引用本文
张博伟, 王海静, 宋茂勇, 谢慧君, 张建. 四溴双酚A对土壤无机氮转化的影响及其微生物学机理初探[J]. 浙江农业学报, 2019,31(4): 639-645.
ZHANG Bowei, WANG Haijing, SONG Maoyong, XIE Huijun, ZHANG Jian. Effect of tetrabromobisphenol A on inorganic nitrogen transformation in soil and its possible microbiological mechanism[J]. ACTA AGRICULTURAE ZHEJIANGENSIS, 2019,31(4): 639-645.  
Doi: 10.3969/j.issn.1004-1524.2019.04.17
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四溴双酚A对土壤无机氮转化的影响及其微生物学机理初探
张博伟1, 王海静2, 宋茂勇3, 谢慧君1,*, 张建2
1.山东大学 环境研究院,山东 济南 250100
2.山东大学 环境科学与工程学院,山东 济南 250100
3.中国科学院 生态环境研究中心,北京 100085
*通信作者,谢慧君,E-mail: xiehuij@sdu.edu.cn

作者简介:张博伟(1995—),男,吉林敦化人,硕士研究生,主要研究方向为土壤微生物和污染修复。E-mail: zbwzwwz@126.com

收稿日期: 2018-09-21
基金资助: 中国科学院战略重点研究项目(XB14010300); 微生物技术国家重点实验室开放课题(M2015-07)
摘要

四溴双酚A(TBBPA)作为一种新型污染物,一旦进入土壤并在土壤中积聚,将会影响土壤物质循环及相关微生物活性。在实验室模拟条件下,研究了不同浓度(4~40 mg·kg-1)TBBPA对土壤中铵态氮($NH^{+}_{4}-N$)、亚硝态氮($NO^{-}_{2}-N$)和硝态氮($NO^{-}_{3}-N$)转化的影响,利用高通量测序测定了TBBPA对无机氮转化菌群结构的变化,并推测其可能影响的代谢途径。结果表明,40 mg·kg-1的TBBPA对土壤无机氮循环有显著( P<0.05)影响,其在好氧条件下增加了硝化和反硝化菌的丰度,促进了$NH^{+}_{4}-N$和$NO^{-}_{3}-N$的转化,在厌氧条件下反硝化细菌数量减少,抑制了$NO^{-}_{3}-N$的转化。40 mg·kg-1 TBBPA不论是在厌氧还是好氧条件下,都增加了土壤中变形菌门(Proteobacteria)的丰度,降低了绿弯菌门(Chloroflexi)和放线菌门(Actinobacteria)的丰度。通过预测氮转化基因功能看出, 40 mg·kg-1 TBBPA处理在好氧条件下通过增强 narG和 nirK基因的表达有助于提高$NO^{-}_{3}-N$的转化,在厌氧条件下通过限制 nasB的表达会抑制$NO^{-}_{3}-N$的转化。

关键词: 土壤微生物; 无机氮转化; 高通量测序; 四溴双酚A
中图分类号:S154.2;X172 文献标志码:A 文章编号:1004-1524(2019)04-0639-07
Effect of tetrabromobisphenol A on inorganic nitrogen transformation in soil and its possible microbiological mechanism
ZHANG Bowei1, WANG Haijing2, SONG Maoyong3, XIE Huijun1,*, ZHANG Jian2
1. Environment Research Institute, Shandong University, Jinan 250100, China
2. School of Environmental Science and Engineering, Shandong University, Jinan 250100, China
3. Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China
Abstract

As one of the emerging contaminants, tetrabromobisphenol A (TBBPA) could accumulate in the soil and affect soil materials cycling as well as soil microbes. TBBPAs with different concentrations (4-40 mg·kg-1) were added in soil to investigate their effects on $NH^{+}_{4}-N$, $NO^{-}_{2}-N$ and $NO^{-}_{3}-N$ transformation in lab. The bacterial community structures, as well as the prediction of the functions related to inorganic nitrogen transformation influenced by TBBPA, were analyzed with Illumina sequencing. It was shown that 40 mg·kg-1 TBBPA had a significant ( P<0.05) effect on soil inorganic nitrogen transformation. Addition of 40 mg·kg-1 TBBPA increased the abundance of nitrifying bacteria and denitrifying bacteria and promoted $NH^{+}_{4}-N$ and $NO^{-}_{3}-N$ transformation in the aerobic condition, while decreased the abundance of denitrifying bacteria and inhibited $NO^{-}_{3}-N$ transformation in anaerobic condition. In addition, 40 mg·kg-1 TBBPA also had remarkable effect on microbial community structure, including a positive effect on the relative abundances of Proteobacteria and a negative effect on the relative abundances of Chloroflexi and Actinobacteria. By predicting the microbial functions related to nitrogen transformation, it could be inferred that 40 mg·kg-1 TBBPA induced the expression of narG and nirK and promoted N$NO^{-}_{3}-N$ transformation in the aerobic condition, yet reduced the expression of nasB and inhibited $NO^{-}_{3}-N$ transformation in anaerobic condition.

Keyword: soil microbes; inorganic nitrogen transformation; high-throughput sequencing; tetrabromobisphenol A

四溴双酚A(TBBPA)是一种溴系阻燃剂, 广泛应用于印刷电路板、电子产品、塑料、纺织等工业产品中[1]。随着TBBPA的广泛应用, 目前它已经成为全球范围内的新兴污染物之一。TBBPA在环境中可以长期存在, 并能长距离迁移[2], 在不同环境中均有检出[3, 4]。由于它和甲状腺激素具有相似的化学结构, 很容易与甲状腺激素运载蛋白结合, 因此也被视作一种潜在的内分泌干扰物[5], 一旦随生物链进入人体, 会造成人体正常代谢活动的紊乱。TBBPA具有亲脂性和疏水性, 一旦进入环境, 最终会积聚到土壤中。Xu等[6]检测到北京农田土壤中TBBPA浓度为0~5.6 μ g· kg-1, 电子废物回收地区土壤中TBBPA浓度高达26~104 μ g· kg-1; 研究人员在以色列的一个污染场地的表层土壤中, 检测到TBBPA的最高浓度达450 mg· k g-1[7]。

土壤微生物是土壤的重要组成部分, 在土壤物质循环中发挥重要作用[8]。氮元素是土壤中重要的养分元素之一[9]。土壤生态系统主要依靠氮转化, 如硝化、反硝化、厌氧氨氧化, 来维持土壤生产力和土壤微生物活性。土壤中的微生物硝化、反硝化、厌氧氨氧化过程, 主要以微生物酶的活性决定反应的转化速率[10]。有研究表明, As、Be、Br、Cd、Cr、Pb、Hg等重金属, 对土壤硝化均有不同程度的抑制作用[11]。当有机污染物菲的浓度达到250 mg· kg-1时同样也能抑制土壤硝化作用[10]。虽然土壤微生物在厌氧或者好氧条件下对TBBPA均有一定的降解作用[12, 13], 但当TBBPA进入土壤后, 是否会对土壤中无机氮循环相关的微生物群落结构和功能造成一定影响, 从而影响土壤物质循环, 尤其是无机氮循环, 在本研究范围内检索还未见报道。

为此, 在实验室条件下分别构建厌氧和好氧环境, 研究不同浓度(4、10、20、40 mg· kg-1)TBBPA对土壤中N H4+-N、N O2--N和N O3--N转化的影响, 同时, 利用Illumina高通量测序分析不同处理对微生物群落结构的影响, 并预测其对无机氮转化相关功能基因的影响。

1 材料与方法
1.1 土壤样品采集和微生物分析

实验土壤选取山东省济南市百花公园(117.07° E, 36.68° N)的表层土壤(0— 20 cm), 设置3个5 m× 10 m的样方, 用直径7 cm的螺旋钻随机取10份样品, 将取得的样品充分混合, 去除土壤中的植物残渣、树枝残骸和大块石头。处理好的土壤样品置于阴凉处风干后过10目筛(2 mm)。将过筛土壤样品的含水率调节为土壤干重的40%, 放在托盘中用保鲜膜包好, 放进28 ° C恒温培养箱中避光孵化7 d, 以增强土壤中微生物的活性。测得土样pH值为8.0, 总氮(TN)含量为169 mg· kg-1, 总碳(TC)含量为2.43 g· kg-1, 阳离子交换量(CEC)为21.03 cmol· kg-1。

实验共设置4个TBBPA浓度(4、10、20、40 mg· kg-1)的污染土壤作为实验组, 以不添加TBBPA的土壤样品作为空白组。配制实验组土壤时, 首先将TBBPA溶解到甲醇中, 配制不同浓度的TBBPA母液, 然后按其所需添加量加入土壤中, 搅拌均匀后在通风橱放置30 min, 以保证甲醇溶剂挥发完全[14]。所有实验组和空白组均添加相同体积的甲醇。将溶剂挥发后的土壤分成30份, 每份200 g, 加入500 mL的锥形瓶中。

为了更好地了解不同氧气环境下TBBPA对土壤无机氮循环微生物的影响, 将每个TBBPA浓度处理平均分为厌氧组和好氧组。好氧组分别命名为A-4、A-10、A-20、A-40, 厌氧组分别命名为AN-4、AN-10、AN-20和AN-40。此外, 好氧组和厌氧组各设一个空白对照, 分别命名为A-CK和AN-CK。好氧组使用棉花塞封口, 厌氧组通入氮气后用橡胶塞封口。将30个锥形瓶置于恒温培养箱中, 28 ° C条件下培养45 d。

1.2 土壤样品中铵态氮、亚硝态氮和硝态氮的测定

称取培养45 d后干燥的20.0 g土壤样品于聚乙烯瓶中, 加入200 mL 1 mol· L-1的KCl溶液, 放在(20± 2) ° C的恒温振荡器中150 r· min-1振荡1 h。转移提取液于离心管中, 3 000 r· min-1离心10 min, 然后将上清液转移至比色管中待测。N H4+-N、N O2--N和N O3--N含量的测定参照HJ 634— 2012中方法进行。

1.3 土壤样品DNA提取及高通量测序

取培养45 d后干燥的土壤0.3 g, 使用PowerSoil® DNA Isolation kit DNA(MOBIO)试剂盒提取土壤中微生物的DNA。DNA的纯度和浓度利用Nanodrops ND-1000 紫外分光光度计检测, 合格的DNA样品保存在-20 ℃冰箱内。采用Illumina高通量测序检测TBBPA对无机氮循环相关微生物群落结构的影响。每个样品做3个平行。选择F338和R806引物, 对微生物的16S rRNA基因中V3~V4段进行扩增, 并利用Illumina MiSeq测序仪器对16S rRNA基因的扩增子进行250 bp的末端测序, 测序后的数据处理方法如Kang等[15]所述。

1.4 数据分析

对不同处理下的土壤无机氮含量数据采用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析, 对有显著差异(P< 0.05)的处理做最小显著差异性检验。利用Origin 9.1软件绘图。

高通量数据经过筛选后, 使用PICRUSt标准化16S rRNA的拷贝数, 并根据KEGG通路数据库预测微生物群组的功能[16], 然后筛选出与氮转化相关的功能基因, 包括参与硝化、反硝化、厌氧氨氧化过程的功能基因。

2 结果与分析
2.1 不同浓度TBBPA对于土壤无机氮循环的影响

如表1所示, 在好氧和厌氧条件下, 当TBBPA浓度为4、10、20 mg· kg-1时, 土壤N H4+-N、N O2--N和N O3--N浓度与对照(A-CK、AN-CK)并没有显著差异。然而, 当TBBPA浓度升高至40 mg· kg-1时, 其对土壤N H4+-N、N O2--N和N O3--N含量表现出不同的作用效果:40 mg· kg-1 TBBPA在厌氧和好氧条件下对土壤N O2--N浓度均没有显著影响; 好氧条件下, 40 mg· kg-1 TBBPA可以提高N H4+-N的转化, N H4+-N浓度较A-CK显著(P< 0.05)下降, 说明好氧条件下土壤中的硝化作用增强, 加快了N H4+-N的转化降解, 但在厌氧条件下土壤N H4+-N浓度没有显著差别; 在好氧条件下, 40 mg· kg-1 TBBPA同样促进了土壤N O3--N的转化, N O3--N浓度显著(P< 0.05)下降, 然而在厌氧条件下, 40 mg· kg-1 TBBPA却抑制了N O3--N的转化, N O3--N浓度显著(P< 0.05)上升。这说明, 40 mg· kg-1 TBBPA处理在好氧条件下促进了土壤中N H4+-N和N O3--N的转化, 而在厌氧条件下抑制了N O3--N的转化。

表1 好氧和厌氧条件下不同浓度TBBPA对土壤无机氮的影响 Table 1 Effect of different concentrations of TBBPA on inorganic nitrogen in aerobic or anaerobic conditions
2.2 40 mg· kg-1 TBBPA对土壤微生物群落结构的影响

微生物硝化、反硝化、厌氧氨氧化是土壤中无机氮循环最重要的转化过程, 这些过程主要受土壤微生物相关代谢活动的调控[17]。如2.1节结果所示, 在本实验条件下, 只有当TBBPA浓度为40 mg· kg-1时才对土壤无机氮循环有显著影响, 因此仅在该浓度下分别针对好氧和厌氧条件下无机氮循环相关微生物的丰度进行分析, 结果如表2所示。总的来说, 不同处理条件下的土壤群落结构相似, 在所有测试样品中, 变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)是丰度最高的5大门类。区别在于, 在40 mg· kg-1 TBBPA处理下, 无论好氧还是厌氧条件, 变形菌门的丰度都增大, 而绿弯菌门和放线菌门的丰度都降低。

表2 不同条件下土壤微生物群落结构门水平的组成 Table 2 Taxonomic classification of soil microorganism on different conditions at phylum level %

为进一步掌握不同条件下土壤氮转化功能微生物的丰度变化, 就其中与氮转化相关的硝化、反硝化和厌氧氨氧化细菌在属水平上的相对丰度进行分析, 其中, 由于参与厌氧氨氧化功能的微生物丰度过低(< 0.001%), 因此本文只讨论硝化与反硝化过程, 结果如表3、表4所示。好氧条件下, 当TBBPA浓度为40 mg· kg-1时, 硝化菌和反硝化菌的相对丰度较A-CK明显提高, 这有助于解释表1中40 mg· kg-1 TBBPA处理下土壤中N H4+-N和N O3--N转化增强的现象。在厌氧条件下, 当TBBPA浓度为40 mg· kg-1时, 硝化菌和反硝化菌的相对丰度较AN-CK分别从4.38%提高至4.57%和从5.09%降低至4.76%, 虽然硝化菌的丰度略有提升, 但总体增加并不明显, 而反硝化菌丰度的降低却可能会造成厌氧过程中N O3--N的转化受抑制。

表3 不同条件下土壤硝化细菌在属水平的群落组成 Table 3 Taxonomic classification of soil nitrobacteria on different conditions at genus level %
表4 不同条件下土壤反硝化细菌在属水平的群落组成 Table 4 Taxonomic classification of soil denitrobacteria on different conditions at genus level %

陈文晶等[18]研究发现, 邻苯二甲酸酯的存在会影响土壤中转化酶和脲酶的活性, 从而抑制土壤氮循环。据本实验结果推测, TBBPA的存在同样可能会影响土壤中其他关键性酶的活性, 从而影响土壤中N O3--N的转化。Liu等[19]对TBBPA降解转化进行综述发现, 在好氧条件下TBBPA的半衰期只有5.3~7.7 d, 而且降解矿化率较高。这说明TBBPA在好氧条件下更易发生降解, 从而降低其对土壤中微生物的抑制作用。上述结果有助于解释本实验中有氧和厌氧条件下40 mg· kg-1 TBBPA对土壤中氮转化的不同作用效果。

2.3 40 mg· kg-1 TBBPA对无机氮循环的影响机制

近年来, 根据高通量测序结果来推测微生物功能得到了广泛应用[20]。为了更好地说明40 mg· kg-1 TBBPA对无机氮转化途径的影响, 利用PICRUSt软件预估了无机氮转化过程中的基因变化。图1展示了对照组(A-CK、AN-CK)和40 mg· kg-1 TBBPA处理条件下厌氧和好氧组内所有有显著性差异(P< 0.05)的无机氮转化相关基因。好氧条件下, A-CK和A-40组有6个氮相关基因都显示出了显著差异。TBBPA暴露使得其中2种功能基因, 即亚硝酸盐还原酶K00368(nirK)和硝酸盐还原酶K00370(narG)的表达被诱导, 另外4个基因, 即参与硝酸盐还原的K00360(nasB)、K00371(narH)和K02567(napA)及氧化亚氮还原酶K00376(nosZ)的表达受到抑制。厌氧条件下, 硝酸盐还原酶K00360(nasB)的表达同好氧条件下一样受到抑制, 而亚硝氮还原酶K00363(nirD)和一氧化氮还原酶K04561(norB)的表达则受到诱导。

图1 好氧(a)和厌氧(b)条件下40 mg· kg-1 TBBPA对土壤无机氮循环相关基因的作用Fig.1 Effect of 40 mg· kg-1 TBBPA on functional genes related to inorganic nitrogen transformation in aerobic (a) or anaerobic (b) conditions

基于好氧和厌氧条件下得到的基因作用效果, 根据KEGG数据库进行代谢通路研究, 绘制TBBPA对无机氮循环可能的作用效果, 如图2所示。可以看出, 40 mg· kg-1 TBBPA在好氧条件下对narG和nirK基因的促进作用决定了好氧条件下N O3--N转化效率的提高, 在厌氧条件下通过对nasB基因的抑制影响了土壤中N O3--N的进一步转化。这一分析可以初步验证前文的结论。但是, 其他环境因素和基因结构也可能在其他方面影响土壤无机氮循环, 这些因素仍有待于在今后做进一步研究。

图2 TBBPA对土壤无机氮循环途径的可能影响Fig.2 Possible effect of TBBPA on soil inorganic nitrogen transformation pathway

3 结论

在实验室模拟条件下, 向土壤中添加不同浓度的TBBPA, 考查其对土壤无机氮转化的影响及其可能作用途径。结果显示, 40 mg· kg-1 TBBPA对土壤无机氮转化有显著影响。当TBBPA浓度为40 mg· kg-1时, N H4+-N和N O3--N的转化在好氧条件下受到促进, N O3--N的转化在厌氧条件下受到抑制。当TBBPA浓度为40 mg· kg-1时, 无论是好氧还是厌氧条件下, 土壤微生物群落结构中的变形菌门(Proteobacteria)的丰度都增大, 而绿弯菌门(Chloroflexi)和放线菌门(Actinobacteria)的丰度都降低。根据实验结果, 推测好氧条件下40 mg· kg-1 TBBPA处理促进了narG和nirK基因的表达, 提高了N O3--N的转化效率; 厌氧条件下nasB基因表达受到抑制, 因而限制了N O3--N的转化。

The authors have declared that no competing interests exist.

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