引用本文
徐小钦, 杜雪, 李国勤, 张龙, 陶争荣, 卢立志. 白羽王鸽卵清蛋白关联蛋白Y基因( OVALY)克隆与生物信息学分析 [J]. 浙江农业学报, 2019,31(5): 704-708.
XU Xiaoqin, DU Xue, LI Guoqin, ZHANG Long, TAO Zhengrong, LU Lizhi. Molecular cloning and bioinformatics analysis of white king pigeon ( Columba livia) ovalbumin-related protein Y gene [J]. ACTA AGRICULTURAE ZHEJIANGENSIS, 2019,31(5): 704-708.
  
Doi: 10.3969/j.issn.1004-1524.2019.05.04
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白羽王鸽卵清蛋白关联蛋白Y基因( OVALY)克隆与生物信息学分析
徐小钦1,2,3, 杜雪1, 李国勤1,4, 张龙2, 陶争荣1, 卢立志1,4,*
1.浙江省农业科学院 畜牧兽医研究所,浙江 杭州310021
2.西华师范大学 生态研究院,四川 南充637000
3.南京农业大学 动物科技学院,江苏 南京 210095
4.农业农村部农产品信息溯源重点实验室,浙江 杭州 310021
*通信作者,卢立志,E-mail: lulizhibox@163.com

作者简介:徐小钦(1988—),女,四川南充人,博士,研究方向为动物遗传育种。E-mail: xuxiaoqin21@126.com

收稿日期: 2018-09-28
基金资助: 浙江省农业(畜禽)新品种选育重大科技专项(2016C02054-16);浙江省农业科学院地方科技合作项目(WZ2017002)
摘要

旨在获得白羽王鸽( Columba livia)卵清蛋白关联蛋白Y基因( OVALY)的cDNA序列,并进行生物信息分析。研究结果显示: OVALY基因cDNA全长为2 068 bp,其中5'非编码区序列180 bp,3'非编码区序列720 bp,开放阅读框1 164 bp,编码的蛋白分子量约44.19 ku,含氨基酸残基388个(GenBank∶KX230792);与NCBI数据库中朱鹮( Nipponianippon) OVALY基因序列同源性最高(81%),与白尾鹰( Haliaeetusalbicilla)和沙鸡( Pteroclesgutturalis) OVALY基因序列的同源性分别为80%和79%。经潜在糖基化位点和磷酸化位点预测分析发现,OVALY蛋白结构中潜在糖基化位点和磷酸化位点分别为4个和22个;经CDD(conserved domain database)数据库分析发现,OVALY蛋白具有丝氨酸蛋白酶抑制剂家族的反应中心区域,属于丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族。

关键词: 白羽王鸽; 卵清蛋白关联蛋白Y( OVALY); RACE
中图分类号:S813.3 文献标志码:A 文章编号:1004-1524(2019)05-0704-05
Molecular cloning and bioinformatics analysis of white king pigeon ( Columba livia) ovalbumin-related protein Y gene
XU Xiaoqin1,2,3, DU Xue1, LI Guoqin1,4, ZHANG Long2, TAO Zhengrong1, LU Lizhi1,4,*
1. Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021, China
2. Institute of Ecology, China West Normal University, Nanchong 637000, China
3. College of Animal Sciences & Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China;
4.Key Laboratory of Information Traceability for Agricultural Products, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Hangzhou 310021,China
Abstract

The experiment was conducted to clone the whole cDNA of OVALY gene in Columba liviaand analyze the bioinformatic information of the cDNA sequence.The nucleotide sequence of a full-length 2 068 bp cDNA for OVALY was obtained, containing 5'UTR (180 bp), CDS (1 164 bp) and 3'UTR (720 bp), and coding 388 amino acids (44.19 ku, GenBank accession number: KX230792). The OVALY cDNA sequence of white king pigeon was most similar to Nipponianippon, and the homology was 81%. This sequence was also similar to Haliaeetusalbicilla and Pteroclesgutturalis, and the homologies were 80% and 79%, respectively. 4 N-glycosylated sites and 22 phosphorylation sites were detected in these amino acids. Conserved domain analysis of OVALY protein showed this protein had a conserved domain for serpin superfamily.

Keyword: Columba livia; OVALY; RACE

OVALY(ovalbumin-related protein Y)是蛋清中一种常见蛋白, 在鸡蛋清中含量很少[1, 2], 但在鸽蛋清中却是最主要的蛋白[3]。Gué rin-Dubiard等[4]于2005年采用高通量基因组测序的方式, 获得了鸡的OVALY基因碱基序列, 同时发现该基因存在两种基因亚型。2006年Gué rin-Dubiard等[5]运用双向凝胶电泳技术分离鉴定了鸡OVALY蛋白, 其分子量大小为53 ku。通过软件预测该蛋白分子量为55 ku, 包含21个磷酸化位点和4个N-链接的糖基化位点, 造成此种差异的原因尚未知晓。虽然该蛋白在蛋清中含量少, 但有研究表明在鸡受精卵孵化第7天的卵清中含量迅速增加, 因此推测其可能参与了鸡胚胎发育调控, 具体机制尚不明了[6]。2017年Ren等[3]对鸽蛋清蛋白进行分离, 利用MALDI-TOF-MS技术进行鉴定, 发现OVALY蛋白为鸽蛋清中最主要的蛋白。但关于鸽子OVALY基因及其对应的蛋白的报道鲜有所闻。岩鸽OVALY基因预测序列于2015年已经发布, 但其确切序列尚未获得。

为了研究鸽蛋清中最主要蛋白OVALY的编码基因, 本试验运用RACE技术获得白羽王鸽OVALY基因全部的cDNA序列, 并利用生物信息学数据库和相关软件进行分析, 预测其功能结构。

1 材料与方法
1.1 试验材料

白羽王鸽输卵管膨大部组织样本采集自平阳县鳌峰鸽业有限公司, 保存于液氮中。

1.2 试验方法

1.2.1 输卵管膨大部中总RNA提取

将适量样本置于盛有液氮的研钵中, 迅速研磨直至粉末状, 加入Trizol试剂, 按照使用说明书进行实验操作, 提取输卵管膨大部总RNA。

1.2.2 反转录

反转录实验试剂采用TransScript First-strand cDNA Synthesis SuperMix(TaKaRa, 大连)试剂盒。严格按照试剂盒的使用说明书进行操作。

1.2.3 OVALY基因克隆

根据岩鸽OVALY(GenBank∶ XM_005509738.1)基因的预测序列, 设计扩增该基因部分片段引物OVALY-F和OVALY-R, 根据获得的OVALY部分片段序列分别设计3'和5'RACE引物, 分别为OVALY-3-GSP1、OVALY-5-GSP1和OVALY-5-GSP2(表1)。引物合成由上海英骏生物技术有限公司完成。

表1 OVALY基因引物序列 Table 1 Sequence information of OVALY primers

根据SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit试剂盒(TaKaRa, 大连)说明书步骤扩增5'-UTR和3'-UTR区域; 严格按照pEASY T1 cloning kit试剂盒(TransGen Biotech, 北京)使用说明书进行克隆, 并将获得的产物进行测序[7]。

1.2.4 蛋白质序列分析

利用NCBI的Blast功能进行氨基酸同源性比对。用在线工具ExPASy-PROSITE和ExPASy-ProtParam(http://www.expasy.org)预测蛋白质的基本理化性质。利用SWISSMODEL软件(http://swissmodel.expasy.org)选择同源建模法构建OlCtpE蛋白的三级结构。用NetNGlyc 1.0预测糖基化位点, 用SignalP 4.1预测信号肽。

2 结果与分析
2.1 OVALY基因克隆

白羽王鸽OVALY基因cDNA全长为2 068 bp, 其中5'非编码序列为180 bp, 3'非编码序列为720 bp, 开放阅读框为1 164 bp; 编码的蛋白分子量约44.19 ku, 含氨基酸残基388个(GenBank∶ KX230792)。

2.2 与其他物种氨基酸序列比对

通过NCBI中Blast功能, 将白羽王鸽的OVALY预测氨基酸序列与其他鸟类的该基因进行比对。发现与朱鹮(Nipponianippon)同源性最高(81%); 与白尾鹰(Haliaeetusalbicilla)、沙鸡(Pteroclesgutturalis)、鸭(Anasplatyrhynchos)、鸡(Gallus)、鹌鹑(Coturnix japonica)的同源性分别为80%、79%、69%、65%、66%。采用N-J的方法构建蛋白质系统发育树, 结果见图1。

图1 系统发育树(N-J)Fig.1 Phylogenetic tree with branch length (N-J)

2.3 氨基酸构成及性质预测

利用ExPASy-ProtParam在线软件预测OVALY蛋白的氨基酸构成及性质。该蛋白分子量约44.19 ku, 氨基酸序列中谷氨酸(Glu)和赖氨酸(Lys)的使用频率最高, 分别为10.80%和9.50%, 色氨酸(Trp)使用频率最低(0.8%), 其他氨基酸的使用频率见表2。理论等电点约为5.09, 其中正电荷氨基酸残基49个, 负电荷氨基酸残基63个; 蛋白质氨基酸残基亲疏水性约为-0.315, 脂溶性指数约为85.67, 不稳定系数约为38.00, 体外半衰期约为30 h。说明该蛋白为亲脂的碱性蛋白, 且在体内稳定存在[8, 9]。

表2 鸽OVALY氨基酸组成 Table 2 Composition of amino acid of OVALY in pigeon
2.4 高级结构预测

通过PSIPRED预测了白羽王鸽OVALY蛋白的二级结构。该蛋白含有10个α 螺旋和14个β 折叠, 由无规则卷曲连接。利用SWISS-MODEL预测鸽OVALY蛋白的三级结构。3D结构模型如图2所示。

图2 鸽OVALY蛋白的3D结构图Fig.2 Tertiary structure of pigeon OVALY protein

2.5 糖基化和磷酸化位点预测

利用NetNGlyc 1.0 Server在线软件预测OVALY蛋白序列中Asn-Xaa-Ser/Thr三肽概率大于50%的N-连接糖基化位点, 共发现了4个, 分别位于62、95、215和374处; 利用NetOGlyc 3.1 Server在线软件未发现概率大于50%的O-GalNAc连接糖基化位点。利用NetPhoQ2.0server在线软件预测概率大于50%的磷酸化位点, 共发现了22个, 其中丝氨酸(Ser)15个, 分别位于34、52、83、97、99、148、200、261、308、314、318、321、345、355和356处; 酪氨酸(Tyr)5个, 分别位于16、79、107、235和385处; 苏氨酸(Thr)2个, 分别位于202和343处。

2.6 蛋白质结构域分析

通过CDD数据库对OVALY蛋白保守结构域进行分析, 发现该蛋白具有丝氨酸蛋白酶抑制剂反应中心结构域, 属于丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族成员(图3)。

图3 鸽OVALY蛋白的结构域分析Fig.3 Conserved domain analysis of pigeon OVALY

SignalP4.0在线软件分析, 在该蛋白中不具有信号肽区域; 利用TMHMM Server v. 2.0软件分析, 该蛋白不具有跨膜区域。因此, 该蛋白可能通过非经典分泌途径完成分泌。

3 讨论

基因翻译成氨基酸序列后, 主要以糖基化和磷酸化进行修饰, 在许多生物进程中具有重要作用。研究表明, 蛋白的糖基化参与蛋白质折叠、细胞识别、免疫反应等; 磷酸化在信号转导、基因表达、细胞周期调控中起到关键性作用[10, 11, 12, 13, 14]。具有免疫功能的蛋白大多都含有糖基化修饰位点, 在生物医学研究方面具有重要意义[15]。在白羽王鸽和鸡的OVALY蛋白中均含有4个N-连接糖基化位点, 磷酸化位点分别为22个和21个, 两个物种的该蛋白具有相似的翻译后修饰。蛋白质的翻译后修饰, 对蛋白质的结构和功能具有重要作用, 因此对被修饰的结构位点进行深入分析具有重要意义。

真核蛋白质分泌包括经典和非经典两种分泌途径。经典分泌途径是指内质网-高尔基体途径, 这种途径是大多数蛋白的分泌方式; 只有小部分无信号肤的蛋白质不依赖该途径, 就能从胞内运输到细胞外, 因此叫做非经典分泌蛋白。一般非经典分泌蛋白是相对分子量12~45 ku的小分子蛋白, 缺少潜在糖基化位点和信号肽等结构, 受温度、能量等影响较大[16]。本研究中白羽王鸽OVALY蛋白序列中不具有信号肽区域和跨膜结构, 且分子量大于12 ku, 小于45 ku, 因此推断该蛋白的分泌方式为蛋白质非经典分泌途径; 但是该蛋白又包含了4个潜在糖基化和22个潜在磷酸化位点, 故而其分泌方式有待进一步探讨[17]。

经蛋白质保守结构域分析发现, 鸽OVALY蛋白具有丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族(Serpin superfamily)特有的反应活性中心, 属于丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族成员。在鸡蛋中共发现了15种丝氨酸蛋白酶抑制剂, 而OVALY蛋白就是其一[18]。这些蛋白是鸡蛋结构的重要组成成分(蛋壳、蛋清、蛋黄、卵黄膜等), 其生理功能还需要深入研究[19]。有研究显示, 这些蛋白与哺乳动物的对应蛋白具有一定的同源性, 可能参与了细胞增殖、卵泡血管形成、禽类胚胎体外发育、蛋壳生物矿化等[20]。在鸡受精卵孵化过程中, OVALY含量变化显著, 推测可能是胚胎的胃肠道蛋白酶或蛋黄蛋白酶的抑制剂[21]。鸽的OVALY蛋白是否具有丝氨酸蛋白酶抑制剂生物活性尚未知晓, 作为鸽卵中含量最高的蛋白, 可能还具有不为人知的潜在功能, 需要进行大量深入的研究。

The authors have declared that no competing interests exist.

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