WANG Enguo², LI Yanmin¹, MING Ke³, YUAN Yiwen⁴

1. Zhejiang Plant Protection and Quarantine Bureau, Hangzhou 310020, China

2. Linhai Agricultural Technology Extension Center, Linhai 317000, China

3. Taizhou Plant Protection and Quarantine Station, Jiaojiang 318000, China

4.Wenzhou Agriculture Bureau, Wenzhou 325000, China

Abstract

In order to reveal the spatial distribution and infection characteristics of PCR positive strains of Citrus Huanglongbing in Zhejiang Province, PCR method was used to sample and detect 2 900 orange trees scattered in 7 different locations where Citrus Huanglongbing occurred during the year 2017 and 2018. Ten strains were clustered as a group, 290 groups of sample data were obtained. The spatial distribution pattern of Citrus Huanglongbing was determined by aggregation index method. The results showed that C>1, I>0, K>0, C_A>0, M^*/$\bar{x}$>1, were aggregation distribution patterns, indicating that the distribution of Citrus Huanglongbing PCR-positive plants tended to aggregation distribution. The regression test of Iwao's M^*-$\bar{x}$ linear model indicated that the basic components of spatial distribution of Citrus Huanglongbing PCR-positive plants were individual groups. The PCR-positive plants attract to each other, thus making a clear distributive focus of diseases in the citrus orchard. The analysis of Taylor's V-$\bar{x}$ power law model showed the spatial distribution to be density-dependent, the higher the density of positive plants, the more tendency to aggregate distribution, meaning the intensity of aggregation increases with growing positive rate. The theoretical sampling model was N=1.962 /D²[1.6976 /$\bar{x}$-0.9296], while the sequential sampling formula was T_n=1.6976/[$D^{2}_{0}$+0.9296/ n]. The application of these parameters was of great significance in improving monitoring efficiency and early-warning of Citrus Huanglongbing, as well as making control decisions.

Keyword: Citrus Huanglongbing pathogen; PCR-positive plant; distribution pattern; sampling techniques

文章图片

柑橘黄龙病(Huanglongbing, HLB)是由一种韧皮部杆菌属(Candidatus Liberibacter spp.)细菌引起的, 目前广泛分布在亚洲、非洲、美洲等近50个国家和地区, 对柑橘产业具有毁灭性危害, 自然条件下主要通过携带病菌的柑橘木虱取食传播, 其症状表现较为复杂多样^{[1, 2, 3, 4]}。田间目测调查常常产生误诊和漏诊现象, 同时由于柑橘植株从感病到显症具有较长潜伏期^[4], 无法涉及田间潜伏隐症病株, 依“ 红鼻果” 测定柑橘黄龙病空间分布信息也常存较大误差, PCR分子检测可有效解决田间误诊和隐症病株遗漏问题, 目前应用柑橘黄龙病菌PCR分子技术开展果园病株空间分布型和抽样技术的研究尚属鲜见^{[5, 6, 7, 8, 9, 10, 11]}。为了更全面、更准确地揭示浙江柑橘黄龙病阳性病株空间分布格局及其参数特征, 建立柑橘黄龙病理论抽样数模型和序贯抽样模型, 规范田间监测预警与抽样技术, 笔者于2017— 2018年对浙江7个柑橘黄龙病发生区的橘树逐株采样2 900个进行黄龙病菌PCR检测, 系统调查研究柑橘黄龙病阳性病株空间分布格局与参数特征, 旨在明确黄龙病阳性病株田间分布信息及其染病特征, 探讨病害发生与流行原因, 为柑橘黄龙病监测防控和相关试验研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 调查采样地概况

调查选自2000年浙江柑橘黄龙病入侵扩散危害的发生区域, 即位于浙东南沿海和浙西南的瓯海、乐清、玉环、黄岩、宁海、庆元和莲都等7个县(市、区)的样地橘园, 调查柑橘品种为瓯柑、椪柑、温州蜜柑、本地早、玉环柚、甜橘柚等, 果园树龄15~20年, 种植密度675~1 200 株· hm^-2, 果园立地平原和山地, 栽培常规管理, 部分橘园失管。

1.2 调查采样方法

2017年12月至2018年1月, 根据调查县(市、区)柑橘种植情况和柑橘黄龙病发生情况, 每县(市、区)选定柑橘果园面积33 hm²左右作为1个调查样地, 每样地选择4~5个连片果园, 每果园调查100株, 先逐株采用目测调查斑驳黄化、新梢均匀黄化、黄脉和缺素黄化等显症疑似病株^[12], 然后1株采1样, 按树冠东南西北中5方位采集当年抽生的春梢叶片(有以上症状的则取其症状叶)各1张, 5张组合为1样, 并依序进行采样编号, 然后室内测定柑橘黄龙病菌阳性或阴性。

1.3 黄龙病菌PCR检测

委托浙江省检验检疫科学技术研究院, 采用GBT28062— 2011柑橘黄龙病菌实时荧光PCR检测方法, 对采集样品进行柑橘黄龙病菌携带情况检测, 记录PCR检测鉴定结果, 然后依序按10株1样方, 统计田间阳性病株发生频次。

1.4 数据处理及分析方法

将田间调查和实验室PCR检测所得数据, 列出柑橘黄龙病PCR阳性病株数量的频次分布表, 计算出阳性病株数量、阳性率和阳性密度等, 按样方阳性病株数量分布制成柑橘黄龙病阳性病株空间分布频次表。采用聚集度指标法分别计算出阳性病株样方平均密度( $\overset{̅}{x}$ )、方差(V)、平均拥挤度(M^*)、Beall扩散系数(C)、David and Moore丛生指数I、Water's负二项分布参数K、Cassie指标C_A、Lioyd聚块性指标M^*/ $\overset{̅}{x}$ 等各值。运用这些聚集度参数测定柑橘黄龙病阳性病株空间分布格局。然后利用Iwao法回归模型(M^*- $\overset{̅}{x}$ 回归分析)和Taylor幂法则等方法, 进一步分析柑橘黄龙病阳性病株空间分布格局。采用Blackith提出的聚集均数(λ )分析聚集原因, 即当λ < 2时, 其病株的聚集可能是由于某些环境因素作用引起; 当λ ≥ 2时, 其病株的聚集是由于病害本身特性与环境条件综合影响所致。

根据Iwao提出的抽样原理, 其理论抽样数公式为:N=t²/D²[(α +1)/ $\overset{̅}{x}$ +(β -1)], 式中N为最适抽取样方数, $\overset{̅}{x}$ 为阳性病株样方密度均数, t为分布临界值(保证概率取值), α 、β 为M^*- $\overset{̅}{x}$ 回归参数, D为允许相对误差:D=S_x/ $\overset{̅}{x}$ , 从而建立不同柑橘黄龙病阳性率发生情况下所需的理论抽样数模型。根据Kuno提出的新序贯抽样理论, 其通式为:T_n=(α +1)/[ $D_{0}^{2}$ -(β -1)/n], 式中T_n为已抽取的累计阳性密度数量; α 、β 为M^*- $\overset{̅}{x}$ 线性回归参数, n为抽取样本的数量; D₀为精密指标, 从而建立柑橘黄龙病序贯抽样模型和序贯抽样检索表。

2 结果与分析

2.1 柑橘黄龙病PCR阳性密度频次分布

经表1显示, 浙江柑橘黄龙病总体上自南而北感染程度逐渐减弱, 尤其浙东南沿海橘区更为明显, 表明柑橘黄龙病阳性病株数量在不同橘区(橘园)样地分布差异明显, 符合空间分布型测定要求, 其被测橘区(橘园)黄龙病阳性病株频次分布适合二项分布。利用最小二乘法, 建立阳性病株样方密度均值( $\overset{̅}{x}$ )与柑橘黄龙病阳性率(Q%)之间的回归方程:Q=10 $\overset{̅}{x}$ (r=1.0^{* *}), 其相关程度达极显著水平。

表1 柑橘黄龙病PCR阳性病株密度及其频次分布表 Table 1 Density and frequency distribution of Citrus Huanglongbing PCR-positive plants

样地序号(橘区) Sample Serial Number (Affected area)	抽样检测样方数 Quadrate number	柑橘黄龙病PCR阳性病株频次分布统计数量 Statistical frequency distribution of Citrus Huanglongbing PCR-positive plants											阳性数量 Number of positive plants	阳性率 Positive rate/%	阳性密度均值 Average positive density( $\overset{̅}{x}$ )
样地序号(橘区) Sample Serial Number (Affected area)	抽样检测样方数 Quadrate number	0	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	阳性数量 Number of positive plants	阳性率 Positive rate/%	阳性密度均值 Average positive density( $\overset{̅}{x}$ )
1(瓯海 Ouhai)	40	25	3	3	3	2	1	0	1	1	0	1	56	14.00	1.4000
2(乐清 Yueqing)	40	18	7	3	2	2	1	1	2	0	2	2	90	22.50	2.2500
3(玉环 Yuhuan)	40	16	6	5	5	2	3	1	1	1	0	0	75	18.75	1.8750
4(黄岩 Huangyan)	50	16	3	7	9	2	0	2	1	0	0	0	71	14.20	1.4200
5(宁海 Ninghai)	40	37	2	0	1	0	0	0	0	0	0	0	5	1.25	0.1250
6(庆元 Qingyuan)	40	33	3	4	0	0	0	0	0	0	0	0	11	2.75	0.2750
7(莲都 Liandu)	40	31	5	1	1	2	0	0	0	0	0	0	18	4.50	0.4500

表1 柑橘黄龙病PCR阳性病株密度及其频次分布表 Table 1 Density and frequency distribution of Citrus Huanglongbing PCR-positive plants

2.2 柑橘黄龙病PCR阳性病株空间分布型

2.2.1 聚集度指标测定

应用聚集度指标测定结果显示, 被测7个橘区(橘园)样地的黄龙病PCR阳性病株空间分布均达到C> 1、I> 0、K> 0、C_A> 0、M^*/m> 1, 均为聚集分布格局(表2)。表明柑橘黄龙病阳性病株的空间分布型为聚集分布格局, 其聚集强度随阳性病株密度升高而增强。

表2 柑橘黄龙病PCR阳性病株分布聚集度指标测定 Table 2 Determination of distribution index of Citrus Huanglongbing PCR-positive plants

样地序号(橘区) Sample serial number(Producing area)	样方数 Quadrate Number	平均数 Average ( $\overset{̅}{x}$ )	方差 Variance (V)	扩散系数 Diffusion coefficient(C)	丛生指数 Clumping index(I)	K	C_A	拥挤度 Degree of congestion (M^*)	M^/m*	分布格局 Distribution pattern
1(瓯海Ouhai)	40	1.4000	5.8400	4.1714	3.1714	0.4414	2.2653	4.5714	3.2653	聚集Aggregated
2(乐清Yueqing)	40	2.2500	9.6875	4.3056	3.3056	0.6807	1.4691	5.5556	2.4691	聚集Aggregated
3(玉环Yuhuan)	40	1.8750	4.6594	2.4850	1.4850	1.2626	0.7920	3.3600	1.7920	聚集Aggregated
4(黄岩Huangyan)	50	1.4200	3.2836	2.3124	1.3124	1.0820	0.9242	2.7324	1.9242	聚集Aggregated
5(宁海Ninghai)	40	0.1250	0.2594	2.0750	1.0750	0.1163	8.6000	1.2000	9.6000	聚集Aggregated
6(庆元Qingyuan)	40	0.2750	0.3994	1.4523	0.4523	0.6080	1.6446	0.7273	2.6446	聚集Aggregated
7(莲都Liandu)	40	0.4500	1.0475	2.3278	1.3278	0.3389	2.9506	1.7778	3.9506	聚集Aggregated

表2 柑橘黄龙病PCR阳性病株分布聚集度指标测定 Table 2 Determination of distribution index of Citrus Huanglongbing PCR-positive plants

2.2.2 Iwao法检验

运用Iwao提出的M^*- $\overset{̅}{x}$ 回归分析法检验, 柑橘黄龙病阳性病株空间分布结构的相关回归方程式为:M^*=1.9296 $\overset{̅}{x}$ +0.6976 (r=0.9053^{* *})。

得α =0.697 6, 即α ﹥0, 表明柑橘黄龙病阳性病株田间分布的基本成分是个体群, 阳性病株个体间相互吸引, 阳性病株在橘区(橘园)中存在明显的发病中心; 且β =1.929 6, 即β > 1, 表明阳性病株个体群在橘区(橘园)中呈聚集分布格局, 即分布的基本成分个体群之间趋于聚集分布特征, 个体群内个体与核心分布相吻合。

2.2.3 Taylor法检验

运用Taylor的幂法则, 拟合方差(V)与平均数( $\overset{̅}{x}$ )的幂相关回归方程式, 其结果分别为:V=2.749 7 $\overset{̅}{x}$ +1.242 8 (r=0.980 2^{* *})。由于a=2.749 7, b=1.242 8, 即b> 1, 进一步表明柑橘黄龙病阳性病株在田间分布格局为聚集分布特征, 且具有密度依赖性, 即阳性病株密度越高越趋向聚集分布, 故聚集强度是随着柑橘黄龙病阳性率的上升而增强。这与聚集度指标法分析结果相一致。

2.2.4 聚集原因分析

应用Blackith的种群聚集均数(λ )检验聚集的原因, 其公式为λ = $\overset{̅}{x}$ /(2k)× r, 其中k为负二项分布的指数k值, r为2k自由度当α =0.05时的χ ²分布的函数值。将聚集度指标法测定的7组样地阳性病株密度均值( $\overset{̅}{x}$ )与聚集均数(λ )进行相关分析(表3), 得:λ =2.816 7 $\overset{̅}{x}$ +0.253 9(r=0.967 7^{* *})。由此可知, 当橘区(橘园)样方阳性病株平均密度 $\overset{̅}{x}$ < 0.616 9即黄龙病阳性率小于6.17%时, λ < 2, 其病株聚集原因主要是某些如气候条件、栽培管理、病虫防治等影响所致, 主要在于近20余年来冬季气温回暖, 尤其近年浙江柑橘产业相对经济效益较低, 橘区放松种苗管理和田间病虫害控制, 介体柑橘木虱种群分布逐渐向北向西推进, 其发生范围明显扩大, 由1982年的28.75° N北扩到近年的29.48° N, 东经120° 25'E西进到近年的118° 01'E, 黄龙病也随之向北向西扩散蔓延, 但其病株发生密度则表现自南向北、自东向西逐步减少。本次阳性病株平均密度< 0.616 9的监测区域主要为宁海0.125 0, 庆元0.275 0, 莲都0.450 0, 即为毗邻介体木虱发生北缘和西缘地区。该区域常年冬季气温低于浙江东南沿海橘区, 介体种群数量较少(近年秋季盛发期百株成若虫< 40头)和带菌率偏低(< 10%), 相对病源自身较弱, 病株总体发生相对较少。当橘区(橘园)样方阳性病株平均密度 $\overset{̅}{x}$ ≥ 0.616 9(即黄龙病阳性率≥ 6.17%)时, λ ≥ 2, 其病株聚集原因是病害本身的聚集行为与环境条件等综合影响的结果, 本次阳性病株平均密度≥ 0.616 9的监测区域主要为瓯海1.400, 乐清2.250, 玉环1.875, 黄岩1.420, 属浙东南柑橘优势产业带, 近年区域内出现多个点状发病中心, 病源自身相对较强, 受点式病源发病基础影响, 木虱种群数量大且带菌率高等互作效应(近年秋季盛发期百株成若虫1 000头左右, 带菌率70%左右), 易造成黄龙病害点状或片状扩散流行。

表3 柑橘黄龙病PCR阳性病株聚集均数表 Table 3 Aggregation mean of Citrus Huanglongbing PCR-positive plants

序号No.	$\overset{̅}{x}$	2k	r(χ ²)	λ
1	1.4200	2.16	5.6372	3.6991
2	2.2500	1.36	4.0779	6.7399
3	0.4500	0.68	2.6035	1.7285
4	0.1250	0.23	0.8933	0.4801
5	1.4000	0.88	3.3912	5.3774
6	0.2750	1.22	3.6428	0.8238
7	1.8750	2.53	6.5783	4.8844

表3 柑橘黄龙病PCR阳性病株聚集均数表 Table 3 Aggregation mean of Citrus Huanglongbing PCR-positive plants

2.3 抽样技术

2.3.1 最适抽样模型

根据Iwao的最适抽样模型, 取保证概率值t=1.96, 允许误差D₁=0.2, D₂=0.3, 且α =0.6976, β =1.9296, 建立理论抽样数模型N=1.962/D₂[1.6976/ $\overset{̅}{x}$ +0.9296], 即得到最适抽样模型:N₁=83.2673/ $\overset{̅}{x}$ +45.5969; N₂=37.0077/ $\overset{̅}{x}$ +20.2673。应用这些理论抽样数模型计算出柑橘黄龙病不同阳性率下应抽取的最适抽样数(图1)。

	Figure Option View Download New Window
	图1 柑橘黄龙病不同阳性率下所需最适抽样数图Fig.1 Optimum sampling number for different positive rates of Citrus Huanglongbing

当橘区(橘园)黄龙病阳性率5%时, 所需允许误差D=0.2的抽样数212株或允许误差D=0.3的抽样数94株; 当橘区(橘园)阳性率10%时, 所需抽样数D=0.2为129株或D=0.3为57株; 当橘区(橘园)阳性率20%时, 所需抽样数D=0.2为87株或D=0.3为39株; 当橘区(橘园)阳性率30%~50%时, 所需抽样数D=0.2为62~73株或D=0.3为28~33株。随着黄龙病阳性病株率的上升, 所需抽样数递减。

2.3.2 序贯抽样

根据Kuno提出的新序贯抽样理论, 运用α =0.697 6, β =1.929 6, 建立序贯抽样模型为T_n=1.697 6/[ $D_{0}^{2}$ -0.929 6/n], 一般取D₀=0.15, 0.20, 0.25; 当n分别为10, 20, ….., 100, 200时, 即得柑橘黄龙病阳性病株检测序贯抽样表(表4)。在田间调查时可应用序贯抽样表进行序贯抽样, 当调查的累计病级数达到预定精密指标下的病级指标时停止调查, 累计病级数除以取样数, 即为平均密度。

表4 柑橘黄龙病PCR阳性检测序贯抽样表 Table 4 Sequential sampling table for PCR positive detection of Citrus Huanglongbing

2.4 柑橘黄龙病目测诊断与PCR测定病株关系分析

经对上述7个样地果园柑橘黄龙病目测调查病株(E)与PCR阳性病株(Q)关系测定(表5、图2), 总体柑橘黄龙病阳性发病率14.19%, 其中阳性病株隐症率1.10%, 表明田间柑橘黄龙病的确诊易受病株隐症和目测误诊等干扰影响, 目测视症诊断常存病株隐症漏诊情况, 且突出表现存在多诊误判现象, 通过人为目测诊断与实验PCR测定比较, 显示目测诊断病株总体隐症漏诊率7.75%, 病株总体累加多诊率47.11%, 究其多诊原因主要在于目测视诊以斑驳黄化、缺素黄化、新梢均匀黄化、黄脉等显症症状进行诊断, 本次调查3 002株植株目测视症诊断病株743株, 其中斑驳黄化症状23.15%、缺素黄化症状59.26%、新梢均匀黄化和黄脉等其他症状17.59%, 由于黄龙病缺素黄化症状与栽培生理缺素较易混淆, 也易造成误诊。但是, 目测诊断病株(率)与实验PCR检测阳性病株(率)两者存在极显著的线性关系, 其数学模型为E=1.066 2Q+9.626 4(df=30, r=0.835 8^{* *}, r_0.01=0.462 9), 依此模型分析目测诊断准确率整体随田间发病率升高而提高, 一般田间病株阳性率10%时人为目测诊断准确率仅为PCR阳性检测的50%左右; 当田间病株阳性率20%时人为目测诊断准确率可为PCR阳性检测的65%左右; 当田间病株阳性率30%时人为目测诊断准确率可为PCR阳性检测的72%左右; 当田间病株阳性率50%以上时人为目测诊断准确率可达PCR阳性检测的80%以上。

表5 柑橘黄龙病目测诊断病株与PCR检测阳性病株关系表 Table 5 Relationship between visual diagnosis of Citrus Huanglongbing and PCR-positive strains

样地序号 (橘区) Serial number		果园编号 Orchard number			果园地址 Orchard address		品种 Variety			树龄 Wood age			立地条件 Site conditions			调查株数 Number of trees investigated			视症诊断病株Visual diagnosed diseased plants			PCR阳性病株 PCR-positve plants			疑症病株 Hypochondriac plants		隐症病株 Cryptopathic plants
瓯海 Ouhai		1			三垟镇应潭村 Yingtan Village, Sanyang Town		瓯柑 Citrus suavissima Hort. ex Tanaka			5			平地 Flat ground			100			7			10			—		3
		2			三垟镇应潭村 Yingtan Village, Sanyang Town		瓯柑 Citrus suavissima Hort. ex Tanaka			5			平地 Flat ground			100			5			0			5		—
		3			丽岙乡曹建村 Caojian Village, Liao Township		瓯柑 Citrus suavissima Hort. ex Tanaka			10			平地 Flat ground			100			48			43			5		—
		4			泽雅镇泽雅库区 Zeyaku District, Zeya Town		瓯柑 Citrus suavissima Hort. ex Tanaka 血橙 Citrus sinensis Osbeck forma sanguinea			15			山地 Mountainous area			100			0			3			—		3
乐清 Yueqing		5			清江镇江沿村 Jiangyan Village, Qingjiang Town		瓯柑 Citrus suavissima Hort. ex Tanaka			5			山地 Mountainous area			102			11			26			—		15
							柚 Citrus grandis (L.)Osbeck
		6			清江镇上埠头村 Shangbutou Village, Qingjiang Town		瓯柑 Citrus suavissima Hort. ex Tanaka			10			平地 Flat ground			100			17			8			9		—
							早橘 Citrus compressa Tanaka
			7			虹桥镇北村 Bei Village, Hongqiao Town		温州蜜柑 Citrus unshiu Marc.			37			山地 Mountainous area			100			0			1		—		1
			8			虹桥镇上腾村 Shangteng Village, Hongqiao Town		瓯柑 Citrus suavissima Hort. ex Tanaka			20			平地 Flat ground			100			96			55		41		—
玉环 Yuhuan			9			清港镇外马村 Waima Village, Qinggang Town		文旦 Decumana (L.)Tanaka			30			平地 Flat ground			100			32			10		22		—
			10			清港镇凡宏村 Fanhong Village, Qinggang Town		文旦 Decumana (L.)Tanaka			40			平地 Flat ground			100			86			46		40		—
			11			清港镇鹤新村 Hexin Village, Qinggang Town		文旦 Decumana (L.)Tanaka			40			平地 Flat ground			100			24			18		6		—
			12			清港镇王家村 Wangjia Village, Qinggang Town		文旦 Decumana (L.)Tanaka			7			平地 Flat ground			100			0			1		—		1
黄岩 Huangyan			13			上垟乡董岙村 Dongao Village, Shangyang Township		温州蜜柑 Citrus unshiu Marc.			38			山地 Mountainous area			100			65			23		42		—
			14			上垟乡前岸村 Qianan Village, Shangyang Township		温州蜜柑 Citrus unshiu Marc.			13			山地 Mountainous area			100			35			0		35		—
			15			上垟乡前岸村 Qianan Village, Shangyang Township		本地早 Citrus reticulata var. succosa (Tanaka) Hu			13			山地 Mountainous area			100			29			0		29		—
			16			澄江街道凤洋村 Fengyang Village, Chengjiang Street		本地早 Citrus reticulata var. succosa (Tanaka) Hu			35			平地 Flat ground			100			11			15		—		4
			17			澄江街道凤洋村 Fengyang Village, Chengjiang Street		本地早 Citrus reticulata var. succosa (Tanaka) Hu			35			平地 Flat ground			100			28			33		—		5
宁海 Ninghai			18			力洋镇小青村 Xiaoqing Village, Liyang Town		温州蜜柑 Citrus unshiu Marc.			8			平地 Flat ground			100			17			0		17		—
			19			力洋镇平岩村 Pingyan Village, Liyang Town		温州蜜柑 Citrus unshiu Marc.			8			平地 Flat ground			100			21			0		21		—
			20			力洋镇胡陈港村 Huchengang Village, Liyang Town		温州蜜柑 Citrus unshiu Marc.			14			平地 Flat ground			100			36			2		34		—
			21			力洋镇上山村 Shangshan Village, Liyang Town		温州蜜柑 Citrus unshiu Marc.			10			平地 Flat ground			100			9			3		6		—
庆元 Qingyuan			22			竹口镇盘龙湾村 Panlongwan Village, Zhukou Town		甜橘柚 Citrus hassaku Hort. ex Tanaka× C. unshiu Marc.			3			山地 Mountainous area			100			0			1		—		1
			23			竹口镇黄坑村 Huangkeng Village, Zhukou Town		甜橘柚 Citrus hassaku Hort. ex Tanaka× C. unshiu Marc.			17			山地 Mountainous area			100			0			0		—		0
			24			濛州街道白象山 Baixiang Mountain, Mengzhou Street		温州蜜柑 Citrus unshiu Marc.			21			山地 Mountainous			100			12			10		2		—
								椪柑 Citrus poonensis Hort. ex Tanaka
	25			濛州街道府后山 Fuhou Mountain, Mengzhou Street					甜橘柚 Citrus hassaku Hort. ex Tanaka× C. unshiu Marc.			2			山地 Mountainous area			100			0			0		—		0
莲都 Liandu	26			紫金街道梅溪岭 Meixiling, Zijin Street					椪柑 Citrus poonensis Hort. ex Tanaka			25			山地 Mountainous area			100			3			1		2		—
	27			紫金街道风化村 Fenghua Village, Zijin Street					椪柑 Citrus poonensis Hort. ex Tanaka			25			山地 Mountainous area			100			36			16		20		—
	28			万象排山橘场 Wanxiangpaishan Citru Garden					椪柑 Citrus poonensis Hort. ex Tanaka			15			山地 Mountainous area			100			11			1		10		—
									瓯柑 Citrus suavissima Hort. ex Tanaka
	29			紫金街道开潭村 Kaitan Village, Zijin Street					椪柑 Citrus poonensis Hort. ex Tanaka			20			山地 Mountainous area			100			4			0		4		—
	30			紫金街道开潭村 Kaitan Village, Zijin Street					椪柑 Citrus poonensis Hort. ex Tanaka			20			山坡 Hill side			100			100			100		—		0

表5 柑橘黄龙病目测诊断病株与PCR检测阳性病株关系表 Table 5 Relationship between visual diagnosis of Citrus Huanglongbing and PCR-positive strains

	Figure Option View Download New Window
	图2 柑橘黄龙病人为目测诊断较PCR阳性检测准确程度表Fig.2 Comparison of accuracy of visual diagnosis and PCR-positive detection for Citrus Huanglongbing

3 讨论

田间采样检测结果和检验分析表明, 柑橘黄龙病阳性病株空间分布型为聚集分布, 其分布的基本成分为个体群, 个体间相互吸引, 个体群之间趋于聚集分布特征, 并且具有密度依赖性, 阳性病株密度越高越趋向聚集分布, 聚集强度随阳性率上升而增强。究其聚集原因, 在于当样方阳性病株密度在0.616 9(阳性率6.17%)以下时, λ < 2, 聚集是某些如气候条件、栽培管理、病虫防治等影响所致; 当样方阳性病株密度在0.616 9(阳性率6.17%)以上时, λ ≥ 2, 其聚集是病害本身聚集特性行为与环境条件等综合影响的结果。当前柑橘黄龙病发病流行逐年呈加重趋势, 主要原因在于粗放管理果园面积增大, 病菌病源扩散, 介体木虱种群数量多、带菌率高、传染机率上升, 以及气候条件如冬季气温上升促进等影响所致。

开展柑橘黄龙病病情监测预警防控时, 可通过初步调查估算出被调查果园黄龙病菌阳性密度后, 即通过查阅图1或直接将相关参数代入理论抽样数模型(N=1.962/D²[1.697 6/ $\overset{̅}{x}$ +0.929 6]), 来确定不同概率保证及误差条件下的最适抽样数。作为监测调查, 可对照理论抽样数表进行, 一般当橘区(橘园)阳性率5%时, 所需允许误差D=0.2的抽样数212株或允许误差D=0.3的抽样数94株; 当橘区(橘园)阳性率10%时, 所需抽样数D=0.2为129株或D=0.3为57株; 当橘区(橘园)阳性率20%时, 所需抽样数D=0.2为87株或D=0.3为39株; 当橘区(橘园)阳性率30%~50%时, 所需抽样数D=0.2为62~73株或D=0.3为28~33株。也可采用序贯抽样表进行序贯抽样。田间查定防治决策应采用序贯抽样, 即对照序贯抽样表进行查定, 当调查的累计阳性数量达到预定精密指标下的数量指标时停止调查, 累计阳性数量除以取样数, 即为平均密度。

由于柑橘黄龙病显症症状多样复杂, 本研究所采集的样本症状有斑驳黄化(23.15%)、缺素黄化(59.26%)、新梢均匀黄化和黄脉等(17.59%)显症疑似病株, 总体上除斑驳黄化与黄龙病的相关性较高外, 其他类型的症状均易产生一定的错误率, 视症目测诊断难度较大, 因此采集黄龙病相关性较高的样本理论上应该会有较高的检测准确率。通过视症目测诊断(E)与PCR测定(Q)病株比较, 两者存在极显著的线性关系, 其关系模型为E=1.066 2Q+9.626 4(r=0.835 8^{* *}), 由此可见, 为了提高病害诊断准确率和田间调查效率, 总体应采取实验检测和视症目测相结合, 若田间黄龙病发病率为20%以下, 则应采取PCR检测诊断调查; 若田间黄龙病发病率为30%以上, 则可采用视症目测调查。若采用视症目测诊断, 一般需在阳性抽样数量基础上增加15%~30%, 即可较准确反映阳性病株抽样数量和田间发生情况, 这对田间取样监测预警和决策防治具有良好的指导意义。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献

文献顺序

[1]	BOVE J M. Huanglongbing: a destructive, newly-emerging, century-old disease of citrus[J]. Journal of Plant Pathology, 2006, 88(1): 7-37. [本文引用:1]
[2]	GRAFTON-CARDWELL E E, STELINSKI L L, STANSLY P A. Biology and management of Asian citrus psyllid, vector of the huanglongbing pathogens[J]. Annual Review of Entomology, 2013, 58(1): 413-432. [本文引用:1]
[3]	GOTTWALD T R, DA GRAÇA J V, BASSANEZI R B. Citrus huanglongbing: the pathogen and its impact[J]. Plant Health Progress, 2007, 8(1): 31. [本文引用:1]
[4]	谢钟琛, 李健, 施清, 等. 福建省柑橘黄龙病危害及其流行规律研究[J]. 中国农业科学, 2009, 42(11): 3888-3897. XIE Z C, LI J, SHI Q, et al. Damage and epidemics of citrus huanglongbing in Fujian province[J]. Scientia Agricultura Sinica, 2009, 42(11): 3888-3897. (in Chinese with English abstract) [本文引用:2]
[5]	余继华, 汪恩国, 赵琳. 柑橘黄龙病空间分布型与抽样技术研究[J]. 植物检疫, 2010, 24(5): 31-34. YU J H, WANG E G, ZHAO L. Study on spatial distribution pattern and sampling technique of citrus huanglongbing in citrus orchards[J]. Plant Quarantine, 2010, 24(5): 31-34. (in Chinese with English abstract) [本文引用:1]
[6]	林雄杰, 范国成, 胡菡青, 等. 福建温州蜜柑表现典型“红鼻果”症状[J]. 福建果树, 2012(4): 26-27. LIN X J, FAN G C, HU H Q, et al. The typical symptoms of "red nose fruit" in Fujian Wenzhou tangerine[J]. Fujian Fruits, 2012(4): 26-27. (in Chinese) [本文引用:1]
[7]	唐铁京. 柑橘黄龙病诊断和防控策略探讨[J]. 中国热带农业, 2013(4): 40-41. TANG T J. Diagnosis and control strategy of Citrus Huanglong disease[J]. China Tropical Agriculture, 2013(4): 40-41. (in Chinese) [本文引用:1]
[8]	汪恩国, 李达林. 柑橘黄龙病疫情监测与防控技术研究[J]. 中国农学通报, 2012, 28(4): 278-282. WANG E G, LI D L. Study on monitoring and control technology of Citrus Huanglongbing in citrus orchards[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2012, 28(4): 278-282. (in Chinese with English abstract) [本文引用:1]
[9]	汪恩国, 钟列权, 明珂, 等. 柑橘黄龙病疫情运动规律与预警模型研究[J]. 浙江农业学报, 2014, 26(4): 994-998. WANG E G, ZHONG L Q, MING K, et al. Research on movement rule and early warning model of citrus huanglongbing[J]. Acta Agriculturae Zhejiangensis, 2014, 26(4): 994-998. (in Chinese with English abstract) [本文引用:1]
[10]	余继华, 汪恩国, 林云彪, 等. 早熟柑橘黄龙病空间格局参数特征及其应用[J]. 中国农学通报, 2011, 27(5): 351-355. YU J H, WANG E G, LIN Y B, et al. Characteristics of the parameters of spatial distribution pattern of citrus huanglongbing in premature citrus orchard and their application[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2011, 27(5): 351-355. (in Chinese with English abstract) [本文引用:1]
[11]	茹水江, 王汉荣, 王连平, 等. 西兰花菌核病空间分布格局及抽样技术研究[J]. 浙江农业学报, 2006, 18(2): 63-66. RU S j, WANG H r, Wang L p, et al. Spatial distribution pattern and sampling technique for fungal Sclerotinia disease in broccoli fields[J]. Acta Agriculturae Zhejiangensis, 2006, 18(2): 63-66. (in Chinese with English abstract) [本文引用:1]
[12]	孟幼青, 赵琳, 林云彪, 等. 应用PCR检测柑橘黄龙病采样方法研究初报[J]. 中国南方果树, 2006, 35(4): 20-21. MENG Y Q, ZHAO L, LIN Y B, et al. Preliminary Study on Detection of Citrus Huanglongbing by PCR[J]. South China Fruits, 2006, 35(4): 20-21. (in Chinese with English abstract) [本文引用:1]

2006

0.0

... )细菌引起的,目前广泛分布在亚洲、非洲、美洲等近50个国家和地区,对柑橘产业具有毁灭性危害,自然条件下主要通过携带病菌的柑橘木虱取食传播,其症状表现较为复杂多样^[1,2,3,4] ...

2013

0.0

2007

0.0

2009

0.0

谢钟琛, 李健, 施清, 等. 福建省柑橘黄龙病危害及其流行规律研究[J]. 中国农业科学, 2009, 42(11): 3888-3897.

XIE Z

, LI

, SHI

, et al. Damage and epidemics of citrus huanglongbing in Fujian province[J]. Scientia Agricultura Sinica, 2009, 42(11): 3888-3897. (in Chinese with English abstract)

【Objective】 To effectively control citrus huanglongbing (HLB, yellow shoot disease), the distribution, damage and epidemics of the disease were investigated in Fujian Province. 【Method】 The distribution of “Candidatus Liberibacter asiaticus”, the putative pathogen, the Asian citrus psyllid (Diaphorina citri), the insect vectors, and the incidence of HLB were investigated in 245 citrus-producing towns in 48 counties in Fujian Province. Polymerase chain reaction (PCR）assay was carried out to verify the existence of HLB in the collected blotchy mottle leaves and color inversion fruits to analyze the epidemics of HLB. Sliding correlation analysis was applied to select climatic factors associated with HLB occurrence. 【Result】 HLB and D. citri could be observed in all citrus-producing towns and all counties in Fujian with the northern limit of N28°07′ and the altitude of 880 m. The average incidence rate of HLB was 16.59% in Fujian. Significant difference in incidence rate was observed in different varieties with an increasing order of pummelo, sweet orange, mandarin (Citrus reticulata Blanco.) The incidence of HLB was negatively correlated with latitude, altitude, slope of orchard. The field incidence was only related to the climate of the last 2 springs in Changtai county (N24°7′) in subtropical zone, with a positive correlation with the sunshine in spring flush period and a negative correlation with the humidity in young fruit period. Therefore, drought in spring could be related to the epidemic of HLB. The color inversion fruits and blotchy mottle leaves are the typical characteristics of HLB, in which “Candidatus Liberibacter asiaticus” were detected in 93.8% and 73.1% of the samples by Nested-PCR, respectively. The reliability of the former is higher than the latter. 【Conclusion】“Candidatus Liberibacter asiaticus”and D. citri could be observed in all citrus-producing areas in Fujian. The outbreak of HLB could occur in severe drought areas in spring. The color inversion fruit could be used to diagnose HLB in fields.

（福建省农业厅果树站）

【目的】全面了解柑橘黄龙病（Citrus Huanglongbing,简称HLB）在福建省的危害分布及其流行情况,有效指导HLB的防控。【方法】对全省48个县（市、区）及245个柑橘主产乡镇HLB虫媒柑橘木虱（Diaphorina citri）分布及HLB的危害进行调查,以PCR（polymerase chain reaction,PCR）方法对采集的斑驳黄化柑橘叶片、红鼻果进行确证性检测,分析HLB的危害流行规律,并应用滑动相关分析筛选影响HLB流行的气象要素。【结果】全省各县及柑橘主产乡镇均可查到柑橘木虱和HLB病株（最北N28°07′、海拔最高880 m）,HLB危害程度为平均发病率16.59%,主栽品种间感病性差异显著,排序为宽皮桔＞甜橙类＞柚类;HLB发病率与果园纬度、海拔、坡度呈显著负相关;在南亚热带气候区的长泰县（N24°07′）,HLB田间发病率仅与临近2年春季气候有关,推测HLB潜伏期为6～18个月,同时春梢期日照、幼果期湿度与HLB发病率呈极显著正、负相关,“春旱”为HLB流行性气候;柑橘红鼻果、斑驳黄化叶片的HLB病原Nested-PCR检出率分别为93.8％、73.1％,前者可靠性优于后者,二类症状均可视为HLB的典型症状。【结论】福建境内的柑橘产区均有HLB病原与柑橘木虱的分布。若春季遇严重干旱HLB就有局部爆发的可能。柑橘红鼻果可作HLB田间诊断依据。

... 田间目测调查常常产生误诊和漏诊现象,同时由于柑橘植株从感病到显症具有较长潜伏期^[4],无法涉及田间潜伏隐症病株,依#cod#x0201c ...

2010

0.0

... 测定柑橘黄龙病空间分布信息也常存较大误差,PCR分子检测可有效解决田间误诊和隐症病株遗漏问题,目前应用柑橘黄龙病菌PCR分子技术开展果园病株空间分布型和抽样技术的研究尚属鲜见^{[5,6,7,8,9,10,11]} ...

2012

0.0

2013

0.0

2012

0.0

2014

0.0

汪恩国, 钟列权, 明珂, 等. 柑橘黄龙病疫情运动规律与预警模型研究[J]. 浙江农业学报, 2014, 26(4): 994-998.

WANG E

, ZHONG L

, MING

, et al. Research on movement rule and early warning model of citrus huanglongbing[J]. Acta Agriculturae Zhejiangensis, 2014, 26(4): 994-998. (in Chinese with English abstract)

In order to reveal the pattern of invasion and epidemic diffusion of citrus huanglongbing (HLB)， population dynamics of diaphorina citri were systematically monitored at several constant sites， and disease general surveys were conducted as well from 2002 to 2010. The results showed HLB in south and east were more serious than that in north and west respectively during invasion period， while disease spread from south to north with a spire upward trend year by year during diffusion period. A longterm movement cycle of HLB containing invasion， rise， highorder， and decline lasted for 10 years approximately， followed by a epidemic trajectory model: P =-00044N2+0056N -00698 (n =9， r =09552**， r001=07977). An early warning could be issued based on the model when weighted incidence of HLB exceeded 1% in next year.

1Plant Protection Station of Linhai City， Linhai Zhejiang 317000， China; 2Plant Protection and Quarantine Station of Taizhou City， Jiaojiang Zhejiang 318000， China; 3Comprehensive service center of Yongquan town in Linhai City， Linhai Zhejiang 317000，China

为了揭示柑橘黄龙病整体疫情入侵、扩散、流行等运动规律，对柑橘木虱种群的数量消长情况进行多年多点的系统监测，同时在柑橘黄龙病果实显症期采用全境式普查方法开展疫情调查。2002—2010年连续8年的监测和普查结果表明，柑橘黄龙病疫情入侵分布呈南重北轻、东高西低的特征，其扩散趋势为自南而北逐年推进，并呈螺旋式上升。疫情长期运动一般需经历入侵上升、高位运行、受控回落周期性变化，其运动周期为10年左右，并建立时序运动模型: P=-00044N2+0056N －00698(n=9，r=09552**，r001=07977)。应用上述模型进行逐年修补，若预测下年度果园加权发病率在1%以上，则可发布预警。

2011

0.0

2006

0.0

2006

0.0

... 2 调查采样方法2017年12月至2018年1月,根据调查县(市、区)柑橘种植情况和柑橘黄龙病发生情况,每县(市、区)选定柑橘果园面积33 hm²左右作为1个调查样地,每样地选择4~5个连片果园,每果园调查100株,先逐株采用目测调查斑驳黄化、新梢均匀黄化、黄脉和缺素黄化等显症疑似病株^[12],然后1株采1样,按树冠东南西北中5方位采集当年抽生的春梢叶片(有以上症状的则取其症状叶)各1张,5张组合为1样,并依序进行采样编号,然后室内测定柑橘黄龙病菌阳性或阴性 ...