22份苜蓿种质萌发期耐盐性综合评价
李明雨1, 王焱1, 梁丹妮2, 姚亚妮3, 兰剑1,4,*
1.宁夏大学 农学院,宁夏 银川 750021
2.兰州大学 草地农业科技学院,甘肃 兰州 730020
3.固原市原州区农村实用技术培训中心,宁夏 固原 756000
4.宁夏大学 现代草业工程技术研究中心,宁夏 银川 750021
*通信作者,兰剑,E-mail: ndlanjian@163.com

作者简介:李明雨(1994—),男,宁夏盐池人,硕士研究生,研究方向为牧草遗传育种与栽培。E-mail: nxulmy@163.com

摘要

为确定苜蓿种质材料耐盐性鉴定的适宜浓度,筛选耐盐苜蓿种质,采用常规纸上萌发试验,研究了22份苜蓿( Medicago sativa)种质材料种子相对发芽率、相对发芽势、发芽指数、胚根干质量和胚芽干质量对不同浓度(0、0.4%、0.8%、1.2%、1.6%)NaCl胁迫的响应,并对其耐盐性强弱进行聚类分析和综合评价。结果表明:随着盐胁迫增强,22份苜蓿种质材料相对发芽率、相对发芽势、发芽指数、胚根干质量和胚芽干质量较对照均显著降低;苜蓿半致死盐浓度(S50)均值为0.85%,变异系数26.38%,1.2% NaCl为耐盐性鉴定的适宜浓度;表现稳定的耐盐苜蓿种质材料为牧王、爱菲尼特、德国德贝和金皇后,敏盐苜蓿种质材料为敖汉、A/S综合、费纳尔和润布11。研究结果可为耐盐苜蓿新品种选育提供参考。

关键词: 苜蓿; 耐盐性; 萌发期; 聚类分析
中图分类号:S551+.7;Q945.78 文献标志码:A 文章编号:1004-1524(2019)05-0746-10
Comprehensive evaluation of salt tolerance of 22 alfalfa germplasms at germination stage
LI Mingyu1, WANG Yan1, LIANG Danni2, YAO Yani3, LAN Jian1,4,*
1. School of Agriculture, Ningxia University, Yinchuan 750021, China
2. College of Pastoral Agriculture Science and Technology, Lanzhou University, Lanzhou 730020
3. Rural Practical Technology Training Center of Yuanzhou District, Guyuan 756000
4. Modern Grassland Engineering Technology Research Center, Ningxia University, Yinchuan 750021, China
Abstract

In order to screen salt-tolerance alfalfa germplasms and determine the appropriate concentration for salt-tolerance identification, the relative germination rate, relative germination energy, germination index, radicle dry weight and plumule dry weight were measured with conventional paper germination trial under different NaCl stress (0, 0.4%, 0.8%, 1.2%, 1.6%). Meanwhile, cluster analysis and comprehensive evaluation of salt-tolerance of 22 alfalfa germplasms were made. The results showed that relative germination rate, relative germination energy, germination index, radicle dry weight and plumule dry weight of alfalfa germplasms were all significantly lower than those of the control when the salt concentration increased. The semi-lethal salt concentration was 0.85% (variation coefficient was 26.38%), and 1.2% NaCl was the appropriate concentration to identify the salt tolerance of alfalfa. The salt-tolerant alfalfa germplasms were Herd King, Affinity, German Derby and Golden Empress, and the salt-sensitive alfalfa germplasms were Aohan, A/S Complex, Vernal and Ramble11. These results could provide references for the breeding of new salt-tolerant varieties.

Keyword: alfalfa; salt tolerance; seed germination stage; cluster analysis

土壤盐渍化是影响植物生长和分布、导致作物产量降低的一个重要环境因子, 目前已成为农业发展所面临的一个难题。我国盐渍土地面积约为9 913.3万 hm2, 分布广, 类型多, 且存在大量潜在盐渍化土地[1, 2]。盐胁迫会造成种子萌发推迟、种苗死亡、生长发育受阻、产量降低, 严重影响了农业生产[3]。近年来, 人口不断增长, 资源短缺和环境恶化等问题不断加重, 因此, 改良和利用盐渍土地方面的研究成为当前的热点之一[4]。目前, 筛选耐盐草种进行推广种植被认为是改良利用盐渍土的重要途径之一[5]

苜蓿(Medicago sativa)被称为牧草之王, 其高产稳定、适应性广、营养价值高、适口性好, 是优良草种的典型代表[6], 全世界种植面积已达3 330万 hm2。但目前苜蓿产业发展中存在诸多制约因素, 其中困扰苜蓿产业发展的主要问题之一是苜蓿品种的选择[7], 而在苜蓿品种选择时首先要考虑其品种的生态适应性, 因此对苜蓿种质的耐盐性进行研究和评价至关重要, 近年来国内外学者对苜蓿耐盐性的研究较多。王榕楷等[8]研究表明, 植物的耐盐性随其发育阶段变化而变化。Mccoy[9]认为, 紫花苜蓿耐盐基因的表达随生长时期的变化而变化, 因而对其耐盐性进行研究应分不同阶段。而Al-Khatib[10]的研究表明, 紫花苜蓿在萌发期和苗期对盐的敏感性较生长后期大, 因此种子萌发期是耐盐性研究的重要时期, 萌发期的耐盐状况可反映该物种的耐盐性[11]。本研究通过对不同浓度NaCl胁迫下国内外22份苜蓿种质的种子萌发状况进行研究, 旨在对其萌发期耐盐性进行鉴定, 并探讨苜蓿种质耐盐性鉴定的适宜盐浓度, 筛选出耐盐型种质, 为耐盐苜蓿新品种选育和人工草地生产奠定理论基础。

1 材料与方法
1.1 试验材料

供试的22份苜蓿种质材料来自中种草业公司和北京克劳沃草业中心, 具体信息见表1

表1 二十二份苜蓿种质信息 Table 1 Information of 22 alfalfa germplasms
1.2 试验设计

选用NaCl溶液作为培养液, 设定溶液浓度为0(CK)、0.4%、0.8%、1.2%、1.6%, 每处理重复3次, 每个重复选取大小均匀、籽粒饱满的种子50粒, 经0.1%的HgCl2消毒8 min后用蒸馏水冲洗5次, 均匀置于铺有双层滤纸的9 cm培养皿中。培养皿置于RXZ-1000B型人工气候箱, 培养条件为昼/夜温度为25 ℃/20 ℃, 光照/黑暗时间为12 h/12 h, 光照强度为5 000 lx。每天定时称量, 根据水分蒸发量补水以维持盐浓度。连续3 d未有种子发芽结束发芽试验, 计算发芽率、发芽势和发芽指数, 结束时将幼苗放入烘箱, 60 ℃烘干至恒质量后测量胚根、胚芽的干质量。

1.3 相关指标及其计算方法

发芽率(germination rate, GR)=发芽结束时正常发芽种子数/供试种子数× 100%;

发芽势(germination energy, GE)=第5天正常发芽的种子数/供试种子数× 100%;

发芽指数(germination index, GI)=􀰐Gt/Dt(Gt为第t日的发芽数, Dt为对应的发芽天数);

某一指标相对值=盐胁迫下的测定值/对照的测定值。

1.4 数据统计分析

用Excel 2007对数据进行统计和初步分析, 利用SPSS 21.0对各盐浓度下供试材料的相对发芽率、相对发芽势、发芽指数、胚根干质量和胚芽干质量进行方差分析。对各测试指标相对值和盐浓度进行一元二次曲线回归分析(回归方程RH=a+bS+cS2, 系数a、b、c因材料而异)。根据方程计算各测试指标值下降到对照的50%时各供试材料的半致死盐浓度(S50), 利用S50进行聚类分析, 探讨22份苜蓿种质材料的耐盐级别。利用模糊数学中的隶属函数法对各指标相对值进行换算, 其公式为U(Xi)=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin), i=1, 2, 3, …, n。式中:Xi表示第i个测定指标; Xmin表示第i个测定指标的最小值; Xmax表示第i个测定指标的最大值。得出每个盐浓度下每份材料各指标的隶属函数值, 再求出每一指标在不同盐浓度下隶属函数值的平均值, 利用得出的隶属函数值均值进行聚类分析[12]

2 结果与分析
2.1 盐胁迫对苜蓿种子相对发芽率和相对发芽势的影响

随着盐浓度的增加, 22份苜蓿种质的相对发芽率和相对发芽势均显著降低(P< 0.05), 盐胁迫后期相对发芽率、相对发芽势较对照依次降低28.25%~94.3%、52.43%~93.61%, 且随着胁迫程度加强, 其降低幅度就越大, 但各种质相对发芽率和相对发芽势对盐胁迫的响应并不完全一致(表2)。

表2 盐胁迫对苜蓿种子相对发芽率和相对发芽势的影响 Table 2 Effects of salt stress on seed relative germination rate (GR) and relative germination energy (GE) of alfalfa %

就相对发芽率而言, 与对照相比, MX001、MX003、MX004等14份材料在0.4%盐胁迫时就出现显著降低(P< 0.05), 其中MX003、MX017、MX018的降幅达到50%以上, 对盐胁迫比较敏感; 在0.8%盐胁迫时, MX002、MX005、MX006等7份材料的相对发芽率出现显著降低(P< 0.05); 而MX021在1.2%盐胁迫时其相对发芽率才出现显著降低(P< 0.05); 当盐浓度增至1.6%时, MX006、MX009、MX011仍保持10%以上的相对发芽率, 表现出较强的耐盐性(表2)。

就相对发芽势而言, 与对照相比, 0.4%盐胁迫下, MX003、MX007、MX008等14份材料就出现显著降低(P< 0.05), 其中MX007、MX009、MX017的相对发芽势已降低至15%以下; 当盐浓度增至0.8%时, 除MX001、MX004、MX006、MX014仍未出现显著降低外, 其余18份材料均显著降低(P< 0.05); 当盐浓度为1.6%时, 仅MX014的相对发芽势仍保持在20%以上, 显示出较强的耐盐性, MX002、MX004、MX006等12份材料中仅有少量种子萌发(表2)。

2.2 盐胁迫对苜蓿胚根干质量和胚芽干质量的影响

随着盐浓度的增加, NaCl胁迫对大部分苜蓿种质胚根、胚芽的干物质积累表现出抑制作用(表3)。

表3 盐胁迫对苜蓿胚根干质量和胚芽干质量的影响 Table 3 Effects of salt stress on radicle dry weight (RDW) and plumule dry weight (PDW) of alfalfa mg

就胚根干质量而言, 随着盐浓度的增加, 仅MX004较对照无显著变化(P> 0.05)。其余21份材料, 与对照相比, 0.4%盐胁迫下MX003、MX011、MX017、MX018表现出显著降低(P< 0.05), 而MX009和MX010显著升高(P< 0.05), 说明0.4%盐胁迫可促进其干物质积累; 盐浓度为0.8%~1.2%时, 苜蓿种质胚根干质量均出现不同程度降低, 但仍有9份材料在盐浓度为1.2%时较对照未出现显著变化, 表现出对盐胁迫较强的适应能力; 当盐浓度为1.6%时, 所有材料胚根干质量较对照均显著降低(P< 0.05)。

就胚芽干质量而言, 随着盐浓度的增加, MX010、MX021较对照无显著变化。其余20份材料, 与对照相比, 当盐浓度为0.4%时, MX002、MX004、MX005等12份材料胚芽干质量无显著差异(P< 0.05), 表明其对低浓度NaCl胁迫有一定的适应性; MX014的胚芽干质量在盐浓度上升至1.6%时才显著低于对照(P< 0.05), 表明其胚芽干质量受盐胁迫的影响仅次于MX010和MX021; 其余材料胚芽干质量随着盐浓度的上升均不同程度显著降低(P< 0.05)。

2.3 盐胁迫对苜蓿种子发芽指数的影响

表4可知, 随着盐浓度的增加, 22份苜蓿种质发芽指数的平均值较对照均显著降低(P< 0.05), 降低幅度为56.00%~95.55%。与对照相比, 当盐浓度为0.4%时, 仅MX002、MX014未出现显著变化, 其余20份材料显著降低(P< 0.05); 盐浓度增加至0.8%时, 所有材料的发芽指数较对照均显著降低(P< 0.05), 表明盐胁迫下所有材料的种子活力均受到抑制; 盐浓度为1.6%时, 所有材料的发芽指数较对照降低87.97%~99.47%(P< 0.05)。

表4 盐胁迫对苜蓿种子发芽指数的影响 Table 4 Effects of salt stress on seed germination index of alfalfa
2.4 苜蓿种质半致死浓度分析

表5可知, 22份苜蓿种质的耐盐半致死浓度(S50)均值为0.85%, 变异系数为26.38%。在各指标中, 22份材料发芽率、发芽势、发芽指数的S50均值相对较低, 分别为0.80%、0.71%和0.60%, 显示出对盐胁迫较为敏感, 其变异系数分别为31.74%、50.02%和34.36%, 胚根干质量和胚芽干质量的S50均值相对较高, 分别为1.11%和1.03%, 变异系数分别为29.25%和33.76%。总的来看, 不同耐盐指标的S50间存在较大差异, 在选择指标时应区别对待。

表5 苜蓿种子的耐盐半致死浓度 Table 5 Semi-lethal salt concentration of alfalfa seeds %

以发芽率、发芽势、发芽指数、胚根干质量和胚芽干质量的半致死浓度S50为依据进行聚类分析, 22份材料被聚为3类。结合其S50均值来看, MX002、MX006和MX009等11份材料S50的均值为1.02%, 为耐盐型种质; MX004、MX005、MX007、MX008、MX011、MX019的S50均值为0.77%, 为中度耐盐型种质; 其余5份材料S50的均值为0.57%, 为敏盐型种质。

2.5 苜蓿种质耐盐性综合评价

植物的耐盐性是植物对盐胁迫的适应, 是多种代谢的综合体现。在萌发期对植物耐盐性进行评价时, 不但要考虑盐胁迫下的种子萌发能力, 而且要考虑其发芽后幼苗的正常生长, 仅使用单一评价指标不能客观真实地反映植物的耐盐型。对表2~表4进行综合分析可知, 不同评价指标下各品种的耐盐型强弱具有较大差异。因此, 本研究以不同浓度盐胁迫下相对发芽率、相对发芽势、相对发芽指数、相对胚根干质量和相对胚芽干质量的隶属函数值的平均值为依据(表6), 对22份苜蓿种质的耐盐性进行聚类分析, 在欧式距离为15处将22份苜蓿种质分为3组(图1)。由图1和表7可知, Ⅰ 组中包括MX001、MX003、MX007、MX016和MX017, 其半致死浓度S50均值和隶属函数值均值均小于Ⅱ 和Ⅲ 组, 为敏盐型种质; Ⅱ 组中包括MX005、MX008、MX009、MX010、MX011、MX012、MX015和MX021, 其半致死浓度S50均值和隶属函数值均值均大于Ⅰ 组, 为中度耐盐型种质; Ⅲ 组中包括MX002、MX004、MX006、MX013、MX014、MX018、MX019、MX020和MX022, 其半致死浓度S50均值和隶属函数值均值均大于Ⅰ 和Ⅱ 组, 为耐盐型种质。

表6 二十二份苜蓿种质材料各指标隶属函数值 Table 6 Membership function value of each index of 22 alfalfa germplasm materials
表7 聚类后各组综合指标均值及种质耐盐类型划分 Table 7 Mean value of comprehensive index and salt-tolerance types for each groups after the clustering

图1 NaCl胁迫下22份苜蓿耐盐性聚类分析Fig.1 Cluster analysis of salt tolerance among 22 alfalfa germplasms under salt stress

2.6 苜蓿种质耐盐性鉴定适宜浓度的确定

表8可知, 随着盐浓度增加, 22份苜蓿种质各测试指标的变异系数整体呈增大趋势, 其耐盐性的差异也得以显现。盐浓度为0.4%~0.8%时, 供试材料相对发芽率、相对发芽势、相对发芽指数、相对胚根干质量和相对胚芽干质量较对照均出现显著降低(P< 0.05)(表2表3表4), 其中, 相对发芽率、相对发芽势和相对发芽指数受盐胁迫影响较为严重; 在1.2%~1.6%盐胁迫下, 22份苜蓿种质所有指标均降低, 且80%以上测试指标显著降低, 变异系数大, 受盐害严重, 但盐浓度为1.6%时各测试指标值均较小, 不能较好地区分各种质耐盐性的强弱。因此, 盐浓度为1.2%可作为苜蓿种质耐盐鉴定的适宜浓度。以盐浓度为1.2%时相对发芽率、相对发芽势、相对发芽指数、相对胚根干质量和相对胚芽干质量的隶属函数值平均值为依据(表6), 对22份苜蓿种质的耐盐性进行聚类分析, 在欧式距离为15处将22份材料分为3组(图2)。由图2和表7可知, Ⅰ 组包括MX001、MX003、MX005、MX007、MX008、MX011、MX016和MX017, 其半致死浓度S50和隶属函数值均值均小于Ⅱ 和Ⅲ 组, 为敏盐型种质; Ⅱ 组包括MX002、MX004、MX009、MX010、MX012、MX013、MX015、MX019和MX021, 其半致死浓度S50和隶属函数值均值大于Ⅱ 组, 为中度耐盐型种质; Ⅲ 组包括MX006、MX014、MX018、MX020和MX022, 其半致死浓度S50和隶属函数值均值均大于Ⅰ 和Ⅱ 组, 为耐盐型种质。

表8 盐胁迫下各指标总体变异系数 Table 8 Total coefficient variation of each index under salt stress

图2 1.2% NaCl胁迫下22份苜蓿耐盐性聚类分析Fig.2 Cluster analysis of salt tolerance among 22 alfalfa germplasms under 1.2% NaCl stress

3 结论与讨论

种子在盐胁迫下首先面临的是盐浓度导致的渗透胁迫, 从而影响种子对水分的吸收。水分在种子萌发过程中是非常关键的因素之一[13], 种子经吸涨作用从外界吸取足够的水分后, 胚细胞中储存的蛋白质和RNA活化以合成种子萌发过程中所需的各种酶和蛋白, 进而完成其整个发芽过程, 形成新的植株[14]。盐胁迫下离子的毒害作用也会抑制种子萌发过程中酶的合成和活性, 进而影响种子正常萌发和苗的正常生长[15], 因此, 盐胁迫下种子萌发受渗透作用和离子毒害双重抑制。本研究中苜蓿的相对发芽率、相对发芽势、胚根干质量、胚芽干质量和发芽指数随着盐浓度的增加均受到抑制, 且盐浓度越大抑制作用越强, 这与前人研究结果一致[16, 17, 18], 说明盐胁迫不仅影响种子萌发, 而且影响种子苗干物质积累。

植物受胁迫后表现出耐盐性是一个复杂的过程, 其耐盐能力的大小受多种代谢共同影响[19], 不同物种对盐胁迫的适应能力和机制存在差异, 同一物种或品种的耐盐性也会因生长时期不同或所选评价指标不同而异[20, 21], 因此不能仅用单一的指标来评价植物的耐盐性[22]。对22份苜蓿种质进行耐盐性综合评价的结果表明, 不同NaCl浓度下苜蓿种子萌发和苗生长状况不一致, 因此, 以不同NaCl浓度下相对发芽率、相对发芽势、相对胚根干质量、相对胚芽干质量、相对发芽指数的隶属函数值均值为依据, 通过聚类分析将22份苜蓿种质分为耐盐型种质(MX002、MX004、MX006、MX013、MX014、MX018、MX019、MX020和MX022)、中度耐盐型种质(MX005、MX008、MX009、MX010、MX011、MX012、MX015和MX021)、敏盐型种质(MX001、MX003、MX007、MX016和MX017)。对22个苜蓿种质的半致死浓度S50进行计算并以此为依据进行聚类分析。结果表明, 22份苜蓿种质的S50均值为0.85%, 变异系数为26.38%, 而且该聚类分析结果与22份苜蓿种质耐盐性综合评价结果较为一致。

进行植物种质耐盐性鉴定浓度选择时, 不仅要保证供试材料的测试指标较对照出现显著受害症状, 且测定值不能太低, 避免真实耐盐情况为试验误差所掩盖, 而且要保证NaCl胁迫下同一指标各品种间变异系数较大, 以便于区分各材料间的耐盐型差异[23]。依据此原则, 确定1.2% NaCl为苜蓿种质耐盐鉴定适宜浓度, 该浓度下苜蓿种质的相对发芽率、相对发芽势、相对发芽指数、相对胚根干质量和相对胚芽干质量与对照相比均显著降低(P< 0.05), 且材料间各指标变异系数较大(33.18%~53.54%), 这与前人在耐盐性鉴定中所选适宜盐浓度一致[23, 24, 25]。以1.2% NaCl胁迫下各指标的隶属函数值均值为依据的评价结果与以4个NaCl胁迫下各指标的隶属函数值均值为依据进行综合评价的结果也基本一致, 材料MX006、MX014、MX020和MX022在3次聚类综合分析中都表现为耐盐型种质, 材料MX001、MX003、MX016和MX017在3次聚类综合分析中都表现为敏盐型种质。

植物耐盐性是一个由多因素相互作用形成的生理生态响应过程, 同一种植物的耐盐性也会因生育时期不同而存在一定差异。本研究仅在萌发期对22份苜蓿种质的耐盐性进行了综合评价, 并筛选出了耐盐型种质牧王、爱菲尼特、德国德贝和金皇后, 敏盐型种质敖汉、A/S综合、费纳尔和润布11。但为了保证筛选出的材料准确可靠, 后期应根据初步筛选结果对筛选出的种质继续进行苗期耐盐性鉴定和盐土萌发验证, 以便更好地指导生产实践, 为苜蓿耐盐新品种选育奠定基础。

The authors have declared that no competing interests exist.

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