选取24只10月龄, 雌性, 平均体质量(24.25± 2.47)kg的努比亚黑山羊, 试验在四川农业大学动物营养研究所实验基地进行, 整个试验期试羊单笼饲养, 每日饲料(干物质)按体质量3.5%供给, 自由饮水。参照我国《肉羊饲养标准》(NY/T 816— 2004), 以每天每头增重0.1 kg为标准配制日粮, 日粮配方和营养水平详见表1。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 日粮组成及营养水平(干物质基础) Table 1 The composition and nutrient level of the diet (dry matter basis) % 原料 Ingredients 含量 Content Ⅰ 期 Period Ⅰ Ⅱ 期 Period Ⅱ 苜蓿草粉 Alfalfa meal 20.00 20.00 羊草 Leymus chinensis 35. 00 35. 00 玉米 Corn 38.47 39.15 豆粕 Soybean meal 4.50 4.50 预混料 Premix1) 0.45 0.45 食盐 NaCl 0.45 0.45 小苏打 Baking soda 0.45 0.45 碳酸钙 CaCo3 0.08 0 磷酸氢钙CaHPO4 0.60 0 合计 Total 100.00 100.00 营养水平 Nutrition levels2) 代谢能 9.33 9.46 Metabolic energy/(MJ· kg-1) 粗蛋白 Crude protein 9.71 9.79 酸性洗涤剂纤维 24.07 24.07 Acid detergent fiber 中性洗涤剂纤维 36.11 36.20 Neutral detergent fiber 钙 Calcium 0.52 0.35 总磷 Total phosphorus 0.33 0.22 钙磷比 Ca/P 1.58 1.59 1) 预混料是由同一类的多种添加剂或不同类的多种添加剂按一定配比制作而成的匀质混和物, 预混料为每kg日粮提供:Fe(FeSO4)30 mg, Cu(CuSO4)10 mg, Zn(ZnSO4)50 mg, Mn(MnSO4)60 mg, VA 2 937 IU, VD 343 IU, VE 30 IU; 2) 营养水平是指日粮中营养成分的含量, 代谢能为计算值, 其余为实测值。 1) Premix was a homogeneous mixture made from a variety of additives of the same class or a variety of additives of different kinds according to a certain proportion, premix provided the following per kg of the diet: Fe(FeSO4)30 mg, Cu(CuSO4)10 mg, Zn(ZnSO4)50 mg, Mn(MnSO4)60 mg, VA 2 937 IU, VD 343 IU, VE 30 IU; 2) Nutrient level referred to the content of nutrients in the diet, metabolic energy was a calculated value and others were measured values.

表1 日粮组成及营养水平(干物质基础) Table 1 The composition and nutrient level of the diet (dry matter basis) %

整个试验由2期(Ⅰ 期和Ⅱ 期)构成, 每期包括14 d预饲期和6 d代谢试验期, 共40 d。代谢试验期内, 每天记录每只山羊的饲料供给量和残留量, 并采集当天饲喂的饲料及剩料样品, 于-20 ℃保存备用。采用全收粪法收集代谢试验期内山羊粪便, 取粪总量的10%, 用10%盐酸固氮后于-20 ℃贮存备用。Ⅰ 期和Ⅱ 期分别饲喂对应日粮, 试验第41天晨饲前, 屠宰所有山羊, 迅速分割出空肠并进行结扎, 以防止相邻肠断的内容物流入空肠。无菌采集空肠内容物样品于冻存管中, -80 ℃保存备用。

根据山羊饲料采食量, 饲料和粪便样品中的磷含量等数据, 计算出24个山羊个体有机磷的真消化率:

磷真消化率(%)=[(Ⅱ 期食入磷-Ⅰ 期食入磷)-(Ⅱ 期排泄磷-Ⅰ 期排泄磷)]÷ (Ⅱ 期食入磷-Ⅰ 期食入磷)× 100%^[18]。

统计24只山羊对饲料磷真消化率的平均值及标准差, 将磷真消化率大于(群体平均值+0.5倍标准差)的山羊作为高磷真消化率组(high true digestibility of phosphorus, HP), 磷真消化率小于(群体平均值-0.5倍标准差)的山羊作为低磷真消化率组(low true digestibility of phosphorus, LP)。

提取HP组和LP组空肠内容物微生物总DNA, DNA的提取和纯化参照文献[19]方法进行^[19]。用细菌通用引物对:515F(5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3')和806R(5'-GGACTACVSGGGTATCTAAT-3'), 以空肠内容物菌群总DNA为模板, 针对细菌16S rRNA基因的V4区用PCR仪进行扩增。PCR反应体系为:5 U· μ L^-1Taq酶0.25 μ L, 10× Buffer 5.0 μ L, 10 mmol· L^-1 dNTPs 1.0 μ L, 10 μ mol· L^-1引物各1.25 μ L, 50 ng· μ L^-1 DNA模板1.0 μ L, 补ddH₂O至50 μ L。扩增反应条件为:95 ℃ 2 min; 95 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 循环30次; 72 ℃ 5 min。PCR产物用含溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶电泳鉴定并用PCR纯化试剂盒纯化和回收。回收的PCR产物用QuantiFluor^TM-ST fluorometer定量, 送北京诺禾致源生物技术有限公司构建文库, 利用Illumina MiSeq测序平台进行高通量测序。

测序平台得到的原始数据经过质控、拼接、Tags过滤和去除剔除嵌合体^{[20, 21, 22, 23]}后, 使用Uclust^[24]聚类算法将序列聚类为OTU(operational taxonomic units), 并使用RDF分类器^[25]对OTU代表序列从门到属进行物种注释。基于OTU table和rep_set. tree文件及抽样的最大深度, 绘制OTU稀释曲线并计算α 多样性指数。结合各个样品的OTU种类及其丰度进行计算, 获得样品间Unweighted unifrac距离矩阵, 并利用加权组平均法(UPGMA)进行聚类分析, 然后绘制PCoA聚类图^{[26, 27]}。根据门和属水平上物种的结构和组成, 用OriginPro 9.0和R x64 3.0.2软件绘制优势菌门柱形图和共享属聚类热图。基于16s rRNA扩增子测序结果, 用PICRUSt(phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states), 通过比对KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes, http://www.genome.jpkegg)数据库, 对空肠微生物的基因进行功能预测, 并挑选主要功能通路进行组间差异性分析^{[28, 29]}。

采用SPSS 18.0统计软件, 对LP组和HP组之间细菌的相对丰度进行非参数检验, 将P< 0.05视为差异显著, P< 0.01为差异极显著。对组间差异显著的微生物, 用其相对丰度与宿主对饲料磷的真消化率进行相关性(Spearman)分析。

如图1所示, 24只山羊对日粮有机磷真消化率的平均值为(78.61± 7.65)%, 变异系数为9.73%。HP和LP组各挑选6只山羊, 饲料有机磷的真消化率平均值分别为(89.20± 0.01)%和(68.95± 0.05)%, HP组山羊饲料有机磷真消化率极显著高于LP组(P< 0.01)。

图1

Fig.1

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图1 磷真消化率 2.2 空肠内容物16S rRNA基因的高通量测序和OUT统计Fig.1 True digestibility of phosphorus

对12个样本进行测序, 共获得900 688条有效序列。基于相似性大于97%的原则, 将获得的有效序列进行聚类, 共获得5 611个OTU。其中HP组有3 830个OTU, 平均每个样品含(2 313± 179)个OTU; LP组有3 977个OTU, 平均每个样品含(2 085± 271)个OTU; 两组间共享的OTU有2 196个(图2)。

图2

Fig.2

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	图2 OTU维恩图Fig.2 OTU venn diagram

各样品稀释曲线如图3所示。在本试验的测序深度下, 各条曲线最终均趋于平缓, 说明试验的测序量足以覆盖各样品的绝大多数微生物。

图3

Fig.3

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图3 各样品的稀释曲线 2.3 山羊空肠微生物的α 多样性分析Fig.3 Rarefaction curves of each sample

α 多样性指数主要用于评价样品中微生物的丰富性和均匀性。表2列出了HP组和LP组样品的Shannon、Chao1、Goods coverage和PD_whole_tree指数。在同一测序深度下, HP组的α 多样性指数均大于LP组, 但仅Chao1指数在组间具有显著差异(P< 0.05)。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 组间α 多样性指数的差异性比较 Table 2 Comparison of α diversity index between the two groups 组别Group Shannon Chao1 Goods coverage PD_whole_tree HP 7.38± 0.85 2170.24± 202.84 0.99± 0.01 107.26± 7.30 LP 6.60± 1.52 1779.45± 304.72 0.99± 0.01 93.31± 15.13 P值P value 0.302 0.026 0.161 0.07

表2 组间α 多样性指数的差异性比较 Table 2 Comparison of α diversity index between the two groups

将所得有效序列在不同分类水平上进行物种注释和统计, 将相对丰度大于0.1%的微生物视为优势菌群。HP和LP组均有8个优势菌门, 2个组相对丰度排名前10的门均依次分别为厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)、黏胶球形菌门(Lentisphaerae)、螺旋体门(Spirochaetes)、软壁菌门(Tenericutes)、放线菌门(Actinobacteria)、螺旋体菌门(Saccharibacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)和绿弯菌门(Chloroflexi)(图4)。厚壁菌门(Firmicutes)在HP和LP组的相对丰度分别达到了59.75%和70.69%, 处于绝对优势地位。对HP和LP组的优势菌门进行组间差异分析(表3), HP组厚壁菌门(Firmicutes)的相对丰度极显著低于LP组(P< 0.01), 拟杆菌门(Bacteroidetes)极显著高于LP组(P< 0.01)。

图4

Fig.4

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	图4 门水平上的菌群组成Fig.4 Composition of microorganism at phylum level

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 HP和LP组在门和属水平上差异的菌群及其与磷真消化率的相关性 Table 3 The difference between HP and LP groups at the level of portal and genera and their correlation with true phosphorus digestibility 分类单元 Taxa 相关丰度 Relative abundance 相关系数r Correlation coefficient HP LP P值 P value 门Phylum 厚壁菌门 Firmicutes 59.753± 4.767 70.692± 6.327 0.007 -0.813* * 拟杆菌门 Bacteroidetes 10.032± 2.916 5.704± 1.431 0.008 0.718* * 属Genus Prevotella 5.341± 2.663 1.922± 0.911 0.014 0.686* Rikenellaceae_RC9_gut_group 2.640± 0.296 1.580± 0.250 0.001 0.401 Fibrobacter 0.825± 0.260 0.376± 0.173 0.017 0.623* Desulfovibrio 0.134± 0.019 0.358± 0.032 0.003 0.845* * Victivallis 3.555± 2.333 0.724± 0.199 0.004 0.695* Ruminococcus_2 3.393± 0.276 2.468± 0.431 0.006 0.843* * Clostridium_sensu_stricto_1 0.851± 0.119 5.083± 0.559 0.002 -0.995* * * * 表示极显著相关(P< 0.01), * 表示显著相关(P< 0.05)。 * * Represented extremely significant correlation(P< 0.01), * Represented significant correlation(P< 0.05).

表3 HP和LP组在门和属水平上差异的菌群及其与磷真消化率的相关性 Table 3 The difference between HP and LP groups at the level of portal and genera and their correlation with true phosphorus digestibility

在属水平上, 2个组相对丰度大于0.1%的微生物属共有47个(图5)。对HP和LP组的优势菌属进行组间差异性分析, 其中有显著性差异的菌属如表3所示, HP组Prevotella、Rikenellaceae_RC9_gut_group、Fibrobacter、Ruminococcus_2和Clostridium_sensu_stricto_1的相对丰度显著高于LP组(P< 0.05), 而Desulfovibrio和Victivallis的相对丰度显著低于LP组(P< 0.05)。

图5

Fig.5

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	图5 共享菌群在属水平上的聚类热图Fig.5 Log-scaled percentage heatmap of bacteria community structure at the shared-genus level

如表3所示, 在门水平, 宿主的磷真消化率与拟杆菌门(Bacteroidetes)的相对丰度极显著正相关(P< 0.01), 与厚壁菌门(Firmicutes)的相对丰度极显著负相关(P< 0.01)。在属水平, 山羊磷真消化率与Prevotella、Fibrobacter和Victivallis的相对丰度显著正相关(P< 0.05), 与Desulfovibrio和Ruminococcus_2的相对丰度极显著正相关(P< 0.01), 与Clostridium_sensu_stricto_1的相对丰度极显著负相关(P< 0.01)。

基于本试验16s rRNA扩增子的测序结果, 用PICRUSt对空肠微生物的基因进行功能预测, 2个组共预测到了35个功能基因。图6展示了相对丰度处于前20位的功能基因, 这20种功能基因分别占HP组和LP组总基因丰度的93.49%和94.08%。图6由下到上基因的相对丰度逐步降低, 相对丰度最高的基因其功能依次为膜转运、碳水化合物代谢、氨基酸代谢、能量代谢、辅助因子和维生素代谢、脂质代谢等。这20种功能基因, 其相对丰度在组间的差异均不显著(P> 0.05)。