浙江大学选育的不同种质来源的耐热型和热敏感型甜玉米自交系各2份, 其中耐热型为16号(S40-4-2-1-2-3-2, 种质来源:温带× 热带)和51号(S76-9-2-2-2-1, 种质来源:热带); 热敏感型为56号(T5-5-1-1-1-3-1, 种质来源:温带× 亚热带)和71号(T60-1-9-2-1, 种质来源:温带)。4份材料的种子发芽率均在85%左右, 发芽势和发芽率无显著差异。

荧光定量PCR试验所用RNA提取试剂盒购自北京华越洋生物科技有限公司; 反转录试剂盒(PrimeScript^TM RT reagent Kit)购自北京TaKaRa公司; 荧光定量试剂盒(AceQ qPCR SYBR Green Master Mix)购自南京诺唯赞生物科技有限公司。

1.2.1 高温处理与取样

采用基质培养。种子播于培养盒内, 每盒30粒, 合并3盒为1个重复, 每个处理3次重复, 置于25 ℃培养箱中发芽。待玉米幼苗长到一叶一心期时, 取出处理组, 置于45 ℃培养箱中处理24 h, 再置于25 ℃、12 h光照培养箱中恢复生长12 h。于高温处理0、12、24 h, 及恢复生长6、12 h时取样进行生理生化指标测定; 于高温处理0、1、3、5、8、12、24 h, 及恢复12 h取样, 液氮速冻后保存于-80 ℃冰箱用于后续基因表达量的测定。取样时均取幼苗第一叶, 所有测量指标重复3次。

1.2.2 生理生化指标测定

叶绿素含量测定。叶绿素提取参照李得孝等^[27]的方法, 每个重复取0.2 g叶片样品, 使用丙酮: 乙醇: 水(体积比4.5: 4.5: 1.0)提取液直接在黑暗中浸提24 h, 待叶片发白取浸提液并定容至20 mL, 测定663、645 nm下的吸光度。

抗氧化酶系统活性测定。取0.2 g叶片在pH 7.8的磷酸缓冲液(PBS)中冰浴研磨成匀浆, 4 ℃, 10 000 g离心15 min, 弃沉淀, 上清液即为待测酶液。

超氧化物歧化酶(SOD)活性测定采用氮蓝四唑(NBT)光化还原法^[28]。3 mL NBT反应液中加入100 μ L待测酶液, 光照20 min(25 ℃, 4 000 lx), 以3 mL NBT反应液加上100 μ L提取缓冲液为对照。于560 nm波长下比色测定。

过氧化物酶(POD)活性测定参照赵文赛^[29]的方法并略加修改。取上清液与磷酸缓冲液、愈创木酚、过氧化氢(H₂O₂)混匀, 利用分光光度计在470 nm处测定1 min内吸光值的变化。以每min吸光值上升0.1为1个酶活性单位。

过氧化氢酶(CAT)活性测定采用过氧化氢比色法^[30]。取上清液与磷酸缓冲液、H₂O₂混匀, 用动力学方法在240 nm下测定其活性。

抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性测定采用抗坏血酸比色法^[31]。取上清液与磷酸缓冲液、抗坏血酸、H₂O₂混匀, 用动力学方法在290 nm下测定其活性。

谷胱甘肽还原酶(GR)活性测定参照Knorzer等^[32]的方法并略加修改。取上清液与GSSG、NADPH混匀, 于340 nm处测定3 min内吸光值的变化。以每min吸光值下降0.1为1个酶活性单位。

脯氨酸含量测定。采用茚三酮显色法^[33]。称取0.2 g玉米叶片, 剪碎后用5 mL 3%的磺基水杨酸加塞沸水浴提取10 min(提取过程中要不断晃动)。冷却后过滤于干净的试管中。取2 mL提取液, 于具塞试管中加入2 mL冰醋酸和2 mL酸性茚三酮试剂, 摇匀后在沸水浴中显色30 min。冷却后加入4 mL甲苯, 摇晃30 s, 静置片刻取上层液至10 mL离心管中, 3 000 r· min^-1离心5 min, 吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液, 在分光光度计上520 nm波长下比色, 以甲苯为空白对照。

1.2.3 荧光定量PCR(qRT-PCR)检测

以经过高温胁迫处理和正常生长的玉米幼苗叶片为试验材料, 提取总RNA, 反转录获得cDNA, 并以此为模板, 以ZmActin为内参基因, 用LightCycler® 96荧光定量仪进行扩增。反应总体积20 μ L, 包含100 ng cDNA(1 μ L), 7.4 μ L ddH₂O, 上、下游引物各0.8 μ L, 10 μ L SYBR^® Green Master Mix。测定ZmP5CS和ZmProDH表达水平的反应程序为:95 ℃ 3 min; 95 ℃ 10 s, 56 ℃ 15 s, 72 ℃ 15 s, 共45个循环。测定ZmHSP70和ZmHSP90表达水平的反应程序为:95 ℃ 3 min; 95 ℃ 10 s, 53 ℃ 15 s, 72 ℃ 15 s, 共45个循环。

采用Primer 5.0设计特异性引物(表1), 引物由杭州擎科梓熙生物技术公司合成。数据分析采用LightCycler^® 96 system软件和2^{-Δ Δ CT}法。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 实时定量PCR引物 Table 1 Real-time quantitative PCR primers 基因 Gene name 基因登录号 GenBank accession No. 正向引物序列(5'-3') Forward primer sequence 反向引物序列(5'-3') Reverse primer sequence P5CS NM_001153639 GCAAGTTGATAGTGCCGCTGTGTT ACTCCCTTGTCACCATTCACCACT ProDH NM_001154105 GCAACCGTGTTCTTCTCTCTC CAAGCGAGGGGAACGTAGAG HSP70 NM_001319757 TGAGGATGAGGAGCACAAG ACCGCACCAACTGACGAT HSP90 NM_001177009 GTGCGACGTGTCTTCATCAT AGCTCAGCAATCTTGGTCCT Actin NM_001155179 CGTTACCGGCTCATTG AGGGAGCACCAGACTCAT

表1 实时定量PCR引物 Table 1 Real-time quantitative PCR primers

4份甜玉米自交系幼苗经高温处理后恢复生长情况如图1所示。未经高温处理之前, 各自交系玉米幼苗处于一叶一心期, 均长势良好, 51号自交系叶片略有发黄, 可能是叶绿素含量较低, 其他自交系叶片深绿。45 ℃高温处理24 h后, 16号、51号、56号自交系叶片略微发黄, 但不明显; 71号自交系部分幼苗已经倒伏、萎蔫, 未倒伏的幼苗叶片焦黄, 下垂。恢复生长1 d后, 16号、51号自交系叶片发黄略微加重, 但仍旧正常生长; 56号自交系幼苗开始干枯倒伏, 叶片萎蔫; 71号自交系部分幼苗整株枯死, 其他幼苗叶片干枯, 下垂严重。恢复生长2 d后, 16号与51号自交系叶片转绿, 生长良好; 而56号、71号自交系基本已全部枯死。由此可见, 16号与51号自交系耐热性强, 高温处理后叶片略微发黄, 恢复正常温度后即可正常生长; 56号与71号自交系耐热性差, 高温处理后再恢复无法正常生长, 并且在恢复生长期间全部枯死; 同时, 与56号相比, 71号自交系对高温胁迫更敏感, 71号自交系在高温处理结束后便已经明显地出现生长异常, 56号自交系在恢复生长1 d后才出现异常情况。

图1

Fig.1

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图1 高温处理后甜玉米自交系幼苗的生长情况 2.2 生理生化指标 2.2.1 高温胁迫对不同抗性玉米幼苗叶绿素含量的影响Fig.1 Growth of sweet corn inbred line seedlings after high temperature treatment

由图2-A可以看出, 71号和56号自交系的叶绿素a含量在高温处理和恢复生长期间始终呈下降趋势, 变化显著, 至恢复生长12 h后下降幅度分别达到63.4%和70.4%。51号和16号自交系高温处理12 h, 叶绿素a含量略微上升, 之后至恢复生长6 h期间, 叶绿素a含量均呈下降趋势; 但是在恢复生长12 h后, 51号自交系与16号自交系的变化相比存在极大的差异, 51号自交系叶绿素a含量急剧升高, 比恢复生长6 h时的叶绿素a含量增加了129.7%, 而16号自交系叶绿素a含量仍呈略微下降的趋势, 总降幅为44.1%。

图2

Fig.2

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	图2 不同甜玉米自交系在高温胁迫和恢复生长期间叶绿素含量与脯氨酸含量的变化 不同字母表示同一自交系不同处理间在0.05水平差异显著。数据以鲜质量计。下同。Fig.2 Changes of chlorophyll content and proline content in different sweet corn inbred lines during high temperature stress and recovery stage The different letters indicated significant difference at 0.05 level between treatments. Data were detected based on fresh weight. The same as below.

叶绿素b含量的变化趋势与叶绿素a类似(图2-B)。71号自交系与56号自交系基本呈下降趋势, 总降幅分别达56.5%和62.6%。16号自交系高温处理12 h叶绿素b含量上升, 之后下降, 总降幅为31.8%。51号自交系在高温处理12、24 h时, 叶绿素b含量略微上升; 恢复生长6 h下降, 总降幅为5.93%; 但在恢复生长12 h后含量急剧上升, 与恢复生长6 h相比上升幅度达162.2%。

叶绿素a与叶绿素b的比值反映了植物对光能利用的能力。从图2-C可以看出, 71号与56号自交系的叶绿素a/b值呈下降趋势, 总降幅分别为12.4%和29.4%。16号自交系的叶绿素a/b值变化趋势与叶绿素含量的变化趋势相反, 在高温处理12 h下降, 高温处理24 h后开始上升, 但仍比未处理前略微下降。51号自交系的变化与16号自交系有所不同, 在高温处理12 h时, 叶绿素a/b值上升, 之后呈下降趋势, 这可能与51号自交系在处理前幼苗叶绿素含量较低、高温胁迫初始阶段反应相对敏感有关。

2.2.2 高温胁迫对不同抗性的玉米幼苗脯氨酸含量的影响

从图2-D可以看出, 高温胁迫处理后, 4个自交系的脯氨酸含量均有不同程度的上升。其中71号自交系在高温处理12 h后, 脯氨酸含量上升, 而高温处理24 h后, 脯氨酸含量下降, 恢复生长时期, 脯氨酸略微下降; 56号自交系在高温处理期间脯氨酸含量急剧上升, 至高温处理完成, 脯氨酸含量上升至最高点, 上升幅度达230.8%, 在恢复生长6 h, 脯氨酸含量迅速下降, 下降幅度为38.9%, 之后无显著变化; 51号自交系的脯氨酸含量在整个处理期间变化不大, 高温胁迫12 h略微下降, 高温胁迫24 h略有上升, 恢复生长期间缓慢下降; 16号自交系在高温处理期间脯氨酸含量急剧上升, 与处理前相比上升幅度为153.7%, 到恢复生长6 h迅速下降, 与高温处理24 h相比降幅为39.9%, 之后较为平稳。

2.2.3 高温胁迫对不同抗性玉米幼苗POD活性的影响

耐热性不同的4个自交系的POD活性在高温处理24 h后均呈下降趋势, 71号、56号、51号、16号下降幅度分别为59.8%、70.7%、55.8%和13.3%(图3-A)。在恢复生长期, 耐热性不同的自交系其POD活性变化有较大差异。71和56号自交系的POD活性基本趋于稳定, 无显著变化。51号和16号自交系的POD活性在恢复生长时期迅速回升, 与高温处理24 h相比, 至恢复生长12 h时POD活性分别上升了473.2%和54.2%。

图3

Fig.3

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	图3 不同甜玉米自交系在高温胁迫和恢复生长期间POD、SOD、CAT、APX和GR活性的变化 2.2.4 高温胁迫对不同抗性玉米幼苗SOD活性的影响Fig.3 Changes of POD, SOD, CAT, APX and GR activities in different sweet corn inbred lines during high temperature stress and recovery stage

SOD是生物体内唯一以自由基为底物的抗氧化酶, 因此在抗氧化酶体系中居于核心地位。抗性不同的自交系在高温胁迫下SOD活性变化有很大差异(图3-B)。71号自交系在高温处理12 h, SOD活性略微上升, 之后迅速下降, 至恢复生长6 h降至最低点, 比处理前下降了68.6%, 在恢复生长12 h略微回升。56号自交系一直呈下降趋势, 至恢复生长6 h降至最低点, 比处理前下降了71.7%, 在恢复生长12 h时也略微回升。51号自交系在高温处理12 h, SOD活性略有下降, 之后呈上升趋势, 恢复生长6 h至最高点, 之后迅速回落。16号自交系在整个处理期间SOD活性保持稳定, 且一直处于较高水平。

2.2.5 高温胁迫对不同抗性玉米幼苗CAT活性的影响

如图3-C所示, 4份甜玉米自交系的CAT活性在高温处理期间均呈下降趋势, 71号、56号、51号、16号下降幅度分别为94.6%、61.6%、70.8%和58.7%。恢复生长期间根据耐热性不同, 幼苗CAT活性也表现出明显差异。71号和56号自交系的CAT活性在恢复生长期间仍保持下降趋势; 而51号自交系自高温处理完成后CAT活性开始上升, 与高温处理24 h相比, 恢复生长12 h时上升幅度达4 260%; 16号自交系在恢复生长6 h达到最低点, 之后开始回升。

2.2.6 高温胁迫对不同抗性玉米幼苗APX活性的影响

71号和56号自交系的APX活性在高温处理及恢复生长期间一直呈下降趋势, 至恢复生长12 h, 降幅分别为90.4%和85.8%(图3-D)。51号自交系的APX活性在高温处理12 h下降到最低, 之后开始升高。16号自交系的APX活性在高温处理及恢复生长期间一直呈上升趋势, 与处理前相比, 至恢复生长12 h, 上升幅度为63.8%。

2.2.7 高温胁迫对不同抗性玉米幼苗GR活性的影响

在整个高温处理和恢复生长期间, 71号、56号和51号自交系均呈现先上升后下降的趋势, 而16号自交系呈现缓慢上升的趋势(图3-E)。热敏感型自交系71号和56号的GR活性在高温处理12 h达最高, 随后急剧下降, 与高温处理12 h相比, 恢复生长12 h时降幅分别为55.7%和72.4%。耐热型自交系51号的GR活性在高温处理24 h后达最高, 恢复生长期间逐步下降, 降幅仅为14.1%。

2.3.1 脯氨酸合成和降解相关基因

已有研究表明, Δ ¹-吡咯啉-5-羧酸合成酶(Δ ¹-pyrroline-5-carboxylate synthetase, P5CS)是谷氨酸途径合成脯氨酸的关键酶, 而脯氨酸脱氢酶(proline dehydrogenase, ProDH)是脯氨酸降解的主要限速酶^{[34, 35, 36]}。如图4所示, 耐热性不同的玉米自交系脯氨酸合成和降解相关基因的表达存在明显差异。耐热性强的51号自交系在高温处理6 h后ZmP5CS的表达量迅速上升, 至12 h表达量达最高, 显著高于处理前的水平, 之后开始迅速回落, 恢复生长12 h后略高于处理前的水平; 而热敏感型自交系71号在高温处理12 h期间ZmP5CS的表达量呈现先缓慢上升后下降的趋势, 至24 h表达量达到峰值, 恢复生长12 h后表达量低于处理前的水平。ZmProDH的表达量在两个自交系中的表现大体一致, 51号和71号自交系在高温处理后骤然上升, 均在高温处理6 h后达到峰值, 显著高于处理前的表达水平, 上升幅度分别为192.0%和210.6%, 随后开始显著下降, 至高温处理24 h时, 71号的表达量与处理前相比无显著差异; 2个自交系在恢复生长12 h后的表达量均保持在较低水平, 并显著低于处理前水平。综合看来, 与热敏感型自交系相比, 耐热性强的自交系在高温胁迫期间, 脯氨酸合成酶基因的表达水平更高, 降解酶基因的表达水平较低。

图4

Fig.4

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	图4 高温胁迫下不同甜玉米自交系相关基因的表达 2.3.2 热激蛋白相关基因Fig.4 Expression of related genes in different sweet corn inbred lines under high temperature stress

研究发现, 热激蛋白在高温、干旱、过氧化、重金属等逆境下能大量表达^[26]。如图4所示, 抗性不同的甜玉米自交系, 其热激蛋白表达水平在高温胁迫期间表现出明显差异。经高温处理后, 耐热型51号自交系ZmHSP70和ZmHSP90大量表达并分别于12 h和3 h达到峰值, 且显著高于处理前水平。而热敏感型71号自交系ZmHSP70的表达与处理前相比虽有显著升高, 但与51号自交系相比, 仍维持在较低水平; ZmHSP90在高温处理5 h内上升幅度较大, 在高温处理1 h时即达到峰值, 但高温处理3 h后的表达量均低于51号自交系。这与Scafaro等^[37]在水稻上的研究结果一致。

目前, 关于玉米自交系苗期耐热性鉴定尚未形成较为一致的方法, 本试验在综合前人研究的基础上, 结合南方甜玉米夏播制繁种的实际情况和试验前期田间和室内预处理结果, 为了增强试验的胁迫压力, 采用45 ℃、24 h室内较高温度强化处理进行苗期耐热鉴定, 以便选取苗期耐热性更好的甜玉米自交系。通过本次试验可以发现, 耐热型自交系16号、51号幼苗在经过高温处理后仅表现出叶片略微发黄, 叶片的形态并未发生显著性变化, 恢复生长后, 叶片会恢复深绿; 而耐热性最差的71号自交系在高温处理期间叶片即发生萎蔫、干枯、下垂, 部分幼苗已经死亡, 至恢复生长后全部枯死; 从形态上看, 56号自交系的耐热性比71号略好, 高温处理结束后仅有个别幼苗形态发生改变, 但在恢复生长期间也全部枯死。

光合作用是植物最重要的生理反应之一, 极易受到高温影响。本次试验表明, 51号自交系的叶绿体耐热性强, 经高温胁迫后的恢复能力也较强。16号自交系在高温处理和恢复生长期间叶绿素含量整体呈下降趋势, 下降幅度显著小于56号和71号, 但恢复生长后叶绿素含量的继续下降可能与种子贮存的养分相对较少、后期供应不足有关。因此, 叶绿素含量的变化与植物的耐热性存在一定相关性, 这与前人的研究结果相一致^[6]。总体来看, 高温胁迫会加速叶绿素的分解, 导致叶绿素含量的大幅下降。然而也有研究表明, 高温胁迫导致叶绿素含量下降的同时叶片也在不断蒸腾失水, 从而导致叶绿素相对含量增加^[38]。

叶绿素a/b的值反映了植物对光能利用的程度, 比值越大说明对光能的利用能力越强, 这种现象在番茄和甘蔗的耐热性品种中均能观察到 [9, 39-40]。也有研究认为, 叶绿素a/b代表类囊体的垛叠程度, 比值越高, 耐热性越强^[41]。本试验中, 热敏感型56号和71号自交系的光合能力受到极大破坏。16号自交系在高温处理期间叶绿素a/b值缓慢下降, 恢复生长12 h后由于叶绿素b含量较叶绿素a下降更多, 其比值回升至处理前水平。51号自交系叶绿素a/b的值总体呈下降趋势, 说明其对光能的利用能力在下降, 但其通过提高叶绿素a、b的含量增加了对光能的利用。

植物体内游离脯氨酸含量在一定程度上可以表示植物对逆境的抵抗能力。本试验中, 71号自交系在高温处理期间脯氨酸含量仅略微上升, 之后缓慢下降, 说明其耐热性最差。热胁迫期间脯氨酸的大量积累可能是56号自交系的耐热性优于71号自交系的原因之一, 这与2个自交系在高温处理结束后存在较大差异相一致。16号自交系在高温胁迫期间脯氨酸含量的变化趋势与56号自交系类似, 说明脯氨酸是应对高温胁迫的渗透调节物质之一。但16号自交系在恢复生长期间脯氨酸含量下降的原因可能是多余的游离脯氨酸无需再维持渗透势, 转而参与植物的代谢过程; 而56号自交系在恢复生长期间逐渐枯死从而导致脯氨酸含量的下降。51号自交系脯氨酸含量一直维持在较低水平, 变化幅度小, 说明脯氨酸的渗透调节可能不是51号自交系应对高温胁迫的主要调节途径, 这也符合某些学者的论点, 即高温胁迫可以诱导游离脯氨酸的积累, 但其含量的高低与耐热性强弱没有表现出对应的关系^{[18, 42]}。

此外, 本次试验还发现, 脯氨酸合成途径的关键基因ZmP5CS的表达受高温诱导, 在高温处理期间其表达量有所上升, 这与前人研究的P5CS基因受脱落酸、干旱和盐胁迫诱导, 不受高温或低温所诱导这一结论不相符^[43]。同时, 耐热性不同的自交系ZmP5CS和ZmProDH在高温胁迫期间的表达趋势与自交系幼苗内脯氨酸含量的变化趋势并不一致, 可能是脯氨酸合成的谷氨酸途径中P5CS虽为限速酶, 但高温还会对该途径涉及的中间代谢物和其他酶类产生较大影响。最近研究结果也表明, P5CS和谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase, GDH)才是逆境胁迫下植物体内脯氨酸合成的关键酶^{[34, 35, 36]}。此外, 干旱和低温均能活化脯氨酸合成的2条途径, 且干旱胁迫下脯氨酸的积累更依赖于鸟氨酸途径^{[36, 44]}。因此, 高温胁迫对鸟氨酸途径造成的影响或许也会导致这一现象发生。

抗氧化酶系统被认为是植物遭受环境胁迫时重要的防御体系。本试验发现, 耐热性弱的自交系经高温处理后SOD活性下降, 而耐热性强的自交系其SOD对高温胁迫的响应较强, 这也与前人的研究结果“ SOD活性的升高通常与植物对环境下胁迫的耐受性有关” 一致^[45], 由此推测, SOD较高的稳定性和活性水平是其抵御高温胁迫的主要途径之一。同样, POD、CAT、APX和GR在高温下也能增强植物的耐热性, 并且在耐热型自交系中其热稳定性和恢复能力更强。

真核细胞中, 热激蛋白HSP90是真核生物所必需的, 其含量丰富, 约占总蛋白的1%~2%, 且在热胁迫下, HSP90含量可增加到总蛋白的4%~6%^[46]。HSP70基因家族可以分为4个亚家族, 分别定位于胞质、内质网、质体和线粒体, 其中, 胞质HSP70已被证明参与植物耐热性的建成^[47]。本试验通过对比耐热性不同的自交系发现, 耐热性强的自交系热激蛋白基因的表达水平更高, 同时高温胁迫下热激蛋白基因的高表达能提高植物的耐热性。